水凝胶刚度影响髓核细胞表型及其功能的体内外研究.pdf
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1、Vol.43 No.7 Jul.2023上海交通大学学报(医学版)JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)水凝胶刚度影响髓核细胞表型及其功能的体内外研究陈泽昊1,2,吕振东3,张震1,崔文国2#,张煜辉1,3#1.上海大学机电工程与自动化学院,上海 200072;2.上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科,上海市伤骨科研究所,上海市中西医结合防治骨与关节病损重点实验室,上海
2、 200025;3.上海交通大学医学院附属仁济医院脊柱外科,上海 200127摘要 目的探究水凝胶刚度对髓核细胞表型及其治疗大鼠椎间盘退变功能的影响。方法构建不同浓度甲基丙烯酸酯明胶(methacrylate gelatin,GelMA)的水凝胶,使用流变分析和单轴压缩实验检测其刚度,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察其微观结构和形态。将具有正常表型的髓核细胞接种于GelMA水凝胶表面,活/死细胞染色评价水凝胶的生物相容性,鬼笔环肽染色观察髓核细胞在不同刚度培养基质上的生长形态。免疫荧光染色追踪髓核细胞Yes 相关蛋白(Yes-associa
3、ted protein,YAP)的核定位,实时定量 PCR 检测髓核细胞相关基因 神经细胞黏附分子 1(neural cell adhesion molecule 1,Ncam-1)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,Acan)和Y染色体性别决定区(sex-determing region of Y chromosome,SRY)-盒转录因子9(SRY-box transcription factor 9,Sox9)的表达水平。建立大鼠尾椎针刺椎间盘退变模型,获取不同培养基上的髓核细胞并分别注射到退变椎间盘中,4周后行磁共振成像检测,分析各实验组椎间盘含水量,组织学方法检测椎间盘结构和蛋白聚糖水
4、平。结果当GelMA预聚溶液浓度为4%和15%时,所得水凝胶的弹性模量分别为1 kPa和200 kPa。SEM显示水凝胶均呈疏松多孔结构,且水凝胶的孔隙率随其刚度增加而显著降低。体外实验显示2种刚度的GelMA水凝胶基质均有良好的生物相容性。相较于硬水凝胶基质(15%GelMA),软水凝胶基质(4%GelMA)上培养的髓核细胞伸长率更低、扩散面积更小,并表现出YAP在细胞质聚集的趋势。髓核细胞相关基因表达检测显示:软水凝胶基质组Sox9、Acan和Ncam-1的水平分别是对照组的23.7、6.6和12.7倍。体内实验显示,用不同刚度基质培养的髓核细胞治疗退变椎间盘,软水凝胶基质组的椎间盘含水量
5、及结构完整度均高于硬水凝胶基质组。结论相比于高刚度GelMA水凝胶,低刚度水凝胶基质能更好地维持髓核细胞的生长表型,并使其发挥更好的治疗椎间盘退变的功效。关键词水凝胶;刚度;髓核细胞;Yes相关蛋白;椎间盘退变DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.07.002 中图分类号R681.5 文献标志码AEffect of hydrogel stiffness on nucleus pulposus cell phenotypes in vitro and its repairment of intervertebral disc in vivoCHEN Zehao1,2,
6、L Zhendong3,ZHANG Zhen1,CUI Wenguo2#,ZHANG Yuhui1,3#1.School of Mechatronic Engineering and Automation,Shanghai University,Shanghai 200072,China;2.Department of Orthopedics,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine;Shanghai Institute of Traumatology and Orthopedics;Shanghai Ke
7、y Laboratory for Prevention and Treatment of Bone and Joint Diseases,Shanghai 200025,China;3.Department of Spine Surgery,Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200127,ChinaAbstract Objective To investigate the effect of hydrogel stiffness on nucleus pulposus cell ph
8、enotype and its function in repairing intervertebral disc degeneration in rats.Methods Methacrylate gelatin(GelMA)hydrogels with different concentrations were constructed.The stiffness of the hydrogels was investigated by using rheological analysis and uniaxial compression test.The microstructure an
9、d morphology of the hydrogels were observed by scanning electron microscopy(SEM).Nucleus pulposus cells with normal phenotype were inoculated on the surface of GelMA hydrogels.The biocompatibility of the hydrogel was evaluated by live-dead cell staining and the growth pattern of nucleus pulposus cel
