特地唑胺对利奈唑胺不敏感革兰阳性球菌的体外抗菌活性研究.pdf

：临床实验研究特地唑胺对利奈唑胺不敏感革兰阳性球菌的体外抗菌活性研究高硕，徐学静，纪玥玥，贾佳，张燕，周万青，沈瀚（南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京）摘要：目的 检测利奈唑胺不敏感革兰阳性球菌对新型噁唑烷酮类抗菌药物特地唑胺的敏感性，并探讨特地唑胺不敏感菌株的耐药机制。方法 收集临床分离非重复革兰阳性球菌 株，包括利奈唑胺耐药头状葡萄球菌 株、利奈唑胺敏感头状葡萄球菌 株、利奈唑胺不敏感肠球菌 株、利奈唑胺敏感肠球菌 株、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 株、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 株、利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌 株。采用微量肉汤稀释法检测所有菌株对特地唑胺和利奈唑胺的最小抑菌浓度（），并比较两种药物的抗菌活性。采用 结合 测序技术分析特地唑胺不敏感革兰阳性球菌、基因携带情况及 区突变。结果 利奈唑胺耐药头状葡萄球菌（）对特地唑胺的 值为 ；利奈唑胺不敏感肠球菌（值 ）中，特地唑胺的敏感率为，其 值为 ；株利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌对特地唑胺敏感，值为 。特地唑胺对利奈唑胺敏感的金黄色葡萄球菌和肠球菌的 值均为 ，对利奈唑胺敏感头状葡萄球菌的 值为 。耐药基因分析显示，特地唑胺耐药头状葡萄球菌 基因携带率为（），区 的突变率为；特地唑胺不敏感肠球菌 基因携带率为（），显著高于特地唑胺敏感株的（）；株利奈唑胺耐药特地唑胺敏感的金黄色葡萄球菌携带 基因。结论 对于利奈唑胺不敏感的革兰阳性球菌，特地唑胺的抗菌活性是利奈唑胺的 倍，其耐药机制可能与携带 基因及 区 突变有关。关键词：特地唑胺；利奈唑胺；革兰阳性球菌；抗菌活性；耐药机制中图分类号：文献标志码：，（，）：，（），（），（），（），（），（）（）（），（）（：），（），（），（，），：；临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：南京大学中国医院改革发展研究院课题；南京鼓楼医院医学发展医疗救助基金会资助项目（）。作者简介：高硕，年生，女，主管技师，硕士，主要从事微生物耐药机制研究。通信作者：周万青，副主任技师，：。利奈唑胺作为第一代噁唑烷酮类抗菌药物，能有效的治疗革兰阳性菌感染，尤其对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（，）以及万古霉素耐药肠球菌（，）等。然而利奈唑胺耐药菌株的出现，给临床治疗带来了严峻的挑战。年中国细菌耐药监测网（）数据显示，甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺的耐药率为，粪肠球菌对利奈唑胺的耐药率达。此外，利奈唑胺存在单胺氧化酶抑制作用及潜在的血液和骨髓毒性作用。因此，亟需寻找新型抗菌药物以应对难治性感染。特地唑胺为第二代噁唑烷酮类抗菌药物，年，磷酸特地唑胺获得美国食品药品监督管理局（）批准，可用于临床成人急性细菌性皮肤及皮肤结构感染的治疗。与利奈唑胺相比，特地唑胺表现出更强的体外抗菌活性，同时具有生物利用度高、不良反应小等优点。然而，特地唑胺对于利奈唑胺耐药革兰阳性菌株的抗菌作用和耐药机制仍缺少大量的研究数据。细菌对噁唑烷酮类抗菌药物耐药主要由 区 突变，以及由、及 等基因介导。本研究通过筛选临床分离利奈唑胺不敏感的葡萄球菌和肠球菌，采用微量肉汤稀释法比较利奈唑胺和特地唑胺的体外抗菌活性，同时对菌株可能的耐药机制进行探讨，以期为特地唑胺的临床应用提供实验室的参考依据。材料和方法 菌株来源 收集并筛选南京鼓楼医院 至 年临床分离非重复革兰阳性球菌共 株，菌株分离自临床血液、尿液、胸腹水、分泌物、胆汁、引流液及导管头样本。采用 全自动微生物分析仪进行菌种鉴定并经 质谱分析复核，采用 及配套 卡进行常规药物敏感性检测。参照美国临床和实验室标准化协会（）年标准，依据菌株对利奈唑胺初筛最小抑菌浓度（）值，共纳入利奈唑胺耐药头状葡萄球菌（，）株、利奈唑胺敏感头状葡萄球菌（，）株、利奈唑胺不敏感肠球菌（，）株、利奈唑胺敏感肠球菌（，）株、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（，）株、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（，）株、利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌（，）株。