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三氟拉嗪通过内化水通道蛋白4减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿.pdf
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1、Chinese Journal of Neuroanatomy志杂经解部神2023,39(3):3 16 3 2 0三氟拉嗪通过内化水通道蛋白4减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿初广新,李佳朔,王振,董玉书(北部战区总医院神经外科,沈阳110 0 16)摘要 目的:研究三氟拉嗪(TFP)对蛛网膜下腔出血(SAH)模型大鼠水通道蛋白4(AQP4)细胞定位及脑水肿的影响。方法:利用往小脑延髓池二次注射自体动脉血的方法制备 SAH大鼠模型,治疗组通过灌胃给予TFP处理;利用湿干比方法检测大鼠脑含水量;利用伊文思蓝染料渗透实验检测血脑屏障(BBB)的完整性;利用试剂盒分别提取胞膜蛋白和胞浆蛋白,利用West
2、ernBlot方法检测AQP4的表达。结果:与SAH组大鼠相比,TFP治疗组大鼠脑含水量减少,脑组织中伊文思蓝染料的含量下降,同时AQP4在细胞膜的分布减少。结论:TFP通过内化AQP4减轻SAH模型大鼠脑水肿。关键词蛛网膜下腔出血;三氟拉嗪;脑水肿;水通道蛋白4;大鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.010Trifluoperazine alleviates cerebral edema in subarachnoid hemorrhagemodel rats by internalizing aquaporin 4CHU Guangxin,LI Jiash
3、uo,WANG Zhen,DONG Yushu(Department of Neurosurgery,General Hospital of Northern Theater Command of ChinesePeoples Liberation Army,Shenyang 110016,China)Abstract Objective:To investigate the effects of trifluoperazine(TFP)on the localization of aquaporin-4(AQP4)cells and brain edema in rats with suba
4、rachnoid hemorrhage(SAH).Methods:The rat model of SAH was prepared byinjecting autologous arterial blood into the cerebellomedullary cistern twice.The treatment group of rats were adminstrat-ed TFP by intragastric administration.The water content of rat brain was determined by wet-dry ratio method.T
5、he integ-rity of blood-brain barrier(BBB)was determined by Evans blue dye penetration test.Cytoplasmic protein and cytoplas-mic protein were extracted by the kit respectively,and the expression of AQP4 was detected by Western Blot.Results:Compared with SAH group,the water content of brain,the conten
6、t of Evans blue dye in brain tissue and the distributionof AQP4 in cell membrane were decreased in TFP treatment group rats.Conclusion:TFP can relieve cerebral edema ofSAH model rats by internalizing AQP4.Key wordssubarachnoid hemorrhage(SAH);trifluoperazine(TFP);brain edema;aquaporin-4(AQP4);rat蛛网膜
7、下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种致残率高、死亡率高的脑卒中,主要由颅内动脉瘤破裂引起。越来越多的证据表明,SAH发病后7 2 h内发生的早期脑损伤(earlybraininjury,EBI)是导致患者高死亡率和致残率的主要原因2.3。EBI的主要病理机制包括颅内压升高、脑基金项目:国家自然科学基金(8 2 0 7 148 1)*通信作者:董玉书电话:13352 45530 1,E-mail:d o n g y u s h u 46 3 16 3.c o m317初广新:三氟拉嗪通过内化水通道蛋白4减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿血流量减少、氧化应激、神经炎症
8、、血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)破坏、脑水肿和神经元细胞凋亡4。脑水肿被认为在SAH后EBI中起重要作用5。因此,通过药物缓解脑水肿可能减轻SAH后的EBI。水通道蛋白4(aquaporin4,A Q P4)在各种神经系统疾病中的表达和活性已被广泛研究,并取得了一些有趣的发现6 。在脑水肿和脑缺血中,AQP4表达增加,通过基因敲除或抑制剂预处理抑制AQP4活性已被证明可以减少水肿形成7.8 。三氟拉嗪(t r i f l u o p e r a z i n e,T FP)是一种钙调蛋白(calmodulin,CaM)抗剂,被美国食品和药物管理局批准为抗精神病药物,研究
