褪黑素联合盐酸米诺环素对牙周致病菌混合生物膜的抑制作用.pdf
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1、论 著文章编号(23)5-0507-07基金项目 天津市卫健委科研项目(Z C 2 0 1 1 8);天津市卫健委科技项目(T J W J 2 0 2 3 M S 0 0 8)作者简介 杨雨晴(1 9 9 7-),女,硕士在读,研究方向:牙体牙髓病和牙周病的治疗;通信作者:刘颖,E-m a il:y in g liu 0 4 tm u.e d u.c n。褪黑素联合盐酸米诺环素对牙周致病菌混合生物膜的抑制作用杨雨晴1,叶静2,刘青1,阙克华1,张溪1,刘颖1(1.天津医科大学口腔医院牙体牙髓科,天津300070;2.天津市天津医院口腔科,天津300211)摘要 目的:探究褪黑素与盐酸米诺环素联
2、合使用对牙周致病菌混合生物膜的抑制作用,探索牙周抗菌斑药物治疗的新方法。方法:通过微量液体稀释法分别测定褪黑素和盐酸米诺环素对牙周主要致病菌,戈登链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),应用微量棋盘稀释法检测药物联合应用对各致病菌的抑菌浓度分数指数(FICI),采用结晶紫染色法评估药物联合应用对单菌及混合菌生物膜的影响。应用激光共聚焦扫描显微镜评估药物联合应用对混合菌生物膜的抑制及离散作用。结果:褪黑素对戈登链球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌均具有显著抑制作用,其MIC值均为1%,MBC值均为2%;对上述混合菌的MIC
3、值为2%,MBC值为4%。褪黑素联合盐酸米诺环素对牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌生长的抑制表现为协同作用,对戈登链球菌、具核梭杆菌和混合菌悬液均表现为相加作用。与对照组相比,褪黑素与盐酸米诺环素联合应用可显著提高对牙周各致病菌和混合菌种生物膜的抑制和离散效果,其中实验组浓度为1%+1/2MIC时,对单菌种和混合多菌种生物膜的抑制作用提高最显著(P0.05),当药物浓度为1%+MIC时,对生物膜的离散作用增长最显著(P0.05),其抑制和清除效果均高于单独应用浓度为2MIC的盐酸米诺环素。结论:褪黑素联合盐酸米诺环素可显著提高对牙周致病菌斑生物膜的抑制能力,有望在牙周炎的辅助治疗中发挥作用。关键
4、词褪黑素;盐酸米诺环素;牙周炎;致病菌;生物膜中图分类号R781.4文献标志码Inhibition effect of melatonin combined with minocycline hydrochloride against mixed biofilms ofperiodontal pathogensYANG Yu-qing1,YE Jing2,LIU Qing1,QUE Ke-hua1,ZHANG Xi1,LIU Ying1(1.DepartmentofEndodontics,HospitalofStomatology,TianjinMedicalUniversity,Tianji
5、n300070,China;2.DepartmentofStomatology,Tianjin Hospital,Tianjin City,Tianjin 300211,China)AbstractObjective:To explore the inhibitory effect of melatonin combined with minocycline hydrochloride on mixed biofilm ofperiodontal pathogens,and to explore new methods for drug treatment of periodontal ant
6、imicrobial spots.Methods:The minimal inhibitoryconcentration(MIC),minimum bactericidal concentration(MBC)of melatonin and minocycline hydrochloride against the main periodontalpathogens.Streptococcus gordon,Fusobacterium nucleatum,Porphyromonas gingivalis,and Actinobacillus actinomycetes were measur
7、edby microliquid dilution method,and the bacteriostatic concentration index(FICI)of the combination of drugs on the main periodontalpathogens was detected by microcheckerboard dilution method.The effect of drug combination on biofilm of single and mixed strains wasevaluated by crystal violet stainin
8、g.The inhibition and discrete effects of combined drugs on mixed bacterial biofilms was assessed byconfocal laser scanning microscopy.Results:The MIC values of melatonin to Streptococcus gordonii,Fusobacterium nucleatum,Porphyromonas gingivalis and Actinobacillus actinomycetemcomitans were all 1%,MB
