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第 30 卷 第 3 期 天 津 农 学 院 学 报 Vol.30，No.3 2023 年 6 月 Journal of Tianjin Agricultural University June，2023 收稿日期：2022-04-01 基金项目：天津市科委自然基金项目（17JCYBJC29800，15JCYBJC23900）；天津市131人才二层次项目（TJ201603）作者简介：石雪（1996），女，硕士在读，主要从事原生动物学研究。E-mail：。通信作者：齐红莉（1978），女，副教授，硕士，主要从事水生态毒理学及原生动物学研究。E-mail：。文章编号：1008-5394（2023）03-0053-06 DOI：10.19640/ki.jtau.2023.03.010 硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫的毒性影响 石雪，吕湘琳，齐红莉通信作者，刘家乐（天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392）摘 要：为探究氨氮胁迫下纤毛虫的毒性效应，试验采用静水生物急性毒性试验法，以养殖水体中常见的病害原生动物盾纤类纤毛虫蠕形康纤虫（Cohnilembus Verminus）为试验材料，测定了其在硝酸钠和氯化铵两种氮源药物胁迫下的LC50值，并以此为基准开展亚急性毒性试验，测定蠕形康纤虫种群密度、种群生长率和世代时间。结果显示，硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫的 24 h 的半致死浓度分别是 27.980 和 3 225.970 mg/L；48 h 的半致死浓度分别是 27.320 和 901.600 mg/L。在硝酸钠和氯化铵作用下，随着药物浓度升高，蠕形康纤虫最大种群密度和种群生长率均呈现先升高后降低的趋势，世代时间呈现先降低后升高的趋势。研究表明，低浓度氨氮胁迫对蠕形康纤虫生长有促进作用，相对于其他的水生生物，蠕形康纤虫对氨氮耐受性较高。在实际高密度水产养殖中，应关注盾纤类纤毛虫的病害。关键词：硝酸钠；氯化铵；蠕形康纤虫；毒性效应；种群增长 中图分类号：S943 文献标识码：A Toxic effect of ammonia and nitrogen on Cohnilembus verminus Shi Xue,L Xianglin,Qi HongliCorresponding Author,Liu Jiale（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture,College of Fisheries,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300392,China）Abstract:In order to explore the toxic effect of ammonia nitrogen stress on ciliates,this study adopted the acute toxicity test method of hydrostatic organisms,and measured the LC50 value of Cohnilembus verminus under the stress of sodium nitrate and ammonium chloride.The results showed that the half lethal concentrations of sodium nitrate and ammonium chloride for 24 hours were 27.980 mg/L and 3 225.970 mg/L respectively,and the half lethal concentrations for 48 hours were 27.320 mg/L and 901.600 mg/L respectively.Low concentrations of sodium nitrate and ammonium chloride can promote the growth of C.Verminus.With the increase of drug concentration,the maximum population density and growth rate increased first and then decreased,while the generation time decreased first