9、表明TFP可以通过干扰CaM抑制AQP4在脊髓损伤小鼠星形胶质细胞膜上的分布,进而减轻细胞毒性水肿9.0 1。本实验中我们利用二次注射自体动脉血方法制备了SAH大鼠模型,同时给予TFP治疗,观察TFP对 SAH大鼠早期脑水肿的影响。材料和方法1.材料1.1动物分组60只雄性SD大鼠,8 周龄,购自沈阳医学院实验动物中心,12 h白天/12 h黑夜节律循环,自由获取食物和饮水。大鼠按照随机数字法分假手术组(sham)、蛛网膜下腔出血模型组(SAH)和三氟拉嗪治疗组(SAH+TFP),每组2 0 只,实验方案经北部战区总医院伦理委员会批准。1.2试剂和仪器盐酸三氟拉嗪片购自广州白云山光华制药股份有
10、限公司,异氟烷和小动物麻醉机购自深圳瑞沃德公司,兔抗大鼠AQP4单克隆抗体(a b 2 59 318)和兔抗-actin多克隆抗体(ab8227)购自英国Abcam公司,小鼠抗钠/钾离子转运ATP酶l(a l p h a-l s u b u n i t o f t h e Na t/K+A T Pa s e,ATP1A1)单克隆抗体(sc-21712)购自美国SantaCruz公司,细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(P0 0 33)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗均购自上海碧云天公司,伊文思蓝染色试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。2.方法2.1模型制备大鼠经异氟烷(
11、2%异氟烷、2 9%氧气和6 9%氮气)诱导麻醉后,俯卧位固定在手术台上,剪除项背部毛发,碘伏消毒后暴露小脑延髓池。使用二次注血法制备SAH模型。分两次分别往小脑延髓池注射非肝素化的自体动脉血30 0 l和200 l,间隔2 4 h。2.2药物处理将盐酸三氟拉嗪片用生理盐水溶解,SAH+TFP大鼠按照0.3mg/kg灌胃,每天1次,直至实验结束,sham组和SAH组大鼠给予同等剂量生理盐水12 2.3脑含水量检测SAH术后7 2 h检测各组大鼠的脑含水量,每组取3只大鼠,异氟烷麻醉后完成取出脑组织,称重,记为脑的湿重,将脑用锡箔纸包裹后放人烤箱中10 0 烘烤2 4h,以充分烤干,再次称量,记
12、为脑的干重。计算脑含水量,公式为:脑含水量=(湿重干重)/湿重10 0%。2.4伊文思蓝渗透实验SAH手术后7 2 h,采用伊文斯蓝渗透实验对检测各组大鼠BBB的通透性。每组取3只,通过尾静脉注射浓度为2%的伊文斯蓝溶液(2 ml/kg),1h 后用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg/kg),快速灌注40 0 ml生理盐水,迅速取出脑组织,用剪刀剪碎后加人1ml三氯乙酸混匀,放置于60水浴锅中孵育2 4h,10 0 0 r/m i n 离心5min,用酶标仪检测6 2 0 nm的吸光值,用试剂盒中标准品倍比稀释并绘制标准曲线,通过标准曲线计算每组样品中伊文斯蓝的含量,结果以g/g脑组织表示2
13、.5Western Blot每组取3只大鼠,异氟烷麻醉,从每只大鼠脑相同脑区(额叶)取10 0 mg脑组织,利用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒分别提取细胞膜蛋白和胞浆蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,每个样品取30 g进行蛋白电泳,随即进行转膜和封闭,加人兔抗大鼠AQP4单克隆抗体(1:18 0 0)、膜蛋白内参为小鼠抗ATP1A1单克隆抗体(1:150 0),胞浆蛋白内参为兔抗-actin多克隆抗(1:30 0 0),将杂交膜置于4冰箱中孵育过夜,PBST洗膜3次后,加人HRP标记的山羊抗兔二抗(1:40 0 0),室温孵育1.5h,PBST洗膜3次后使用ECL发光液进行发光,经凝胶成像仪拍
14、照,利用ImageJ软件进行定量分析。2.6乡统计学分析斤用SPSS20.0软件进行数据处理,计量资料用均数标准差(xs)表示。两组间的比较用单因素方差分析(onewayANOVA),P0.05),假手术组无大鼠死亡(Fig.1)。提示TFP不能显著减低SAH大鼠的死亡率。3530(%)aeuoe2520151050ShamSAHSAH+TFPFig.1 The mortality of rat at 24 hours after SAH.2.三氟拉嗪治疗减轻蛛网膜下腔出血大鼠脑水肿与假手术组大鼠相比,SAH组大鼠在第二次注血7 2 h后脑的含水量显著增加(P0.05),T FP组治疗后使SA
15、H组大鼠脑含水量降低至与假手术组相似的水平(P0.05,Fig.2)。100a9080b706050ShamSAHSAH+TFPFig.2 TFP reduced brain water content of SAH rats.aP0.05 usSham group,bP0.05 us SAH group.3.三氟拉嗪治疗降低蛛网膜下腔出血大鼠伊文思蓝通透性正常情况下伊文思蓝染料不易通过完整的血脑屏障,SAH在第二次注血7 2 h后内通过尾静脉注射至大鼠体内的伊文思蓝染料渗透到到所有脑区,提示SAH大鼠血脑屏障完整性受到破坏。TFP治疗后SAH大鼠脑组织中伊文思蓝染料和含量显著降低(P0.05
16、,Fi g.3),表明TFP治疗后SAH大鼠的血脑屏障破坏减轻。1.61.4a1.210.8b0.60.40.20ShamSAHSAH+TFPFig.3 TFP treatment reducd Evans blue permeability in rats withSAH.aP0.05 us Sham group,bp0.05 us SAH group.4.三氟拉嗪促进蛛网膜下腔出血大鼠脑内AQP4从胞膜转移至胞浆SAH发生后7 2 h,脑组织中AQP4迅速分布至胞膜,这种细胞定位使水分子过多的进人到胞内,引起细胞性水肿,然而TFP治疗组的SAH大鼠脑内细胞膜AQP4显著降低,胞浆中AQP4
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