9、C values were 2%,MIC values of the above mixedbacteria were 2%,MBC values were 4%.Melatonin combined with minocycline hydrochloride showed a synergistic effect on the growthinhibition of Porphyromonas gingivalis and Actinobacillus actinomycetes,and an additive effect on Streptococcus gordonii,Fusoba
10、cteriumnucleatum and mixed bacteria suspension.Compared with the control group,the combination of melatonin and minocycline hydrochloridecould significantly improve the inhibition and discrete effect of various periodontal pathogens and mixed bacteria.When the experimentalgroupwas1%+1/2MIC,theinhibi
11、tionofsinglespeciesandmixedmultispeciesbiofilmsincreasedmostsignificantly(P0.05).When the drugconcentration was 1%+MIC,the discrete effect of the biofilm increased significantly(P0.05),and the inhibition and clearance effect werehigher than that of minocycline hydrochloride with a pure concentration
12、 of 2MIC.Conclusion:Melatonin combined with minocyclinehydrochloride can significantly improve the inhibition ability of periodontal plaque biofilm,which is expected to play a role in the adjuvanttreatment of periodontitis.Key wordsmelatonin;minocycline hydrochloride;periodontitis;pathogenic bacteri
13、a;biofilm天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷5期23年9月 29熏 5Sep.23507牙周炎是由于牙菌斑中的细菌侵犯牙周组 织而引起的慢性炎症性疾病。临床中治疗牙周炎的关键是控制菌斑,常规治疗方法包括机械治疗和手术治疗。但是,由于口腔解剖结构的复杂性,牙周袋底、根分叉等区域器械难以到达,而菌斑微生物无法被彻底清除可导致牙周治疗失败1。因而,临床中会辅以药物治疗以提高菌斑生物膜的控制效果2。目前,临床上常用于牙周炎辅助治疗的药物有甲硝唑、阿莫西林、四环素等抗生素类药物,其中盐酸米诺环素(minocycline hydroc
14、hloride,MINO)是治疗牙周炎最常用的抗生素之一,对 多种牙周病原体具有显著抑制作用,同时能抑制胶原酶和基质金属蛋白酶的活性,减少对 牙周结缔组织和骨组 织的破坏,有利于缓解牙周炎症3。但药物导致的细菌耐药问题仍无法避免,且单一用药仍不能获得理想的治疗效果4,需要探索更安全、高效的药物辅助治疗方案。褪黑素(melatonin,MEL)是一种由色氨酸分子衍生的内源性物质,不仅具有抗炎、抗氧化等生理功能,而且研究发现其与环丙沙星、多黏菌素等药物联合应用时,具有提高药物疗效、降低最小抑菌浓度和降低药物毒性的能力5。近年来,褪黑素在口腔领域的研究也取得一定的进展,研究表明,褪黑素对 浮游状态下
15、的牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌具有明显抑制作用;还具有控制牙周组 织的炎症,抑制局部牙槽骨吸收,促进牙周愈合的潜能6-7。然而,褪黑素与菌斑抑制药物联合应用对 牙周炎的辅助治疗作用尚未见国内外文献报道。因此,本研究旨在探究褪黑素与盐酸米诺环素联合应用对 牙周致病菌及其混合生物膜的抑制作用,为临床治疗牙周炎提供新思路。1材料与方法1.1材料1.1.1实验菌株戈登链球菌(Streptococcus gordonii,S.g,ATCC10558)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g,ATCC33277)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatu
16、m,F.n,ATCC25586),伴放线聚集杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,A.a,ATCC 43717)为天津医科大学口腔医学院实验室储存。1.1.2主要试剂和仪器褪黑素(上海生工生物工程股份有限公司)、盐酸米诺环素(上海源叶生物科技有限公司)、脑心浸出液培养基(BHI奥博星生物技术有限责任公司)、电热恒温培养箱(上海跃进HDPN-II-256型)、高速离心机(美国Sigma)、酶标仪(美国ThermoFisherScientific),紫外分光光度计(美国BECKMAN),Axio-Imager_LSM-800型激光共聚焦显微镜(CLSM德国
17、卡尔蔡司公司)。1.2方法1.2.1药物配制用无菌去离子水将盐酸米诺环素配置成浓度为1 mg/mL的母液。将80 mg褪黑素溶解于1 mL二甲基亚砜(DMSO)中配置成8%的母液,溶剂DMSO的终浓度为0.1%。上述溶液均经0.22 m滤网过滤消毒后储存于4备用。1.2.2实验菌种的复苏与培养将S.g、F.n、P.g、A.a复苏后接种于BHI固体培养基进行培养,F.n、P.g、A.a置于厌氧(80%N2,20%CO2)环境、S.g置于微需氧(5%O2、85%N2、10%CO2)环境下37培养,观察菌落形态并确认为纯培养后,挑单菌落于BHI液体培养基中继续静置培养至对 数生长期,3 000 r/
