三种糖基化中间产物与小牛胸腺DNA相互作用的多光谱和分子动力学模拟.pdf

收稿日期:.基金项目:国家自然科学基金面上项目();江西省自然科学基金重点项目(A C B );食品科学与技术国家重点实验室项目(S K L F Z Z B ;S K L F Z Z A ).作者简介:吴健妹(),女,硕士生.通信作者:张国文(),男,教授,博士,博士生导师.E m a i l:g w z h a n g n c u e d u c n.吴健妹,张国文三种糖基化中间产物与小牛胸腺D NA相互作用的多光谱和分子动力学模拟J南昌大学学报(理科版),():WUJM,Z HAN GG W M u l t i s p e c t r a l a n dm o l e c u l a rd y n a m i c s s i m u l a t i o ns t u d i e so f t h e i n t e r a c t i o no f t h r e eg l y c o s y l a t i o n i n t e r m e d i a t e sw i t hc a l f t h y m u sD NAJJ o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e),():三种糖基化中间产物与小牛胸腺D NA相互作用的多光谱和分子动力学模拟吴健妹,张国文(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 )摘要:三种 二羰基化合物:丙酮醛(MGO)、丁二酮(D A)和乙二醛(G O)作为常见的高反应活性的糖基化中间体,会对体内的生物大分子(如D NA)造成损伤.MGO、D A和GO与小牛胸腺D NA(c t D NA)的相互作用特性通过多光谱方法结合计算机模拟技术进行测定.紫外光谱分析表明,范德华力和氢键驱动MG O、D A和G O与c t D NA发生自发结合,分子动力学模拟中的各能量分布佐证了这一结论.在 下,MG O、D A和G O与c t D NA的结合常数接近经典的凹槽结合剂,其值分别为 、和 Lm o l.N a C l、单双链D NA、热变性、粘度和园二色谱实验证明了MGO、D A和GO与c t D NA均通过凹槽方式结合.分子对接直观显示了MG O、D A和G O是结合在D NA富含A T的小沟区,其中D T 和D A 是结合的活性位点.分子动力学模拟显示MGO c t D NA复合物较游离c t D NA有更高的均方根偏差(RM S D)、回旋半径(R g)和均方根波动(RM S F)值,说明MGO的结合使D NA结构部分松散,稳定性减弱.凝胶电泳实验表明,在赖氨酸和C u存在下,MG O、D A和G O均能损伤质粒D NA,MG O和G O甚至会完全破坏D NA的超螺旋形态.关键词:糖基化中间产物;二羰基化合物;小牛胸腺D NA;相互作用;分子动力学模拟中图分类号:O 文献标志码:A文章编号:()M u l t i s p e c t r a l a n dm o l e c u l a rd y n a m i c s s i m u l a t i o ns t u d i e so f t h ei n t e r a c t i o no f t h r e eg l y c o s y l a t i o n i n t e r m e d i a t e sw i t hc a l f t h y m u sD N AWUJ i a n m e i,Z HANGG u o w e n(S t a t eK e yL a b o r a t o r yo fF o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,N a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c h a n g ,C h i n a)A b s t r a c t:T h r e e d i c a r b o n y l c o m p o u n d s,m e t h y l g l y o x a l(MG O),d i a c e t y l(D A)a n dg l y o x a l(GO)w e r ec o mm o nh i g h l yr e a c t i v eg l y c o s y l a t i o n i n t e r m e d i a t e s t h a t c a nc a u s ed a m a g et ob i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s(e g D NA)i nt h eb o d y T h e i n t e r a c t i o np r o p e r t i e so fMGO,D Aa n dG O w i t hc a l f t h y m u sD NA(c t D NA)w e r