and then increased.In this experiment,it was found that C.Verminus had a high tolerance to ammonia and nitrogen.Therefore,in the actual high-density aquaculture,the pest of scuticociliatosis should be paid more attention.Key words:sodium nitrate;ammonium chloride;Cohnilembus verminus;toxicity effect;population growth 盾纤类纤毛虫是海水养殖过程中常见且多发的危害性纤毛虫原生动物，尤其在富营养化水体中常见，可以寄生到软体动物、甲壳类、鱼类等寄主身上进行生长繁殖，引起寄主体表溃烂1-4，蠕形康纤虫（Cohnilembus verminus）隶属盾纤目（Scuticocilliatida），康纤虫属（Cohnilembus），一般自由生活或栖息在海湾扇贝外套腔1。鉴于盾纤类纤毛虫在水产养殖中的危害，研究相关的毒理学试验对其病害防治有重要意义5-9。近年来，现代工农业和人类活动以及水产养殖中的废水会导致氨氮排入水环境中，使氨氮成为水体中的重要环境因子之一10-13。氨氮是密集型水产养殖水域中的常见污染物，以非电离和电离形式存在14-15。未电离的氨氮可通过细胞膜，由于其具有脂溶性，对细胞有害。许多学者研究发现高浓度氨氮会对纤细裸藻（Euglena gracilis）和亚洲苦草（Vallisneria asiatica）产生氧化胁迫，导致其细胞中叶绿素含量和蛋白质含量下降，加重细胞的 DNA 损伤程度，还会抑制幼鱼生长，对幼鱼的鳃和肝脏组织造成损伤，影响幼鱼非特异性免疫以及营养代谢16-19。因此，高浓度氨氮会对水生生物生长和活动产生有害影响，严重时会导致死亡，在水产养殖中需严格控制水体中氨氮的浓度，有效防止由于水质管理不当引发的危害。天 津 农 学 院 学 报 第 30 卷 54本试验以蠕形康纤虫为研究对象，探究了硝酸钠及氯化铵两种氮源药物对蠕形康纤虫的毒性效应，为蠕形康纤虫对氨氮的耐受性研究提供试验依据，以期为盾纤类纤毛虫的病害防治研究提供基础资料。1 试验材料与方法 1.1 试验材料 蠕形康纤虫（C.Verminus）采集于天津北大港湿地，经活体观察和蛋白银染色确定为蠕形康纤虫，后进行单克隆纯种培养。纤毛虫培养水体为盐度 30 的人工海水，放入米粒以富集作为纤毛虫食物来源的天然细菌，从而保证蠕形康纤虫的正常增长培养。试验所用硝酸钠购自天津风船化学试剂科技有限公司（20151108），氯化铵购自天津大学科威公司（20140511）。1.2 试验方法 1.2.1 急性毒性试验 根据周永欣等20测定水生生物毒性试验的方法，计算每种纤毛虫的半数致死浓度。所有测定均在六孔培养板中进行，蠕形康纤虫的接种密度为 10 ind/mL，每隔 24 h 计数。药物浓度根据预试验结果设置，硝酸钠为 26、27、28、29 mg/L、氯化铵为 2 600、2 800、3 000、3 200 mg/L，为排除其他因素对试验的影响，添加不含硝酸钠和氯化铵的处理组作为对照组，每个处理组重复 3 次。1.2.2 慢性毒性试验 慢性毒性试验在六孔培养板中进行，蠕形康纤虫的接种密度为 3 ind/mL，每 24 h 观察并记录蠕形康纤虫的种群密度，当纤毛虫数目达到衰退期时结束试验。慢性毒性试验浓度依据急性试验结果设置，硝酸钠为 0.000、0.425、0.850、1.700和 3.400 mg/L，氯化铵为 0.000、45.350、90.700、181.400 和 362.700 mg/L。每个处理组重复 3 次。由于氯化铵易挥发，故氯化铵慢性试验过程中每24 h 用吸管口细度小于虫子体积的吸管，从六孔板每孔吸出一半测试液，并重新配置氯化铵溶液和海水加至原测试液量，以保证氯化铵的有效性。1.3 数据处理 原生动物纤毛虫种群生长率21计算公式为：tLnNLnNrt0=式中：Nt为时间t时的种群密度，N0为初始种群密度，t为试验时间。纤毛虫是通过二分裂的方式进行种群生长的22，因此世代时间与种群生长率（r）之间的关系为：rLnG2=式中：r为原生动物纤毛虫的种群生长率。2 结果与分析 2.1 硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫急性毒性试验 采用概率单位分析法（表 1），计算硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫的 24 h LC50和 48 h LC50，结果如图 1 所示。