人参多糖对肠上皮屏障的增强作用及其机制.pdf

人参多糖对肠上皮屏障的增强作用及其机制刘乙婷朱惠彬陈婉霞王安荣胡玲李茹柳(广州中医药大学科技创新中心、脾胃研究所广州)摘 要 目的 观察人参多糖对大鼠小肠上皮细胞()渗透性、黏附连接蛋白表达及细胞钙离子()水平的影响探讨益气健脾中药人参肠黏膜保护作用机制 方法设置不同实验条件正常含钙培养、含钙培养二氟甲基鸟氨酸()、无钙培养以观察人参多糖的作用 小室酚红透过法检测细胞间渗透性 法检测黏附连接蛋白(、和)表达激光共聚焦显微镜观察细胞 水平 结果正常含钙培养时人参多糖(、下同)能降低细胞间渗透性、提高、和 表达及细胞 水平(.或.)含钙培养 负荷时细胞间渗透性增加、和 表达及 水平降低(.或.)人参多糖可改善 所致的细胞间渗透性增加、和 表达及 水平降低(.或.)无钙培养可致细胞间渗透性增加及、和 表达降低(.或.)人参多糖可改善无钙培养所致的细胞间渗透性增加及 和 表达下降(.或.)结论 人参多糖具有增强肠上皮屏障的作用其机制与提高细胞 水平及黏附连接蛋白表达有关关键词 人参多糖细胞间渗透性钙离子黏附连接蛋白上皮屏障中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()()().()().()()(.)()(.)()(.)(、)(.)(.).中医脾胃功能包含了现代医学肠道屏障的作用 脾虚证患者可见胃肠黏膜屏障损伤的病理表现如黏膜颗粒样隆起、桥状黏膜及肠黏膜皱襞浅薄等 黏膜屏障损伤是胃肠疾病的重要发病机制之一而肠道屏障的维持和修复是肠内稳态的重要因素 肠上皮屏障稳定性取决于其连接复合体的活性连接复合体由紧密连接、黏附连接和桥粒等组成控制上皮细胞与细胞间的连接和屏障功能其中黏附连接的优先形成对上皮细胞间紧密连接的组装至关重要黏附连接水平的改变调节着紧密连接复合体的稳 定性并影响肠上皮细胞旁的通透性 黏附连接以(依赖蛋白)为黏着受体与连环蛋白(和)结合形成 钙粘蛋白/连环蛋白复合体通过介导细胞黏附和信号转导对维持正常上皮细胞形态和结构完整性起着重要作用 多胺通过不同的细胞信号通路调节细胞间连接蛋白的表达从而影响细胞间渗透性对于维持胃肠道黏膜完整性具有重要作用益气健脾是脾虚证的主要治则益气健脾中药能改善脾虚证患者的肠黏膜屏障功能 人参是益气健脾中药的代表药之一它是独参汤、参附汤、生脉散、四君子汤和归脾汤等著名方剂的主要组成药物 人参含有皂苷、多糖、挥发油、多肽、微量元素等成分人参多糖是其主要有效成分之一 本课题组研究表明人参为君药的四君子汤(水提物和多糖)对吲哚美辛所致大鼠小肠黏膜损伤有改善作用机制与其提高小肠黏膜多胺(精脒)含量、降低血浆 乳酸(肠通透性指标)、提高小肠黏膜 含量及紧密连接和黏附蛋白蛋白表达有关人参多糖能减轻吲哚美辛所致的大鼠小肠黏膜损伤提高大鼠小肠黏膜 含量促进大鼠小肠(十二指肠)上皮细胞迁移人参多糖还能促进小肠上皮细胞()迁移作用机制与其影响多胺信号通路 调控有关 综合本课题组在动物和细胞的研究结果表明人参多糖有肠黏膜保护作用机制与其调节多胺、连接蛋白表达及上皮屏障有关 本研究在此基础上聚焦人参多糖对细胞间黏附连接蛋白及上皮屏障的作用观察在正常培养、二氟甲基鸟氨酸()负荷(抑制多胺合成)和无钙培养等不同实验条件下人参多糖对相关指标的影响进一步探讨人参多糖的肠黏膜保护机制 材料与方法.