金黄色葡萄球菌、粪肠球菌 为本实验室保存菌株。主要仪器和试剂 全自动鉴定药敏分析仪及配套 鉴定卡、药敏卡、质谱分析及配套试剂（法国生物梅里埃公司），扩增仪、电泳仪（美国 公司），型凝胶成像系统（上海 公司），基因测序仪（美国 公司）。利奈唑胺和特地唑胺原药药物（美国 公司），孔微量稀释板（美国 公司），肉汤（英国 公司），二甲基亚砜（德国 公司，采用 溶解利奈唑胺和特地唑胺药物并制备储存液），（上海近岸蛋白质科技公司），琼脂粉 （西班牙 公司），（北京索莱宝科技公司）。引物合成及序列测定由上海生工生物工程公司完成。体外药物敏感试验 根据美国临床和实验室标准化协会（）文件要求，采用微量肉汤稀释法检测特地唑胺和利奈唑胺对 株革兰阳性球菌的 值。采用 溶解药物并制备浓度为 的储存液，经 肉汤倍比稀释，获得 浓度范围。挑取过夜培养的血平板上菌落，生理盐水调整菌液浊度为 麦氏单位，再用 肉汤调整菌液浓度为，将不同浓度药物和菌液各 加入 孔微量稀释板中，混匀后置于 培养。设置菌液对照孔和空白对照孔，金黄色葡萄球菌（）和粪肠球菌（）作为药敏试验质控菌株。根据 文件中抗微生物药敏试验执行标准，利奈唑胺药物敏感折点：葡萄球菌 为敏感，为耐药；肠 球 菌 为 敏 感，为中介，为耐药。特地唑胺药物敏感性试验折点：金黄色葡萄球菌 为敏感，为中介，为耐药；粪肠球菌 为敏感。头状葡萄球菌参考 标准，为敏感。耐药基因扩增及测序参照文献合成临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基因、基因以及 功能区基因扩增引物，引物序列见表。采用 反应对特地唑胺敏感株和耐药株进行目的基因扩增，总反应体系为 ，包括 ，模板，上、下游引物（）各 ，。反应条件：；，共 个循环；。产物经 琼脂糖凝胶电泳，阳性扩增产物纯化后采用 基因测序仪进行 双向测序（由上海生工生物工程公司完成），结果经 与 进行比对。表 引物序列及产物大小目的基因引物序列（）产物长度（）：统计学分析采用 统计软件进行数据分析，率的比较采用 检验，以 为差异有统计学意义。结果 特地唑胺和利奈唑胺对头状葡萄球菌的体外抗菌活性 株 菌株对利奈唑胺的 值均为 ，对特地唑胺 值均为 。特地唑胺作用 的抗菌活性是利奈唑胺的 倍。株 对利奈唑胺 值分别为 和 ，对特地唑胺的 值均为 。特地唑胺作用 的抗菌活性是利奈唑胺的 倍。结果见表。特地唑胺和利奈唑胺对肠球菌的体外抗菌活性 株 药敏结果显示，特地唑胺的抗菌活性是利奈唑胺的 倍，值分别为 和 。其中 株利奈唑胺不敏感粪肠球菌和 株利奈唑胺不敏感屎肠球菌对特地唑胺敏感（，）。株 中，特地唑胺的抗菌活性（）是利奈唑胺（）的 倍。表 特地唑胺与利奈唑胺对临床分离 株革兰阳性球菌体外抗菌活性比较菌株和药物（）（）（）（）（）（）（）（）注：，利奈唑胺耐药头状葡萄球菌；，利奈唑胺敏感头状葡萄球菌；，利奈唑胺不敏感肠球菌；，利奈唑胺敏感肠球菌；，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌；，利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌；，特地唑胺；，利奈唑胺；，药物最小抑菌浓度；，抑制 实验菌株生长的最低药物浓度；，抑制 实验菌株生长的最低药物浓度。，利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌仅有 株，特地唑胺和利奈唑胺的 值分别为 和 。特地唑胺和利奈唑胺对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性特地唑胺对（）和（）均敏感，体外抗菌活性（）是利奈唑胺（）的 倍。临床分离株利奈唑胺耐药（）对特地唑胺敏感（）。特地唑胺不敏感革兰阳性球菌耐药基因结果 特地唑胺不敏感肠球菌菌株 基因的携带率为（）。在特地唑胺敏感的肠球球菌中，有 株利奈唑胺耐药肠球菌携带 基因，占比（），显著低于特地唑胺不敏感菌株（）。特地唑胺耐药头状葡萄球菌 基因携带率为（），测序结果显示 区 突变率为，未检出 基因。除 株特地唑胺敏感利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌携带 基因外，未发现携带、基因的特地唑胺敏感头状葡萄球菌和金黄色葡萄球菌，测序临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，结果也未发现 区 突变位点。