ed e t e r m i n e db ym u l t i s p e c t r a lm e t h o d sc o m b i n e dw i t hc o m p u t e r s i m u l a t i o n t e c h n i q u e s A n a l y s i so fUVs p e c t r a i n d i c a t e d t h a tMG O,D Aa n dGOb i n d i n g t oc t D NAs p o n t a n e o u s l yw e r em a i n l yd r i v e nb yv a nd e rW a a l sf o r c e sa n dh y d r o g e nb o n d i n g,a n dt h ee n e r g yd i s t r i b u t i o ni nm o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n ss u p p o r t e dt h i sc o n c l u s i o n T h eb i n d i n gc o n s t a n t so fMGO,D Aa n dGO w i t hc t D NAa t w e r ec l o s et ot h o s eo fc l a s s i c a lg r o o v e b i n d e r s,w i t hc o r r e s p o n d i n gv a l u e so f ,a n d Lm o l,r e s p e c t i v e l y N a C l,s i n g l ea n dd o u b l e s t r a n d e dD NA,t h e r m a l d e n a t u r a t i o n,v i s c o s i t ya n dC Ds p e c t r o s c o p ye x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e dt h a tMG O,D Aa n dG Ow e r ea l l b o u n dt oc t D NAv i ag r o o v eb i n d i n g M o l e c u l a rd o c k i n gv i s u a l i z a t i o ns h o w e dt h a tMG O,D Aa n dG Ow e r eb o u n d i nt h eA T r i c hm i n o rg r o o v er e g i o no fD NA,w i t hD T a n dD A b e i n gt h ea c t i v es i t e so fb i n d i n g M o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n so ft h eMG O c t D NAc o m p l e xh a dh i g h e rr o o tm e a ns q u a r ed e v i a t i o n,r a d i u so fg y r a t i o n,a n dr o o tm e a ns q u a r ef l u c t u a t i o nv a l u e st h a nf r e eD NA,i n d i c a t i n gt h a t t h eb i n d i n go fMG Ol o o s e n e da n dt e n d e dt od e s t a b i l i s ep a r t so f t h eD NAs t r u c t u r e G e l e l e c t r o p h o r e s i se x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tMGO,D Aa n dG Oc o u l dd a m a g ep l a s m i dD NAi n t h ep r e s e n c eo f l y s i n e a n dC u,a n dMG O第 卷第期 年月南昌大学学报(理科版)J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e)V o l N o J u n a n dG Oe v e nc o m p l e t e l yd i s r u p t e dt h es u p e r h e l i c a lm o r p h o l o g yo fD NAK e yW o r d s:g l y c o s y l a t i o n i n t e r m e d i a t e s;d i c a r b o n y l c o m p o u n d s;c a l f t h y m u sD NA;i n t e r a c t i o n s;m o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n s 二羰基化合物(D i c a r b o n y lc o m p o u n d s,D C s)是糖基化过程中重要的中间体,既产生于人体糖代谢过程,又通过摄入富糖或富脂食物进入人体内.D C s因两羰基形成共轭结构,而具有较高的反应活性,常见的 D C s有:丙酮醛(MGO),丁二酮(D A),乙二醛(GO)和 脱氧葡糖醛酮(D G)等.