随着硝酸钠浓度上升，蠕形康纤虫的死亡率不断升高，24 h 时，在 28 mg/L 硝酸钠作用下蠕形康纤虫的死亡率已接近半数（45.6%）；48 h 时，在 29 mg/L 硝酸钠作用下蠕形康纤虫几乎全部死亡（96.7%）。硝酸钠对蠕形康纤虫的 24 h浓度对数与概率单位的直线回归方程为y37.33x-49.011，R20.987 7；计算得到 24 h LC50为 27.980 mg/L。48 h 浓度对数与概率单位的直线回归方程为y58.218x-78.626，R20.929；计算得到 48 h LC50为 27.320 mg/L。表 1 硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫急性毒性试验结果 试验药物 药物浓度/mgL-1 浓度对数 死亡率/%概率单位 24 h 48 h 24 h 48 h 硝酸钠/NaNO3 CK-0 0 0 0 26 1.414 973 0.122 0.144 3.835 0 3.937 5 27 1.431 364 0.289 0.356 4.443 7 4.630 8 28 1.447 158 0.456 0.578 4.889 5 5.196 8 29 1.462 398 0.744 0.967 5.655 7 6.828 4 氯化铵/NH4Cl CK-0 0 0 0 2 600 3.414 973 0.111 0.133 3.778 8 3.887 7 2 800 3.447 158 0.200 0.367 4.158 4 4.660 2 3 000 3.477 121 0.367 0.578 4.660 2 5.196 8 3 200 3.505 150 0.467 0.867 4.917 2 6.112 3 第 3 期 石雪，等：硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫的毒性影响 55 图 1 硝酸钠和氯化铵对的蠕形康纤虫 LC50的影响 氯化铵作用下，24 h 时，3 200 mg/L 组蠕形康纤虫死亡率接近 50%，48 h 时，氯化铵对蠕形康纤虫毒性效应继续增强，氯化铵对蠕形康纤虫的24 h 浓度对数与概率单位的直线回归方程为y13.05x-40.788，R20.989 7。计算得到 24 h LC50为 3 225.970 mg/L。48 h 浓度对数与概率单位的直线回归方程为y23.941x-77.899，R20.987 3；计算得到 48 h LC50为 2 901.600 mg/L。2.2 硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫的种群生长曲线和最大种群密度的影响 不同浓度硝酸钠作用下蠕形康纤虫种群生长曲线变化如图 2 所示。高浓度组硝酸钠作用下蠕形康纤虫的种群增长曲线符合 Logistic 种群生长曲线，存在停滞期、指数期、稳定期、衰退期四个时期。对照组无明显停滞期，进入 9 d 指数增长期，第 10 天达到种群密度峰值，之后种群密度逐渐开始衰退。0.425 mg/L 组硝酸钠作用下的蠕形康纤虫在经历 9 d 的指数增长期后达到峰值，但不存在明显的稳定期。1.700 mg/L 组作用下的蠕形康纤虫达到峰值的时间最早（8 d），随后进入稳定期，4 d 后种群密度开始衰退。3.400 mg/L 组作用下的蠕形康纤虫在第 9 天达到种群密度峰值，随后进入衰退期。图 2 不同浓度硝酸钠对蠕形康纤虫种群增长曲线的影响 不同浓度氯化铵作用下蠕形康纤虫种群生长曲线变化如图 3 所示。高浓度组氯化铵作用下蠕形康纤虫的种群增长曲线符合 Logistic 种群生长曲线。对照组、45.350 mg/L 和 90.700 mg/L 组蠕形康纤虫的指数生长期较长，在 9 d 达到峰值，无明显停滞期，随后下降。高浓度组氯化铵（181.400和 362.700 mg/L）作用下的蠕形康纤虫的指数生长期较短，分别在5 d和6 d达到峰值，停滞期较长，181.400 mg/L组作用下的蠕形康纤虫存在4 d的停滞期，362.700 mg/L 组浓度下蠕形康纤虫存在 3 d的停滞期，随后进入衰退期。图 3 不同浓度氯化铵对蠕形康纤虫种群增长曲线的影响 在不同浓度硝酸钠和氯化铵作用下，蠕形康纤虫最大种群密度变化趋势如图 4 所示。图 4 不同浓度硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫最大种群密度的影响 天 津 农 学 院 学 报 第 30 卷 56 蠕形康纤虫的最大种群密度随着硝酸钠浓度变化总体上呈现先上升后下降的趋势（图 4 A）。在 0.425 mg/L 作用浓度下蠕形康纤虫的种群密度显著高于其他浓度（P0.05），在 1.700 mg/L 浓度下蠕形康纤虫的种群密度最低，显著低于 0.425 和0.850 mg/L 组（P0.05）。