10、ls on hydrogels with different stiffness was observed with phalloidin staining under microscope.Immunofluorescence staining was performed to examine the nuclear localization of Yes-associated protein(YAP)and real-time quantitative reverse transcription PCR(qRT-PCR)was used to detect the expression l
11、evels of nucleus pulposus 生物材料与再生医学专题基金项目 国家自然科学基金(52273133);上海市科学技术委员会项目(20S31900100)。作者简介 陈泽昊(1998),男,硕士生;电子信箱:。吕振东(1993),男,住院医师,硕士;电子信箱:。*为共同第一作者。通信作者 崔文国,电子信箱:。张煜辉,电子信箱:。#为共同通信作者。Funding Information National Natural Science Foundation of China(52273133);Foundation of Science and Technology Commi
12、ssion of Shanghai Municipality(20S31900100).Corresponding Author CUI Wenguo,E-mail:.ZHANG Yuhui,E-mail:.#Co-corresponding authors.804陈泽昊,等水凝胶刚度影响髓核细胞表型及其功能的体内外研究http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(7)cell-associated genes neural cell adhesion molecule 1(Ncam-1),aggrecan(Acan),sex-determing region of Y chromo
13、some(SRY)-box transcription factor 9(Sox9).A rat caudal acupuncture intervertebral disc degeneration model was established.Nucleus pulposus cells cultured on different hydrogels were harvested and injected into the degenerated discs separately.Four weeks after surgery,magnetic resonance imaging(MRI)
14、was performed to analyze the water content of the intervertebral discs in each group.Histological tests were performed to examine the disc structure and proteoglycan levels.Results The elastic modulus of the hydrogels was 1 kPa and 200 kPa when the concentration of GelMA prepolymerisation solution w
15、as at 4%and 15%respectively.SEM observation revealed that the hydrogels showed a loose and porous microstructure,and the porosity of hydrogels decreased significantly with the decrease of their stiffness.In vitro experiments demonstrated that both GelMA hydrogel mediums showed good biocompatibility
16、and the ability to support cell proliferation.Nucleus pulposus cells cultured on the soft matrix(4%GelMA)had a lower elongation and spreading area than those cultured on the stiff matrix(15%GelMA),showing a tendency of YAP concentration in the cytoplasm.The gene expression of nucleus pulposus cells
17、was examined and the levels of Sox9,Acan and Ncam-1 in the soft matrix hydrogel group were 23.7,6.6 and 12.7 times of those in the control group respectively.In vivo experiments on rat disc degeneration showed that the soft hydrogel matrix group had higher disc water content and structural integrity