高活性的 D C s是加速晚期糖基化终末产物(AG E s)生成的主要因素.AG E s与AG E s受体(R AG E)的结合刺激活性氧(R O S)和炎性细胞因子的产生,导致氧化应激和炎症反应.在AG E s形成期间,D C s与蛋白质的赖氨酸或精氨酸残基的非酶交联也会促进R O S的产生,如超氧阴离子和羟基自由基.这些有害物质会引发氧化修饰,对细胞成分如蛋白质和D NA造成损害,进而引发人体内各类慢性疾病(如糖尿病和阿尔兹海默症等).另外,MGO自身除了会抑制D NA的合成,还通过使D NA片段化产生一些凋亡标记来引起细胞死亡.GO也能改变细胞形态,使D NA的合成受阻.因此,探究 D C s与D NA间的相互作用十分必要.D NA是遗传信息的主要载体,指导蛋白质和酶的合成,常作为有害小分子的主要靶标进行分子水平的毒性研究.本研究采用多光谱方法(紫外光谱、荧光分析和圆二色谱法)和计算机模拟技术(分子对接和分子动力学模拟),研究MGO、D A和GO与c t D NA的相互作用模式及对D NA的结构损伤作用,对于认识食品中有害物质在体内的代谢及其可能的毒性机制具有重要意义,也为进一步研究其有害作用的可能抑制手段提供了有用的信息.实验部分试剂与仪器小牛胸腺D NA(c a l f t h y m u sD NA,c t D NA)和p U C 质粒D NA购于北京索莱宝科技有限公司;丙酮醛(水溶液)、丁二酮(纯度)、乙二醛(M水溶液)和H o e c h s t 均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;溴化乙锭(E B)购于印度S R L公司.所用的所有其他化学品均为分析纯,所用水为超纯水.c t D NA储备溶液制备:将 m gc t D NA加入p H的 m o lLT r i s HC l缓冲液中,定容至 m L,在 下放置一周保证c t D NA完全溶解.用 紫 外 光 谱 法 测 定c t D NA的 吸 光 度 值,若A /A 在范围内,表明该D NA溶液较纯可用于实验.通过 Lm o lc m计算c t D NA溶液的浓度,制备的储备液浓度为 m o lL.B S A S型电子天平(德国S a r t o r i u s公司);p H S E型酸度计(上海雷磁仪器厂);UV 型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);乌氏粘度计(上海前锋橡塑玻璃制品厂);F 型荧光分光光度计(日本日立公司);MO S 型圆二色(C D)谱仪(法国B i o L o g i c公司);D YY C型电泳仪(北京六一仪器厂).方法紫外吸收光谱在、和 下,将c t D NA的浓度保持在 m o lL,分别连续添加 次等浓度(m o lL)的MGO、D A或GO,混匀反应m i n后,在紫外光谱仪上记录 n m MGO、D A或GO存在和不存在下的c t D NA的紫外吸收光谱.盐离子实验将c t D NA(m o lL)和MGO、D A或GO(m o lL)在室温下静置反应 m i n,制得MGO/D A/GO c t D NA复合体系,分别 向 单 独c t D NA和MGO c t D NA、D A c t D NA或GO c t D NA复合体系中不断滴加等浓度的N a C l溶液(m o lL),反应m i n后,测定各反应溶液在 n m处的吸光度值.单双链D NA结合实验参照并改进周智圣 的方法,将双链c t D NA(d s c t D NA)在 下加热 m i n,再迅速冰浴冷却约 m i n,即得单链c t D NA(s s c t D NA).在m L缓冲体系中,固定MGO、D A或GO的浓度均为 m o lL,向小分子溶液中分别滴加d s c t D N A和s s c t D N A,共 次,在紫外光谱仪上记录 n m各复合体系的U V v i s吸收光谱.D NA熔点分析固定混合溶液中c t D NA和MGO、D A或GO南昌大学学报(理科版)年的浓度分别为 和 m o lL,将单独c t D NA、MGO c t D NA、D A c t D NA和GO c t D NA混合溶液均从 加热至,每间隔测定一次各溶液的A n m.fs s(AA)/(AfA),fs s时对应的温度即为c t D NA的熔点温度(Tm),其中A、A和Af分别为各反应体系在不同实验温度、和 时的吸光度.