不同浓度下的氯化铵对蠕形康纤虫最大种群密度的影响，总体上也呈现了先上升后下降的趋势（图 4 B）。在 45.350 和90.700 mg/L 氯化铵作用下的蠕形康纤虫的最大种群密度均显著高于对照组（P0.05）。2.3 硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫的种群生长率和世代时间的影响 硝酸钠对蠕形康纤虫的种群生长率和世代时间的影响如图 5 所示，种群生长率和世代时间的One-way ANOVA 检验结果见表 2。蠕形康纤虫的种群生长率总体上呈现先上升后下降的趋势，0.425和0.850 mg/L组的种群生长率显著高于对照组（P0.05），分别升高了 13.0%和 14.4%；1.700和 3.400 mg/L 组蠕形康纤虫的种群生长率与对照组相比差异不显著（P0.05）。硝酸钠作用下蠕形康纤虫的世代时间总体上呈现先下降后上升的趋势，0.425 和 0.850 mg/L 组浓度下的世代时间显著下降了 12.0%和 13.0%（P0.05）。图5 不同浓度硝酸钠对蠕形康纤虫生长率和世代时间的影响 表 2 硝酸钠组蠕形康纤虫种群生长率和世代时间的One-way ANOVA检验 硝酸钠 P值 mgL-1 0 0.425 0.850 1.700 3.400 0 0.036*0.026*0.275 0.254 0.425 0.034*0.853 0.236 0.255 0.850 0.023*0.810 0.177 0.193 1.700 0.304 0.202 0.138 0.975 3.400 0.223 0.278 0.193 0.832 注：表中右上方数据表示世代时间，左下方数据表示种群生长率。*表示差异显著（P0.05）；*表示差异极显著（P0.01），下同 氯化铵对蠕形康纤虫的种群生长率和世代时间的影响如图 6 所示，种群生长率和世代时间的One-way ANOVA 检验结果见表 3。蠕形康纤虫的种群生长率总体上呈现上升趋势，和对照组相比，362.700 mg/L 组的种群生长率极显著高于对照组（P0.01），升高了 38.8%；45.350 mg/L 组蠕形康纤虫的种群生长率显著高于对照组（P0.05），升高了 16.5%。氯化铵作用下蠕形康纤虫的世代时间总体上呈现下降趋势，362.700 mg/L 组浓度下的世代时间与对照组相比显著下降了 69.6%（P0.01）。图6 不同浓度氯化铵对蠕形康纤虫生长率和世代时间的影响 表 3 氯化铵组蠕形康纤虫种群生长率和世代时间的One-way ANOVA检验 氯化铵 P值 mgL-1 0 45.350 90.700 181.400 362.700 0 0.042*0.162 0.209 0.001*45.350 0.026*0.429 0.004*0.048*90.700 0.139 0.336 0.017*0.012*181.400 0.346 0.005*0.027*0.010*362.700 0.010*0.005*0.001*0.001*3 讨论 在水产养殖中，人们为了追求高效率、高产量，大量使用化肥、饲料等，造成水体中氨氮含量升高，从而对养殖生物造成危害14,23。对水生生物来说，生命周期的不同阶段，物种之间甚至物种内部对氨氮的耐受性也不同。KLIMEK 等24研究发现氯化铵对天蓝喇叭虫（Stentor coeruleus）24 h LC50为 43.300 mg/L，对毛板壳虫（Coleps hirtus）的 24 h LC50为 441.120 mg/L，本试验中氯化铵对蠕形康纤虫的24 h LC50为3 225.970 mg/L，由此可见，氯化铵对天蓝喇叭虫和毛板壳虫的毒性远大于蠕形康纤虫。近年来，许多学者研究了氯化铵对水生生物的毒性效应，赵志刚等25研究发现氯化铵对大型溞（Daphnia magna）的 24 h LC50为 165.97 第 3 期 石雪，等：硝酸钠和氯化铵对蠕形康纤虫的毒性影响 57mg/L；胡萍华等26研究了氯化铵对白斑狗鱼（Esox lucius）成鱼的 24 h LC50为 45.85 mg/L；王甜等27研究发现氯化铵对白斑狗鱼（Esox lucius）幼鱼的24 h LC50为 34.36 mg/L。本试验结果与上述数据相比可知，不同水生生物对于氯化铵的耐受性为蠕形康纤虫 毛板壳虫大型溞白斑狗鱼成鱼天蓝喇叭 虫白斑狗鱼幼鱼，这些数据表明蠕形康纤虫对氯化铵的耐受性相对较高。RODRIGUES等28研究得出硝酸钠对军曹鱼（Rachycentron canadum）的 24 h LC50为 2 407.0 mg/L；HAMLIN29研究发现硝酸钠对 6.9 g 规格的西伯利亚鲟（Acipenser baerc）24 h LC50为 1 510.0 mg/L，对673.8 g 规格下西伯利亚鲟的 24 h LC50为 809.0 mg/L，本试验中硝酸钠对蠕形康纤虫的 24 h LC50为 27.980 mg/L，蠕形康纤虫对硝酸钠的耐受性要低于军曹鱼和西伯利亚鲟对硝酸钠的耐受性。