材料.受试药 人参药材为五加科植物人参(生晒参)收稿日期 修回日期 基金项目国家自然科学基金资助项目()广州市科技计划项目()广州中医药大学一流学科重点项目(广中医校办 号)作者简介 刘乙婷()女广东揭阳人在读硕士研究方 向:益 气 健 脾 中 药 作 用:.通信作者 李茹柳()女广东东莞人教授博士研究方向:益气健脾中药作用 电话:.干燥根由河北楚风中药饮片有限公司提供(批号:)人参饮片经水提醇沉、法去蛋白、纤维素层析柱纯化得到人参多糖提取物即为本实验受试药人参多糖其得率.苯酚硫酸法测得糖含量.高效凝胶渗透色谱法测定人参多糖提取物的平均分子质量为.并 用 气 相 色 谱质 谱()分析了人参多糖提取物的单糖组成提示其为非均一性杂多糖 实验剂量以人参多糖冻干粉质量计算实验时以磷酸盐缓冲液配成所需浓度经孔径.滤膜滤过 保存备用.细胞株大鼠小肠隐窝细胞()(货号:批号:)由美国组织培养库()提供选择 代细胞进行实验.主要试剂胎牛血清(公司批号:)青霉素链霉素双抗(批号:)、达尔伯克必需基本培养基()高糖培养基(批号:)、无钙培养基(批号:)、汉克平衡盐溶液(批号)、.胰蛋白酶乙二胺四乙酸()(批号:)均购自美国 公司(批号:)、(批号:)均购自美国 公司磷酸盐缓冲液(批号:美国 公司)腐胺(批号:美国 公司)小 鼠 单 克 隆 抗 抗 体(批 号:)、兔 单 克 隆 抗 抗 体(批 号:)、兔 单 克 隆 抗 抗 体(批 号:)、山羊抗小鼠(批号:)、山羊抗兔(批号:)均购自英国 公司 小室(批号:美国 公司).仪器 型 培养箱(美国 公司)型超纯化水系统(美国 公司)型分析天平(日本岛津公司感量:.、.)电泳仪成像仪(美国伯乐公司)徕卡 型共聚焦荧光显微镜(德国 公司)酶标仪(美国 公司).方法.细胞培养 细胞复苏后接种于 培养瓶以含 胎牛血清、青霉素链霉素双抗的 培养基、饱和湿度下培养 隔天换液细胞生长至约 时胰酶消化细胞以进行后续医药导报 年 月第 卷第 期实验.酚红透过实验检测细胞间渗透性密度接种细胞于 培养瓶按不同实验条件分别加入含相应药物的完全培养基 无负荷实验:正常含钙培养组加入完全培养基 阳性对照药组加入含终浓度 腐胺()的完全培养基 受 试 药 组 加 入 含 终 浓 度、人参多糖的完全培养基 负荷实验:各组加药方法同“无负荷实验”模型对照组以 (.)造 模 阳 性 对 照 药 组 为受试药组为 人参多糖各剂量 无钙培养实验:各组加药方法同“无负荷实验”模型对照组以无钙培养液造模阳性对照药组为含 的无钙培养液受试药组为含人参多糖各剂量的无钙培养液 培养 后各组细胞消化离心重悬以 密度均匀接种于 小室分别加入各组受试药于上室 下室 继续培养 后磷酸盐缓冲液冲洗上、下室 次吸净残余磷酸盐缓冲液快速往上室加 无血清的酚红培养基下室加入磷酸盐缓冲液 培养箱培养 后分别取出上、下室溶液各 于 孔板酶标仪 波长下检测溶液吸光度(值)酚红透过率()(下室溶液 值/上室溶液 值).