粘度测量使用维持在 恒温浴中的粘度计进行粘度测量.用T r i s HC l缓冲溶液(p H)将c t D NA的浓度固定为 m o lL,在不存在和存在MGO、D A、GO或H 的情况下,测量每个样品流过毛细管的时间次,并计算平均流动时间.以(/)/为纵坐标,浓度比为横坐标画图,其中是在MGO、D A、GO或H 存在下c t D NA的粘度,是单独c t D NA的粘性.根据观察到的含c t D NA溶液的流动时间(t)计算粘度值,所用时间均经缓冲液单独流动时间(t)校正,(tt)/t.荧光探针实验将MGO、D A或GO(m o lL)依次滴定至含有固定量的c t D NA(m o lL)和H 或E B(m o lL)的混合溶液中.H c t D NA复合体系在 n m处激发,并在 n m处记录发射光谱,E B c t D NA复合体系在 n m处激发,并在 n m处记录发射光谱.荧光竞争百分比()(FF)/(FF),F、F和F分别是H c t D NA或E B c t D NA系统的荧光强度、H c t D NA或E B c t D NA体 系 在 不 同MGO、D A或GO溶液存在下的荧光强度和单独的H 或E B的荧光强度.所有荧光测定值需通过FcFme(A A)/来扣除内滤光影响,Fc和Fm分别是校正和测量的荧光值,A和A分别是M G O、D A或G O在对应激发和发射波长下的吸光度.圆二色性(C D)测量在 下,使用浓度为 和 m o lL的MGO、D A或GO对c t D NA(m o lL)进行处理 m i n,在 n m处通过c m厚度的石英皿测定样品的C D光谱,同时扫描缓冲溶液光谱以校正所有的C D图谱.凝胶电泳质 粒D NA的 氧 化 损 伤 是 参 照 并 修 改CHAYA R AT ANA S I N描述的方案进行的.反应混合物(L总体积)含有gp C U 质粒,不含或含MGO、D A或GO(,m o lL),m o lL赖氨酸(L y s)和 m o lLC u S O.将反应混合物在 下孵育h后,在 静置 m i n以终止反应.随后通过琼脂糖凝胶电泳在T r i s a c e t a t eE D T A(T A E)缓冲液中对样品进行测定.质粒D NA条带用G o l d V i e w 染色,结束电泳后在紫外光下由成像仪进行可视化和拍摄.计算机模拟从P u b C h e m网站获得了MGO、D A和GO的S D F结构文件,对接前先将S D F文件转换为P D B格式.P r o t e i nD a t aB a n k(R C S B)获得了B D NA片段(P D BI D:B NA)的结构文件.分子对接:D i s c o v e r yS t u d i o用于分析D NA与配体的最佳结合构象.对D NA脱水加氢后,进行 次运行和 公差的分子对接,得分最高的具有最小能量结合的D NA复合物构象被选中为最佳对接构象.分子动力学(MD)模拟:G R OMA C S软件对c t D NA和c t D NA MGO复合体进行了 n s的分子动力学模拟.MD模拟中的一些重要参数,盒子:十二面体水溶剂;力场:Am b e r;离子:N a;步长:;压力:b a r;时间步长:f s;总电荷:e;温度:K.结果与讨论MG O/D A/G O与c t D N A的结合作用分析当嵌插剂与D NA结合时,通常产生巨大的减色效果,同时最大D NA吸收处的波长产生明显的红移.在凹槽模式情况下,UV吸收效应通常增加或减少可忽略的变化.图 A、B和C分别为不断增加MGO、D A和GO浓度后c t D NA的紫外吸收光谱.随着c t D NA中MGO、D A和GO的增加,在 n m处c t D NA溶液均出现较弱的减色效应,且峰位置未发生偏移,表明MGO、D A和GO均通过凹槽结合与c t D NA发生了相互作用.由于MGO、D A和GO本身几乎没有荧光,故利用不同温度下的紫外滴定实验以及B e n e s i H i l d e b r a n d方程,获得它们与c t D NA相互作用的结合常数:AAAD NAD C s D NAD NAD NAD C s D NAD NAKaD C s()第期吴健妹等:三种糖基化中间产物与小牛胸腺D NA相互作用的多光谱和分子动力学模拟其中D C s 代表MGO、D A或GO的浓度,A和A分别是不加和加入了不同量MG O、D A或G O后的c t D N A在 n m处的吸光度,为摩尔吸光系数,Ka为MG O、D A或G O与c t D N A的结合常数.MGO c t D NA、D A c t D NA或GO c t D NA体系的B e n e s i H i l d e b r a n d图在 、和 下均呈良好的线性关系(图 D、E和F).在 下,MGO、D A和GO与c t D NA的Ka值分别为 、和 Lm o l(表),这与沟槽结合剂的结合常数接近.