18、min,5 min离心后重悬菌液,配制成1107CFU/mL菌悬液保存备用。1.2.3牙本质片的制备本研究经天津医科大学口腔医院医学伦理委员会批准(批准号:TMUhMEC20221107)。纳入标准:离体牙发育完全,牙体完整,无裂纹,无龋坏,无充填物。将存于0.1%麝香草酚中的离体磨牙制备成3 mm3 mm1 mm(长宽高)的牙本质片,使用砂纸打磨抛光,共制备50片。随后将其置于17%EDTA溶液中1 min,超声荡洗10 min。高温高压灭菌30 min后,随机抽取2片置于BHI液体培养基中,37微需氧条件下静置培养24 h,以检测牙本质片表面灭菌效果。在确定无残余活细菌后,将牙本质片浸泡于
19、无菌生理盐水中,4冰箱保存备用。1.2.4细菌间相互作用及混合菌悬液的制备使用平板对 峙法确定4种细菌间是否具有相互作用,如无互相抑制作用则可将上述各菌液按照1111的比例混合,建立多菌种混合菌悬液模型,同样调整接种混合菌悬液浓度约为1107CFU/mL。1.2.5测定盐酸米诺环素和褪黑素的MIC和MBC测定褪黑素的MIC采用液体二倍稀释法,阴性对 照 组为含5%DMSO的菌悬液和不含药物的菌悬液,每个浓度设3个复孔,培养条件同1.2.2。按照 同样方法将盐酸米诺环素溶液稀释,阴性对 照 组 为不含药物的菌悬液,每个浓度设3个平行孔。若肉眼观察孔内无细菌生长则对 应的浓度即为MIC值。采用菌落
20、计数法测定各菌MBC值:从所有大于或等于MIC的实验组 内取20 L菌液分别涂布于BHI固体血平板上,S.g于37下微需氧环境培养24 h,其余细菌均于厌氧37培养48 h后分别进行菌落计数,肉眼观察培养基中无菌落生长的最低药物浓度即为MBC值。实验于不同时间重复3次。第29卷天津医科大学学报5081.2.6褪黑素联合盐酸米诺环素抑菌浓度分数指数(FICI)的测定 采用微量棋盘稀释法,在无菌96孔板中盐酸米诺环素从横排加入,褪黑素从纵排加入。盐酸米诺环素和褪黑素的终浓度均为2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、1/64MIC,盐酸米诺环素和
21、褪黑素照 浓度由高到低分别加入药液和菌悬液各100 L,阴性对 照 组 每孔均加入BHI液体培养基和菌悬液各100 L,培养条件同1.2.2。实验于不同时间重复3次。根据96孔板中联合药敏抑菌情况与单独药敏抑菌情况计算FICI,计算公式如下:FICI=甲药联合时MIC/甲药单独时MIC+乙药联合时MIC/乙药单独时MIC。当FICI0.5时联合药敏表现为协同作用,0.5FICI1时为相加作用,12时为拮抗作用。1.2.7两药联合对 牙周主要致病菌单菌种和混合生物膜形成的作用在96孔板中,每孔先加入100LS.g、F.n、P.g、A.a和混合菌悬液,后实验组 分别加入100 L药液(终浓度为1%
22、的褪黑素联合2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的盐酸米诺环素溶液),阳性对 照 组 为单独盐酸米诺环素(终浓度为2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC),阴性对 照 组 分为两组,不含药物的BHI液体培养基和含5%DMSO的溶液,每组3个复孔,于相应培养环境下静置培养48 h。48 h后移除培养基及悬浮细菌,PBS冲洗,然后往孔板内加入戊二醛固定15 min,吸出干燥后每孔加200 L结晶紫溶液,染色20 min,去离子水冲洗,37恒温箱中烘干15 min,每孔加200 L 95%乙醇溶液,静置5 min,酶标仪检测菌悬液在600 nm处的OD值。生
23、物膜抑制率=(阴性对 照 组OD600-实验组OD600)/阴性对 照 组OD600100%8。1.2.8两药联合对 牙周主要致病菌单菌种和混合生物膜的离散作用96孔板内建立48 h单菌种和多菌种生物膜,48 h后移除培养基及悬浮细菌,PBS冲洗。实验组 分别加入100 L的药液(终浓度为1%的褪黑素联合2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的盐酸米诺环素溶液),阳性对 照 组 为单独盐酸米诺环素(终浓度为2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC),阴性对 照 组 分为两组,不含药物的BHI液体培养基和含5%DMSO的溶液,每组3个复孔,继续培养48 h,
24、结晶紫染色法检测各组生物膜在600 nm处的OD值。生物膜清除率=(阴性对 照 组OD600-实验组OD600)/阴性对 照 组OD600100%。1.2.9CLSM评估两药联合应用对 混合生物膜的抑制及离散作用对 于生物膜形成的测定,将牙本质片分为3组(n=8)置于48孔板中,每孔加入200 L混合菌悬浮液,实验组 分别加入200 L终浓度为1%+1/4MIC和1%+1/2MIC的两药混合溶液,阳性对 照 组 加入200 L终浓度为1/4MIC和1/2MIC的盐酸米诺环素溶液,阴性对 照 组 加等量含氯化血红素-Vk溶液的BHI培养基,每组3个复孔,在37、厌氧环境下静置培养48 h后检测药
25、物对 多菌种生物膜形成的影响。对 于生物膜离散的测定,将牙本质片分为3组(n=8)置于48孔板中,每孔加入200 L混合菌悬浮液,37、厌氧环境下静置培养48 h,以建立48 h多菌种生物膜模型。实验组 分别加入200 L终浓度为1%+1/2MIC和1%+MIC的两药混合溶液,阳性对 照 组 加入200 L终浓度为1/2MIC和MIC的盐酸米诺环素溶液,阴性对 照 组 加等量含氯化血红素-Vk溶液的BHI培养基,每组3个复孔,于相应环境下静置培养24 h后分别检测药物对 多菌种生物膜离散的影响。上述样本处理后,将每组 的生物膜上清液吸除,处理后各组 避光条件下加入SYTO-9/PI混合液1 m
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