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xb六、细胞融合与杂交瘤技术PPT课件.ppt
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1、第六章第六章 细胞融合与杂交瘤技术细胞融合与杂交瘤技术12第一节 细胞融合技术第二节杂交瘤技术与单克隆抗体的生产3第一节 细胞融合技术一、细胞融合概述二、细胞融合的基本原理三、细胞融合的常用方法四、融合细胞的筛选41.定义细胞融合(cell fusion),又称体细胞杂交(somatichybridiazation),是指两个或多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合概述562.发生:自然界存在很多细胞融合现象,如:受精、成肌细胞融合,但频率低;细胞内吞与外排也属细胞膜融合现象;细胞内膜系统物质运输过程等。7uMuller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞能在体内自发地融
2、合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物(蛙类)的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田善雄发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇(PEG)化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分
3、泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。3.细胞融合研究进展8生物种类生物种类细胞来源细胞来源成功年代成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972
4、197219721972几种细胞融合成功的例子9植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞,左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞。10动物细胞融合实验使用的小白鼠114.细胞融合的分类基因型相同的细胞融合,形成的双核或多核细胞,称同核体(homokaryon);不同基因型的细胞融合形成的双核或多核细胞,称异核体(杂种细胞)。短期死亡;有丝分裂双亲染色体融合分裂成二合核体(synkaryon)(也称单核杂种细胞)125.细胞融合过程分四个阶段:细胞接触细胞质膜的融合细胞质重组遗传物质的选择13植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图146.细胞融合的意义u理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交
5、而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组,从而产生新的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。15二、细胞融合的基本原理16显微镜下细胞融合过程17融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解18三、细胞融合的常用方法19细胞融合技术分类:动物细胞融合细胞 细胞融合 人为方法构建 植物细胞 自然融合技术 原生质体融合 细胞拆合人为方法,人为
6、组合201.生物法仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:两种细胞在一起培养,加入病毒,在4条件下病毒附着在细胞膜上,并使两细胞相互凝聚;在37中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环,此时需要Ca2+和Mg2+,最适pH为8.0一8.2;细胞膜连接部穿通,周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP;融合成巨大细胞,仍需ATP。21用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图22 原理:Kao等认为,由于PEG分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键,从而在在质膜之间形成分子桥,其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合;另外,PEG能增加类脂膜的流动性,也使
7、细胞的核、细胞器发生融合成为可能。2.化学法聚乙二醇(PEG)法23影响因素:分子量:4006000(通常:10004000)浓度:2060%(通常:3050%)时间:悬浮法12min离心法58minpH:偏碱为宜(pH7.48.0)其他:二甲亚砜、植物血凝素24PEG诱导融合的特点:其优点是融合成本低,勿需特殊设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。25聚乙二醇(PEG)法细胞融合过程2627聚乙二醇(PEG)法细胞融合步骤将两种不同亲本细胞各5l06混匀;离心沉淀,吸去上清液;加1ml50PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触1分钟
8、;加9ml培养液,离心沉淀,吸去上清液;加5ml培养液,分别接种5个直径60mm平皿,每个平皿加培养液至5ml,37的CO2培养箱中培养。624小时后,换成选择培养液筛选杂交细胞。283.电融合法电融合法是80年代出现的细胞融合技术,在直流电脉冲的诱导下,细胞膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整的膜,形成融合体。电融合法的优点:u融合率高、重复性强、对细胞伤害小;u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程;u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。29电融合的基本过程:细胞膜的接触:细胞在交变电场中极化并沿电力线排
9、列成串,形成细胞间的紧密连接;膜的击穿:在高强度、短时程的直流电脉冲作用下,在其膜上会短暂地形成小孔,从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。30313233甜菜原生质体电融合过程1)在高频电流电场下的相互接触。2)脉冲刺激后30s3)50秒后4)1.5分钟后5)6分钟后6)15分钟后,原生质体融合完成。344.不同细胞融合的条件及其主要应用3536融合后的柑橘37融合柑橘与母本比较38原理:两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞,筛选的目的是获得优良的杂种细胞。1)亲本2)同核体3)异核体四、融合细胞的筛选39u抗药性筛选系统:利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。如,亲本A:对氨苄
10、青霉素敏感,对卡娜霉素不敏感亲本B:对卡娜霉素敏感,对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长1.动物细胞筛选方式40HAT选择系统HAT是含一定浓度次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)及胸腺嘧啶核苷(T)的一种选择性培养基,其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种:41HAT选择培养法42u营养互补筛选系统:细胞在缺乏一种或几种营养成分时,不能生长繁殖,即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。如,亲本A:色氨酸缺陷型亲本B:苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养,而亲本细胞均会死亡。43u温度敏感突变型:一般的培养细胞
11、能在32度到40度的范围内生长,但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。如,亲本一:具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二:高温敏感突变型,但不能抗卡娜霉素。杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。44u荧光激活细胞分选仪:用不同荧光素标记的脂质染料分别处理参与融合的亲本细胞,在激光的激发下,融合细胞能发射两种荧光,由此筛选杂种细胞。如,亲本一:用RB200标记,发明亮橙色荧光。亲本二:用FITC标记,发黄绿色荧光。杂种细胞能发射两种荧光。45462.杂交细胞表型及其控制q杂交细胞的遗传表型具有多样性(双亲特征都有,且植物细胞能与动物细胞杂交)和不稳定性(染色
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