法检测蛋白表达细胞以 密度接种于规格 培养皿每孔加入完全培养基 培养 后用 移液器吸头在皿底作“十”字划痕磷酸盐缓冲液冲洗 次后正常含钙培养组加入低浓度血清培养基(胎牛血清以避免细胞增殖对观察受试药作用的影响)阳性对照药组加入含终浓度为 的低浓度血清培养基 受试药组加入含终浓度、人参多糖的低浓度血清培养基 负荷实验:模型对照组以()造模 阳性对照药组为 受试药组为人参多糖各剂量 无钙培养实验:各组加药方法同“无负荷实验”模型对照组以无钙培养液造模阳性对照药组为含 的无钙培养液受试药组为含人参多糖各剂量的无钙培养液 培养 后提取细胞总蛋白二喹啉甲酸试剂盒测定样品蛋白浓度上样电泳转膜脱脂牛奶封闭 洗膜后一抗孵育过夜一抗选用()、()、()洗膜后二抗孵育 、选用山羊抗小鼠二抗()、选择山羊抗兔二抗()洗膜后加入电化学发光液避光孵育数秒成像仪观察蛋白条带 软件分析条带灰度值计算目的蛋白与 蛋白条带的灰度值之比即为目的蛋白的相对表达量.激光共聚焦显微镜检测细胞 水平 细胞复苏后接种于 培养瓶于培养箱以 、饱和湿度、条件培养隔天换液细胞生长至 时胰酶消化细胞以 密度每孔完全培养基 接种于激光共聚焦培养皿继续培养 用 移液器吸头沿皿底划一直线划痕磷酸盐缓冲液冲洗 次正常含钙培养组加入完全培养基.阳性对照药组加入含终浓度为 的完全培养基.受 试 药 组 加 入 含 终 浓 度 为、人参多糖的完全培养基.负荷实验:模型对照组以(.)造模阳性对照药组为 受试药组为人参多糖各剂量 培养 后 液冲洗 次每皿加入终浓度为 的/探针装载液 培养箱中避光孵育 吸弃装载液 液冲洗细胞 次加入适量 液培养箱中避光孵育 激光共聚焦显微镜下打开 激光源放大 倍先在明场下找到划痕区域附近的视野再进行荧光图片采集每皿选择 个视野采集荧光照片.统计学方法所有数据用.版软件进行统计学分析 软件绘制统计图 计量资料先进行正态检验符合正态分布进行方差齐性检验方差齐采用单因素方差分析()组间两两比较采用 检验不符合方差齐则采用 检验 以.为差异有统计学意义 结果.人参多糖对细胞间渗透性的影响正常含钙培养、含钙培养 负荷、无钙培养 种实验条件下人参多糖对细胞间渗透性的药效作用见图 结果显示正常含钙培养时人参多糖(、)可降低细胞间渗透性(.)提示人参多糖有增强细胞屏障的作用 负荷可增加细胞间渗透性(.)即多胺减少可对细胞屏障产生不利影响人参多糖(、)对 所致细胞间渗透性增加有干预作用(.或.)无钙培养可致细胞间渗透性增加(.)即胞外缺乏(因缺乏胞外 内流途径而使胞内 水平降低)可影响细胞屏障功能人参多糖(、)对无钙培养所致的细胞间渗透性增加有干预作用(.)以上结果提示人参多糖增强和改善细胞屏障的作用与其 .正常对照组.模型对照组.阳性对照药组.人参多糖 组.人参多糖 组.人参多糖 组 与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.图 人参多糖在不同实验条件下对细胞间渗透性的影响().()影响多胺和 调节有关.人参多糖对细胞黏附连接蛋白表达的影响.人参多糖对细胞黏附连接蛋白表达的影响正常含钙培养条件下人参多糖对细胞黏附连接蛋白表达的影响结果见图 可见正常含钙培养时人参多糖(、或 )可提高、和 蛋白表达(.或.)表明人参多糖有提高黏附连接蛋白、和 表达的作用.人参多糖对细胞黏附连接蛋白表达的影响 负荷培养条件下人参多糖对细胞黏附连接蛋白表达的影响结果见图 可见 负荷可降低黏附连接蛋白 和 表达(.或.)人参多糖()对 负荷所致的 和 表达降低有干预作用(.)提示人参多糖可改善 负荷所致的黏附连接蛋白 和 表达降低.