随着温度升高,Ka值减 小,表 明 了MG O c t D N A、D A c t D N A或G O c t D N A复合物的稳定性随着温度的增加而降低.0.300.250.200.150.100.050(A)3203002802602402203400.280.260.240.22265260255250270111/nmAA0.280.210.140.070(B)3203002802602402203400.260.240.22265260255250270111/nmAA/n m/n m0.300.240.180.120.060(C)3002802602402203200.280.260.240.22265260255250270111/nmAA0-30-60-90-120-150(D)16 000A0/(A-A0)25 31 37 12 0008 0004 00020 0000/n ml/CMGO0-40-80-120-160-200(E)16 000A0/(A-A0)12 0008 0004 00020 00000-60-120-180-240-300(F)16 000A0/(A-A0)12 0008 0004 00020 000025 31 37 25 31 37 l/CD Al/CGOc(c t D NA)m o lL;c(MG O/D A/G O),a n d m o lLf o rc u r v e s,r e s p e c t i v e l y.图MG O(A)、D A(B)和G O(C)对c t D N A的紫外可见光谱的影响;不同温度下MG O(D)/D A(E)/G O(F)c t D N A复合物的B e n e s i H i l d e b r a n d曲线F i g E f f e c t so fMG O(A),D A(C)a n dG O(E)o nu l t r a v i o l e t v i s i b l e s p e c t r ao f c t D N A;B e n e s i H i l d e b r a n dc u r v e so fMG O(B)/D A(D)/G O(F)c t D N Ac o m p l e xa td i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s结合 过程的 热 力 学 参 数:焓 变(H)、熵 变(S)和自由能(G)可用于评估结合驱动力.它南昌大学学报(理科版)年们的值可使用以下公式计算:l o gKaH R TS R()G H TS()R是气体常数(Jm o lK).表中,G 的值为负值,表明MGO、D A或GO与c t D NA的结合过程是自发的.通常,种分子间作用力:范德华力、氢键、静电力和疏水相互作用,参与c t D NA和 配 体 小 分 子 之 间 的 相 互 作 用.H 和S 的负值表明氢键和范德华力是维持MGO c t D NA、D A c t D NA或GO c t D NA复合物稳定性的主要结合力.表三个温度下MG O、D A和G O与c t D N A作用的结合常数(Ka)及热力学参数T a b B i n d i n gc o n s t a n t s(Ka)a n dt h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r so fMG O,D Aa n dG Ow i t hc t D N Aa t t h r e e t e m p e r a t u r e sK/Ka/(Lm o l)RH/(k Jm o l)S/(Jm o lk)G/(k Jm o l)MGO D A G O R为Ka的相关系数.钠离子效应D NA螺旋结构外侧的带负电荷的磷酸基团可以与正离子或多种小分子发生静电结合.D NA 小分子复合体系中若正离子含量不断升高,会减少相邻核苷酸间的静电斥力,与静电结合在D NA上的小分子发生竞争作用,削弱小分子与D NA间的作用,而显著改变复合体系的吸光度值,由此可判断小分子与D NA间是否存在静电作用.图 A、B和C中,随着N a的不断增加,c t D NA及MGO c t D NA、D A c t D NA或GO c t D NA体系的A n m基本不变,表明静电作用模式在MGO、D A或GO与c t D NA相互结合过程中的作用极微小.0.270.240.210.180.15A(A)1.51.20.90.60.301.8only ctDNAMGO+ctDNA0.300.270.240.210.180.15A(B)1.51.20.90.301.80.6only ctDNADA+ctDNAN a C l/(m o lL)N a C l/(m o lL)20151051/(A0-A)(D)1.21.00.80.40.201.4MGO+dsDNAMGO+ssDNA0.60.270.240.210.180.15A(C)1.51.20.90.301.80.6only ctDNAGO+ctDNAN a C l/(m o lL)/D NA/(m o lL)第期吴健妹等:三种糖基化中间产物与小牛胸腺D NA相互作用的多光谱和分子动力学模拟20151051/(A0-A)(E)1.21.00.80.40.201.4DA-dsDNADA-ssDNA0.620151051/(A0-A)(F)1.21.00.80.40.201.4GO-dsDNAGO-ssDNA0.6/D NA/(Lm o l)/D NA/(Lm o l)(A),(B),(C):c(c t D NA)m o lL;c(MG O/D A/G O)m o lL;c(N a C l),a n d m o lL.