18、 than the stiff hydrogel matrix group.Conclusion Compared to stiff GelMA hydrogels,hydrogels with low stiffness better maintain the growth phenotypes in the nucleus pulposus cells and have better therapeutic effect on disc degeneration in vivo.Key words hydrogel;stiffness;nucleus pulposus cell;Yes-a
19、ssociated protein(YAP);intervertebral disc degeneration在椎间盘退变的机制研究中,髓核细胞的表型和功能一直是研究的热点。然而,在体外培养的过程中,髓核细胞的细胞表型易丢失,影响后续研究结果1。天然的髓核是一种柔软的凝胶状组织。然而,在大多数的研究中,培养髓核细胞常用坚硬的塑料或玻璃皿,其弹性模量无法模拟天然组织。另外,由于缺少天然细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中的黏附因子2,随着培养时间的延长,在平皿上培养的髓核细胞会逐渐丧失其正常的形态和表型,从原本的多边形向梭形的成纤维细胞转变,并伴随髓核表型因子的丢失3
20、-4。如何在体外培养时尽可能维持髓核细胞的表型,是椎间盘研究中需要解决的问题。研究5-6显示,体外微环境的刚度会对髓核细胞表型产生显著影响,升高的刚度会加速髓核细胞的凋亡和表型的丢失。为了在体外培养中尽可能地保持细胞表型,有些研究在培养皿上铺一层基质胶或是ECM蛋白7。虽然采用这些方法能一定程度维持髓核细胞表型,但基质胶和预铺ECM蛋白对基质刚度的调节有限,难以达到满意的效果,同时成本高,难以广泛开展。Yes-相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)是细胞的机械传感因子,其转录水平可随着微环境的刚度改变而发生变化。YAP的表达可以在细胞质和细胞核中转移。在天然髓核组织中
21、,髓核细胞的YAP主要在细胞质中表达8。然而,刚性的体外培养环境容易导致 YAP 在髓核细胞的细胞核中表达,过度激活的 YAP 可以上调血清应答因子(serum-response factor,SRF)和 TEA 域(TEA domain,TEAD)的转录活性,抑制髓核细胞合成 ECM 的能力9。明胶是型胶原蛋白部分变性后的产物,保留了 胶 原 蛋 白 天 然 的 精 氨 酸-甘 氨 酸-天 冬 氨 酸(arginine-glycine-aspartic acid,RGD)肽,有利于细胞黏附10。明胶的氨基可以与甲基丙烯酸酐反应合成光交联GelMA水凝胶,在光引发剂和365 nm蓝光作用下引发
22、自由基聚合交联。GelMA水凝胶有较好的生物相容性和酶降解的特征,是一种常用的细胞培养介质和组织工程支架11。通过改变光交联条件,如预聚物溶液浓度和光照时间等,可以将GelMA 水凝胶的刚度在 1 至数百千帕范围内进行调节12。本研究拟合成光交联GelMA水凝胶,通过调整GelMA预聚物溶液的浓度获得具有不同刚度的水凝胶基质。将髓核细胞接种在不同刚度的水凝胶上进行培养,观察髓核细胞的细胞表型;检测YAP在髓核细胞中的表达定位和相关基因的水平;观察不同刚度的水凝胶基质下培养的髓核细胞体内治疗退变椎间盘的功能差异。1材料与方法1.1实验动物5 周龄雄性 SPF 级 SD 大鼠 10 只,体质量约2
23、00 g,购自上海杰思捷实验动物有限公司,动物生产许可证号为 SCXK(沪)2018-0004。所有大鼠在上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物中心饲养,动物使用许可证号为SYXK(沪)2018-0013。8052023,43(7)上海交通大学学报(医学版)Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)1.2主要材料与仪器明胶购自美国 Sigma-Aldrich 公司,甲基丙烯酸酐购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,透析袋(截留相对分子质量3 500)购自上海源叶生物科技有限公司,苯基-
24、2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂盐(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate,LAP)购自上海华夏司印生物技术有限公司,型胶原酶购自上海生工生物工程有限公司,DMEM/F12培养基购自美国 Hyclone 公司,胎牛血清和胰酶购自美国Gibco公司,活/死细胞染色试剂购自上海碧云天生物技术有限公司,YAP1一抗和Fluor594标记的二抗购自美国Affinity公司,DAPI染液和FITC标记的鬼笔环肽购自上海复申生物科技有限公司,细胞/组织总RNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司,反转录和实时定量PCR(qPCR)试剂盒购自北
25、京宝日医生物技术有限公司,qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。动态热机械分析仪Q800和流变仪ARES-G2购自美国 TA 公司,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)Sirion 200购自美国FEI公司,荧光显微镜购自德国Zeiss公司,激光共聚焦显微镜购自日本 Olympus 公司,qPCR 仪 Applied Biosystems 7500购自美国Thermo Scientific公司。1.3GelMA合成称取20 g明胶在60 下搅拌溶解在0.1 mol/L碳酸盐缓冲溶液(pH值9.0)中,以配置10%浓度的明胶溶液。逐滴加入 4
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- 凝胶 刚度 影响 细胞 表型 及其 功能 体内 研究
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