人参多糖对细胞黏附连接蛋白表达的影响无钙培养条件下人参多糖对细胞黏附连接蛋白表达的影响结果见图 可见无钙培养可致、和 表达下降(.)人参多糖(、)对 和 蛋白表达降低有干预作用(.或.)提示胞外 缺乏可致黏附连接蛋白(和)表达降低人参多糖对无钙培养所致的 和 蛋白表达降低有一定改善作用.人参多糖对细胞 水平的影响无负荷和 负荷时人参多糖对细胞 水平的影响见图 各组荧光强度(反映细胞 水平)结果显示无负荷时人参多糖(、)能提高细胞 水平(.)荧光结果显示 负荷可致细胞 水平降低(.)人参多糖(、)对 所致 水平降低有改善作用(.)结果表明人参多糖有提高 水平的作用 讨论人参味甘、微苦具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效是益气健脾中药的代表药 人参的药理作用包括抗肿瘤、抗菌、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力、调节神经功能等对胃肠黏膜也有保护作用 临床研究表明肠黏膜屏障功能受损与多种病变有关(包括肠道和全身疾病)某些临床情况下黏附连接比紧密连接更脆弱黏附连接在上皮屏障功能异常的病理机制中有重要意义钙黏蛋白是黏附连接的主要组成部分其通过降低细胞连接界面的“界面张力”来介导“接触扩张”的 端胞外区对 有高度敏感性其通过与 特异性结合发挥黏附作用 与形成/复合体再通过 医药导报 年 月第 卷第 期 .正常对照组.阳性对照药组.人参多糖 组.人参多糖 组.人参多糖 组 与正常对照组比较.与正常对照组比较.图 人参多糖对黏附连接蛋白表达的影响(正常含钙培养)().()()共同形成 钙黏蛋白连环蛋白复合体从而与细胞骨架连接 多胺对于正常的肠道上皮屏障功能是 必 不 可 少 的 抑 制 细 胞 多 胺 会 降 低蛋白表达增加细胞旁通透性而 负荷的同时给予外源性多胺可阻止这一现象多胺耗竭降低了细胞 水平可致 蛋白降解而加入 离子载体离子霉素可在多胺缺乏的细胞增加蛋白的稳定性 细胞间渗透性是上皮屏障功能的重要指标本研究利用 通过检测上、下室的酚红透过率来反映细胞间的渗透性反映受试药对细胞屏障功能的影响/是一种钙离子荧光探针它穿透胞膜进入细胞后被胞内酯酶剪切形成 游离配体可与细胞游离 结合产生荧光用激光共聚焦显微镜可检测细胞 水平本研究观察人参多糖对细胞在正常含钙培养(无负荷)、抑制多胺合成(含钙培养 负荷)或无钙培养(培养液的 以 替代)时的渗透性、黏附连接蛋白表达及细胞 水平的影响主要针对多胺及对上皮屏障的调控作用探讨人参多糖肠黏膜保护作用 结果显示在 种实验条件下人参多糖有增强或改善上皮屏障的作用作用机制与其影响多胺和调节有关 黏附连接蛋白是上皮屏障的重要构成部分本研究在获得人参多糖对细胞间渗透性调节作用的药效后还观察了人参多糖对黏附连接蛋白(、和)表达的影响结果显示在 种实验条件下人参多糖均能提高 和 表达但人参多糖仅在正常含钙培养时能提高 表达而在 负荷和无钙培养时对 表达无明显影响即人参多糖对 和 有调节作用而对 的作用相对较弱此结果与课题组观察四君子汤(人参为君药)对吲哚美辛所致大鼠胃黏膜损伤防治作用的实验结果有相 .正常对照组.模型对照组.阳性对照药组.人参多糖 组.人参多糖 组.人参多糖 组 与正常对照组比较.、.与模型对照组比较.、.与模型对照组比较.图 人参多糖对黏附连接蛋白表达的影响(负荷).