(D),(E),(F):c(MG O/D A/G O)m o lL;c(s s c t D NA/s s c t D NA),a n d m o lL.图离子水平对c t D N A的紫外吸收的影响:MG O(A)、D A(B)和G O(C);MG O(D)、D A(E)和G O(F)与单双链c t D N A的结合作用F i g E f f e c t so f i o no nU Va b s o r p t i o no f c t D N A:MG O(A),D A(B)a n dG O(C);B i n d i n go fMG O(D),D A(E)a n dG O(F)t os i n g l e/d o u b l e s t r a n d e dc t D N A单双链c t D N A结合分析MGO、D A和GO对s s c t D NA和d s c t D NA的结合作用如图 D、E和F所示,并通过方程计算MGO、D A和GO与d s c t D NA和s s c t D NA相互作用的Ka值.AAAAKa(AA)DNA()其中D NA 为单双链c t D NA的浓度,A表示MGO c t D NA、D A c t D NA或GO c t D NA复合物在 n m处的吸光度,A和A分别为不含或含有单双链c t D NA的MGO、D A或GO体系在 n m处的吸光度.d s c t D NA体系中均呈现出比s s c t D NA更大的斜率,这意味着MGO、D A或GO存在下对s s c t D NA体系紫外吸光的影响更明显.MGO d sc t D NA、D A d s c t D NA或GO d s c t D NA体系的Ka值分别为 、和 Lm o l,MGO s sc t D NA、D A s sc t D NA或GO s sc t D NA体系中的Ka值分别为 、和 Lm o l,s s c t D NA对反应更有利,表明MGO、D A或GO和c t D NA之间的结合方式可能是沟槽结合.D N A热变性分析随着温度的升高,D NA碱基间的氢键断裂,双螺旋结构遭受破坏.当D NA受热解链剩余一半不规则卷曲状态的螺旋结构时的温度即为D NA的熔点,也称 引 起D NA变 性 的 温 度.当 小 分 子 插 入D NA的螺旋结构中,阻碍双链结构向单链结构的转变,D NA的熔点会升高 以上,若通过沟槽和静电方式结合,则熔点变化不显著.测得c t D NA的熔点为 ,结合MGO、D A和GO后c t D NA的熔点温度分别改变了、和(图 A、B和C),熔点变化不显著,从而排除了MG O、D A或G O通 过 嵌 插 方 式 与c t D N A结 合.MU KH E R J E E报道 药物小分子卡托普利结合到D N A的沟区,使D N A的熔点温度仅升高了.fss(A)8040100ctDNActDNA+MGO601.20.90.60.302077.79 78.73 fss(B)8040100ctDNActDNA+DA601.20.90.60.302078.73 81.02 K/K/南昌大学学报(理科版)年fss(C)8040100ctDNActDNA+GO601.20.90.60.302078.73 81.02(/0)1/3(D)8312Hoechst 33258MGO62.01.51.00.500K/CD A/Cc t D NA(/0)1/3(E)9312Hoechst 33258DA62.01.51.00.500(/0)1/3(F)9312Hoechst 33258GO62.01.51.00.500CD A/Cc t D NACGO/Cc t D NA(A),(B),(C):c(c t D NA)m o lL;c(MG O/D A/GO)m o lL;(D),(E),(F):c(c t D NA)m o lL;c(MGO/D A/G O),a n d m o lL.图MG O(A)、D A(B)和G O(C)存在下,c t D N A的热熔解曲线;MG O(D)、D A(E)和G O(F)对c t D N A相对粘度的影响F i g T h e t h e r m a lm e l t i n gc u r v eo f c t D N Ai nt h ep r e s e n c eo fMG O(A),D A(B)a n dG O(C);E f f e c t so fMG O(D),D A(E)a n dG O(F)o nt h er e l a t i v ev i s c o s i t yo f c t D N AD N A粘度实验D NA溶液的粘度与D NA螺旋结构中相邻碱基对间的距离有关.