讨论 噁唑烷酮类药物是治疗临床严重感染性疾病的重要选择。特地唑胺与利奈唑胺相比，在药物结构上进行了优化，口服利用度增加，同时具有半衰期长，不良反应少等优点。本研究结果显示，对于利奈唑胺敏感金黄色葡萄球菌和肠球菌，特地唑胺的抗菌活性是利奈唑胺的 倍，对于利奈唑胺敏感头状葡萄球菌，特地唑胺的抗菌活性是利奈唑胺的 倍。有研究表明特地唑胺对于革兰阳性球菌的体外抗菌活性优于利奈唑胺，原因可能与特地唑胺结构的改变有关。与利奈唑胺相比，特地唑胺 环位置的双芳环增强了与核糖体肽基转移酶中心 位点的作用，环的优化增强了其与核糖体的结合，有效的抑制蛋白质的合成。另外，笔者发现特地唑胺对于利奈唑胺不敏感的革兰阳性球菌表现出更高的抗菌活性。利奈唑胺耐药的头状葡萄球菌中，特地唑胺的抗菌活性是利奈唑胺的 倍。这与国内一项多中心研究结果具有相似性。本研究在筛选出的 株利奈唑胺耐药金葡菌药敏结果中发现，特地唑胺的 值明显低于利奈唑胺（分别为 和 ），表现出较好的抗菌优势。这一结果与 等的研究相一致。对于利奈唑胺不敏感肠球菌，特地唑胺的抗菌活性是利奈唑胺的 倍（值为 ），敏感率为。与本次试验结果相似，有学者对 株利奈唑胺耐药的 进行特地唑胺敏感性的检测，发现特地唑胺对所有菌株的 值均低于利奈唑胺（），但仍高于 （敏感折点）。这一结果可能与噁唑烷酮类药物的特殊耐药机制有关。本课题组前期研究，发现，导致凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺耐药的主要机制是获得 基因或 突变，而肠球菌的耐药主要是由 基因介导。另有研究表明，菌株对特地唑胺耐药的形成可能与染色体耐药决定基因有关，而非质粒介导机制和携带 基因所介导。本研究对特地唑胺耐药菌株携带 基因、基因及 区突变情况调查显示，特地唑胺耐药头状葡萄球菌 基因携带率为，区 的突变率为，未检出 基因。株携带 基因的利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌对特地唑胺敏感，表明特地唑胺对携带 基因的利奈唑胺耐药菌株可能有更好的抗菌优势，其不敏感可能与 区突变有关。特地唑胺在结构上的优化使其能克服 基因介导的耐药。对肠球菌的研究发现，特地唑胺不敏感肠球菌菌株 基因的携带率为，显著高于敏感株的携带率。与 等的研究结果相似，基因阳性可能是导致特地唑胺对利奈唑胺耐药肠球菌非敏感的机制之一。综上所述，本研究证实特地唑胺对于临床分离葡萄球菌和肠球菌具有更好的体外抗菌活性，尤其是利奈唑胺不敏感菌株，具有潜在的临床应用前景。其耐药性可能与 基因及 区 突变介导有关，对携带 基因的利奈唑胺耐药菌株具有更好的抗菌潜力。然而，特地唑胺的抗菌效果及耐药性产生的分子机制仍需要大量的临床和实验数据支持。面对耐药革兰阳性菌导致的难治性感染的挑战，进一步提高噁唑烷酮类药物的抗菌活性，延缓耐药性和阻断耐药传播将是今后研究的方向。参考文献，：，：，：胡付品，郭燕，朱德妹，等 年 中国细菌耐药监测 中国感染与化疗杂志，（）：胡宇华，赵欣彤，李天磊，等 噁唑烷酮类抗菌药物研究进展 药学学报，（）：（），（）：，（）：，（），（）：，（）：，临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，（）：，：，（）：（），（）；，周万青，宋熙晶，生媛，等 多中心耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌耐药机制及同源性分析 临床检验杂志，（）：董睛睛，缪丽燕，张秀红 新型噁唑烷酮类抗菌药：特地唑胺 中国新药与临床杂志，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）读者作者编者临床检验杂志可直接使用缩略形式的常用词汇 对于以下医学检验工作者比较熟悉的常用词汇，本刊允许在论文撰写中直接使用其缩略语，可以不标注中文。磷酸盐缓冲液（）白细胞介素（）乙型肝炎病毒表面抗原（）核糖核酸（）肿瘤坏死因子（）乙型肝炎病毒 抗原（）脱氧核糖核酸（）干扰素（）抗 抗体（抗）聚合酶链反应（）人类白细胞抗原（）抗 抗体（抗）酶联免疫吸附试验（）系统性红斑狼疮（）抗 抗体（抗）免疫球蛋白（）类风湿关节炎（）严重急性呼吸综合征（）免疫球蛋白（）人类免疫缺陷病毒（）红细胞（）免疫球蛋白（）甲型肝炎病毒（）白细胞（）免疫球蛋白（）乙型肝炎病毒（）血红蛋白（）免疫球蛋白（）丙型肝炎病毒（）临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，