()似之处(即 四 君 子 汤 能 提 高 造 模 大 鼠 胃 黏 膜 和 表达但对 作用不明显)提示人参多糖对黏附连接复合体不同蛋白的药理作用有一定差异性 因 是钙依赖蛋白且是黏附连接的跨膜关键构成部分本研究进一步针对人参多糖对细胞 的影响进行其作用机制探讨结果显示人参多糖在正常培养和 负荷时均能提高细胞 水平提示人参多糖提高细胞 水平的作用是其提高黏附连接蛋白表达进而影响细胞间渗透性的机制之一人参是重要的益气健脾中药人参多糖是其主要有效组分之一多年来学者们从不同角度对其开展多方面的研究 本课题组围绕益气健脾中药的胃肠黏膜保护作用开展了系列研究 发现人参多糖能促进 细胞细胞迁移机制与其提高钙调节相关蛋白(、)及钙调节蛋白复合体(/、/、/)表达有关表明对 的调节是人参多糖的重要作用机制本研究进一步探讨了人参多糖对 黏附连接蛋白细胞渗透性调节的作用机制从胃肠黏膜损伤修复的多胺调节机制角度为人参多糖的作用机制提供了创新性的研究结果 本实验结果与课题组前期研究相互佐证表明人参多糖可调节 而影响细胞迁移和细胞间渗透性等肠黏膜病理生理过程可为研究人参的肠黏膜保护作用机制提供参考医药导报 年 月第 卷第 期 .正常对照组.模型对照组.阳性对照药组.人参多糖 组.人参多糖 组.人参多糖 组 与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.图 人参多糖对黏附连接蛋白表达的影响(无钙培养)().()().正常对照组.模型对照组.阳性对照药组.人参多糖 组.人参多糖 组.人参多糖 组 与正常对照组比较.与正常对照组比较.与模型对照组比较.图 人参多糖对细胞 水平的影响().()参考文献 陆若琳孙美娟.中医药治疗肠道屏障功能障碍研究进展.光明中医():.汪伟.溃疡性结肠炎中医虚实证候特点与肠黏膜象、组织病理学相关性研究.合肥:安徽中医药大学:.中华医学会消化病学分会胃肠激素与黏膜屏障学组.胃肠道黏膜保护临床专家共识(年福州).中华消化杂志():.(/).():.:?.():.():.():.王海翔王志国陈浩等.益气健脾法对老年肠内营养性腹泻的临床研究.中国中西医结合消化杂志():.夏国莲左阿芳.益气健脾方对 例脾胃虚弱型急性胃肠损伤重症患者肠黏膜屏障功能的影响.江苏中医药():.():.梁欣仪王东旭李茹柳等.四君子汤改善吲哚美辛所致大鼠小肠黏膜损伤及其可能的作用机制.中国药理学与毒理学杂志():.():.国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社:.于雪妮冯小刚张建民等.人参化学成分与药理作用研究新进展.人参研究():.邢金月杨涵童韩莲花等.人参及其药对的研究进展.中华中医药学刊():.初赛君董亚南张倩等.独参汤现代临床应用研究进展.人参研究():.雷泓宋云林.肠屏障功能障碍发病机制的研究进展.医学综述():.():.():.:.:.张穆刘君.、与肿瘤研究进展.泰山医学院学报():.:.():.()():.王东旭李茹柳朱易平等.从多胺及细胞连接蛋白角度探讨四君子汤防治胃黏膜损伤的作用机制.中药材():.().:.():.:.().():.曾丹李茹柳伍婷婷等.黄芪多糖对 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