小分子若嵌入D NA内,会扩大碱基对之间的距离,使D NA体系的粘度明显增加,其他结合模式下D NA溶液粘度则变化较小.图 D、E和F显示随着MGO、D A或GO的不断加入,D NA体系的粘度未见明显变化,表明MGO、D A或GO与c t D NA间是凹槽结合方式.WANG等 发现叔丁基对苯二醌(T B Q)的加入也基本不改变D NA的粘度,并结合多项实验证明它是一种沟槽 结 合 剂.经 典D NA沟 槽 结 合 剂H o e c h s t 在较高浓度下使D NA溶液粘度些许增加,这是由于浓度效应引起的.竞争实验竞争实验是利用经典结合剂来测定小分子物质与c t D NA结合模式的一种便利、有效的方法.H 和E B分别是已知典型的沟槽结合剂和嵌插结合剂,当它们与D NA结合后,D NA的碱基堆积增强,复 合 体 系 因 此 显 示 出 较 强 的 荧 光.S h i等 报道除草剂磺酰磺隆与c t D NA是沟槽结合模式,它会显著降低H c t D NA体系的荧光,而对E B c t D NA的荧光基本没影响.如图 A、B和C所示,MGO、D A或GO对E B c t D NA体系的荧光竞争率显著低于H c t D NA复合溶液.在加入MGO、D A或GO浓度达到 m o lL时,对H c t D NA体系的荧光竞争率分别为 、,对E B c t D NA体系的荧光竞争率分别为、.以上结果表明MGO、D A或GO在与c t D NA结合时均能竞争取代H ,进入D NA的沟区.种 D C s对H c t D NA体系的竞争能力为:MGOD AGO,结合紫外滴定实验结果分析,推测这可能和它们与c t D NA的结合亲和力有关.C D光谱分析圆二色谱有助于分析与配体小分子结合前后D NA构象的变化.游离c t D NA在 n m处产生一个由碱基对堆积形成的C D正峰,以及 n m处由D NA右螺旋结构形成的负峰.如图 D所示,随着体系中MGO的浓度增加,c t D NA峰形没有显著变化,负峰和正峰强度均降低,且发生红移,第期吴健妹等:三种糖基化中间产物与小牛胸腺D NA相互作用的多光谱和分子动力学模拟说明MGO与c t D NA的沟区结合,使D NA结构发生了改变,螺旋度降低,碱基堆积度减少.李旭报道与抗微生物兽药氟苯尼考沟槽结合后,D NA的圆二色谱出现类似现象.图 E和F中,结合不同浓度D A或GO后,c t D NA的C D图谱峰形及峰强度未见较大变化,进一步证明D A或GO与c t D NA通过沟槽结合发生非共价相互作用.氟氧化吲哚衍生物与c t D NA沟槽结合后对D NA的C D光谱的影响也较小.MGO比D A和GO显示出对D NA结构更强的影响,这可能归因于MGO与c t D NA的结合能力比D A和GO强.4536271890/%(A)3.002.251.5003.75EB+ctDNA systemH33258-ctDNA system0.7528211470/%(B)3.002.251.5003.75EB-ctDNA systemH33258-ctDNA system0.75MG O/(m o lL)D A/(m o lL)25.012.50-12.5-25.0CD/mdeg(D)300280260320only ctDNActDNA+3.0 mM MGOct DNA+5.0 mM MGO240161284/%(C)3.002.251.5003.75EB-ctDNA systemH33258-ctDNA system0.75GO/(m o lL)/n m24120-12-24CD/mdeg(E)300280260320only ctDNActDNA+3.0 mM DAct DNA+5.0 mM DA24024120-12-24CD/mdeg(F)300280260320only ctDNActDNA+3.0 mM GOct DNA+5.0 mM GO240/n m/n m(A),(B),(C):c(c t D NA)m o lL;c(H /E B)m o lL;c(MG O/D A/GO),a n d m o lL(D),(E),(F):c(c t D NA)m o lL;c(MGO/D A/G O)a n d m o lL图MG O(A)、D A(B)和G O(C)对荧光探针的竞争百分比;与MG O(D)、D A(E)和G O(F)作用后的c t D N A的圆二色性光谱F i g C o m p e t i t i o np e r c e n t a g eo fMG O(A),D A(B)a n dG O(C)t of l u o r e s c e n tp r o b e s;C i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r ao f c t D N Aa f t e r i n t e r a c t i o nw i t hMG O(D),D A(E)a n dG O(F)D N A损伤分析p U C 质粒以超螺旋环状结