以上数据表明，不同种类的水生生物和不同的水体环境，对氨氮的耐受性存在显著差异。本试验认为，蠕形康纤虫对氨氮有较高的耐受性，使其能够在含有较高氨氮的水体中生存。种群生长率是理解种群动力学的重要参数，而世代时间是种群生态学研究中的必要指数，在海洋纤毛虫对环境胁迫适应情况等方面研究中具有重要意义28。本试验中蠕形康纤虫经过 9 d 的指数生长期达到最大种群密度，无明显稳定期，随后进入衰退期。近年来，许多学者通过室内试验测定了纤毛虫种群生长的相关数据，海洋拟阿脑虫（Paranophrys marina）在米粒培养液中，种群经过 1.5 d 的停滞期之后开始指数增长，持续 2 d 后达到种群最大密度30；贪食迈阿密虫（Miamiensis avidus）种群经过 0.5 d 的停滞期后进入指数生长期，在持续 3 d 的指数生长期达到最大种群密度，随后进入 4 d 的衰退期31；哈氏伪康纤虫（Pseudocohnilembus hargisi）种群经过 0.5 d 生长停滞期后进入 1 d 的指数生长期，达到最大种群密度32；缩原克鲁虫（Protocruzia contrax）种群经过2 d 的停滞期后进入 7 d 的指数生长期，达到最大种群密度，后进入稳定期；海洋尾丝虫（Uronema marinum）在 20 培养下，种群经历 1 d 的停滞期，进入 4 d 的指数增长期，后经过 11 d 进入衰退期22，这与本试验的蠕形康纤虫稳定期不长即进入衰退期趋势基本一致。本试验发现，蠕形康纤虫和其他盾纤类纤毛虫相比，指数生长较长且无明显稳定期。在硝酸钠和氯化铵不同浓度下，蠕形康纤虫的种群生长存在一定的差异，在硝酸钠药物培养液中，低浓度硝酸钠对种群生长有促进作用，最大种群密度高于对照组，高浓度作用下起到抑制作用，达到最大种群密度时间低于对照组且种群密度下降。在氯化铵药物作用下，低浓度组最大种群密度高于对照组，对种群生长有促进作用，与对照组相比，高浓度组下的指数生长期缩短，这说明药物浓度升高对蠕形康纤虫的种群生长起到了抑制作用。这与王红宇等31研究的氯化钠和敌百虫对贪食迈阿密虫的毒性效应结果基本一致。研究表明，氨氮会通过抑制拟穴青蟹（Scylla paramamosain）酶活力的方式来影响拟穴青蟹的非特异性免疫反应，破坏拟穴青蟹血细胞并造成毒害作用；氨氮会对虎斑乌贼（Sepia pharaonis）的肝脏和鳃组织造成严重损伤；氨氮会导致萼花臂尾轮虫（Brachionus calyciflorus）体内活性氧积累，破坏其抗氧化酶系统，加剧脂质过氧化，产生毒害作用33-35。氨氮对于纤毛虫的毒性机制尚不明确，关于氨氮对纤毛虫的影响，要从分子、个体、种群和群落等不同水平领域展开更深入研究。4 结论 本研究发现，蠕形康纤虫对氨氮的耐受性较高，在实际养殖中杀灭蠕形康纤虫的同时可能会伤害海水养殖动物，同时应该注意盾纤类纤毛虫的病害。将硝酸钠和氯化铵分别做用于蠕形康纤虫时，其种群增长符合逻辑斯蒂增长曲线，1.700 mg/L 的硝酸钠对蠕形康纤虫的种群增长起到有效的抑制作用，而 45.350181.400 mg/L 的氯化铵，随着浓度增长，对蠕形康纤虫种群增长起到了低浓度促进、高浓度抑制的作用。参考文献：1 胡晓钟，徐奎栋，宋微波.扇贝外套腔内的共栖纤毛虫蠕形康纤虫的形态学研究J.青岛海洋大学学报，1996，26（2）：65-68.2 IGLESIAS R，PARAM A，ALVAREZ M F，et al.Philasterides dicentrarchi（Ciliophora,Scuticociliatida）as the causative agent of scuticociliatosis in farmed turbot Scophthalmus maximus in Galicia（NW Spain）J.Diseases of Aquatic Organisms，2001，46（1）：47-55.3 SONG J Y，KITAMURA S I，OH M J，et al.Pathogenicity of Miamiensis avidus（syn.Philasterides dicentrarchi），天 津 农 学 院 学 报 第 30 卷 58Pseudocohnilembus persalinus,Pseudocohnilembus hargisi and Uronema marinum（Ciliophora,Scuticociliatida）J.Diseases of Aquatic 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