纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测.pdf

2023，45（4）DOI：10.13836/j.jjau.2023082Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensishttp:/江西农业大学学报 纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测游婧，刘冰*，熊桂红，蒋军喜，宋珏萍，雷若琦，朱珍，谢忠建（江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045）摘要：【目的】柑橘溃疡病是脐橙上的一种重要病害，影响其发生的因素较多。通过了解纽荷尔脐橙内生细菌群落组成和其潜在的生物学功能，探索内生细菌在脐橙感染溃疡病中的作用。【方法】从纽荷尔脐橙树上随机采集未表现任何病害症状的幼果和嫩叶，嫩叶分别在春、夏、秋3个季节进行采样，每个样品设3个重复。对4个样品进行表面消毒后从中提取DNA，PCR在25 L反应体系中进行，扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检查，选取主条带清晰的400500 bp片段进行测序。采用基于16S rRNA基因V3-V4可变区的高通量测序技术及Tax4Fun功能预测对纽荷尔脐橙内生细菌菌群及其功能进行了测定和分析。各样本数据在FLASH V1.2.7上进行拼接，利用QIIMEV1.7.0对产生的原始数据进行质控，用Uparse V7.0.10012对有效数据进行聚类，在97%的相似度水平上生成OTU。为每个OTU挑选一个代表序列，并使用SSUrRNA数据库进行物种注释分析使用，获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成，并用MUSCLE（V3.8.31）进行多样性（样本内）和多样性（样本间）分析。通过UProC和PAUDA 2种方法将功能信息对应到SILVA数据库中，实现功能注释。【结果】季节和采摘部位对脐橙内生细菌群落组成的多样性和物种丰富度存在一定的差异，脐橙幼果中的内生细菌数量多于叶片，夏季相较于其他季节内生细菌群落丰富度更高；脐橙内生细菌群体在门水平上的组成相似，但丰度占比不同,且厚壁菌门、变形菌门和蓝菌门为主要优势门，各优势细菌纲数目、组成及其丰度随不同脐橙样本而异，芽孢杆菌属为主要优势属；Tax4Fun功能预测显示纽荷尔脐橙内生细菌包含大量关于膜运输、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、翻译、复制和修复、能量代谢、辅因子和维生素的代谢等基因信息，其中功能基因丰度较大的为碳水化合物代谢和氨基酸代谢，且脐橙夏天叶片的细胞过程和环境信息处理功能信息高于其他3种样品，幼果的遗传信息处理、新陈代谢、有机系统和人类疾病功能信息高于其他3种样品。【结论】纽荷尔脐橙内生细菌群落多样性丰富，具有大量代谢相关的有益菌，研究结果可为今后探索纽荷尔脐橙内生细菌菌群的利用和柑橘溃疡病的生物防治提供思路。关键词：纽荷尔脐橙；内生细菌多样性；功能预测；高通量测序；群落结构；Tax4Fun功能预测中图分类号：S436.66 文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文章编号：1000-2286（2023）04-0884-10收稿日期：20230410 修回日期：20230518基金项目：国家自然科学基金项目（31460139）和江西省自然科学基金项目（20192BAB214004，20161BAB204184）Project supported by the National Natural Science Foundation of China（31460139）and Natural Science Foundation of Jiangxi Province（20192BAB214004，20161BAB204184）作者简介：游婧，硕士生，orcid.org/0009-0004-5127-2951，；*通信作者：刘冰，副教授，博士，主要从事植物病害生物防治研究，orcid.org/0000-0002-0620-1642，。游婧，刘冰，熊桂红，等.纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测 J.江西农业大学学报，2023，45（4）：884-893.YOU J,LIU B,XIONG G H,et al.Diversity and functional prediction of endophytic bacterial community in leaves and young fruits of Newhall Navel OrangeJ.Acta agriculturae universitatis Jiangxiensis,2023,45(4):884-893.第 4 期游婧等:纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测Diversity and Functional Prediction of Endophytic Bacterial Community in Leaves and Young Fruits of Newhall Navel OrangeYOU Jing，LIU Bing*，XIONG Guihong，JIANG Junxi，SONG Jueping，LEI Ruoqi，ZHU Zhen，XIE Zhongjian（College of Agriculture，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）Abstract：Objective Citrus canker is a disease on navel orange，and there are many factors affecting its occurrence.This study aims to understand the community composition and potential biological functions of endophytic bacteria in Newhall navel orange，thus exploring the role of endophytic bacteria in navel orange infected with canker disease.Method The young fruit and young leaves without any disease symptoms were randomly collected from the Newhall navel orange tree.The young leaves were sampled in spring，summer and autumn respectively，each sample had three replicates.After disinfecting the surface of the four samples，DNA was extracted from the four samples.PCR was performed in a 25 L reaction system.The amplification product was examined by 20 g/L agarose gel electrophoresis，and the 400-500 bp fragment with clear main band was selected for sequencing.The endophytic bacterial flora and its function were determined and analyzed by high-throughput sequencing technology based on 16S rRNA gene V3-V4 variable region and Tax4Fun function prediction.The sample data were spliced on FLASH V1.2.7，the original data were quality controlled by QIIMEV1.7.0，and the effective data were clustered by Uparse V7.0.10012 to generate OTU at the similarity level of 97%.A representative sequence was selected for each OTU，and the SSUrRNA database was used for species annotation analysis，the taxonomic information was obtained and the community composition of each sample was counted at each classification level.MUSCLE（V3.8.31）was used for diversity（within samples）and diversity（between samples）analysis.Functional information was mapped to the SILVA database by UProC and PAUDA methods to achieve functional annotation.ResultThe results showed that there were differences in the diversity and species richness of endophytic bacterial communities in navel oranges between seasons and picking sites，the number of endophytic bacteria in navel orange fruits was more than that in leaves，and the richness of endophytic bacteria in summer was higher than that in other seasons.The composition of endophytic bacteria in navel orange was similar at the phylum level，Firmicutes，Proteobacteria and Cyanobacteria were the main dominant phyla.The number，composition and abundance of each dominant bacterial class varied in different navel orange samples.Bacillus was the main dominant genus.Tax4Fun function prediction revealed that endophytic bacteria in Newhall navel orange contained a large amount of genetic information about membrane transport，carbohydrate metabolism，amino acid metabolism，translation，replication and repair，energy metabolism，metabolism of cofactors and vitamins.Among them，carbohydrate metabolism and amino acid metabolism were the most abundant functional genes，and the cell process and environmental information processing function information of navel orange leaves collected in summer was higher than that of the other three samples，the genetic information processing，metabolism，organic system and human disease function information of young fruit was higher than that of the other three samples.ConclusionThe endophytic bacterial community of Newhall navel orange is rich in diversity and has a large number of beneficial bacteria related to metabolism.The results can provide ideas for the utilization of endophytic bacterial flora in Newhall navel orange and the biological control of citrus canker disease in the future.Keywords：Newhall navel orange；endophytic bacterial diversity；functional prediction；high-throughput sequencing；community structure；Tax4Fun function prediction 885江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷【研究意义】植物内生菌（Endophyte）主要是指存在于植物各组织或器官内，在植物整个生命或某一特定生活阶段，不使其出现明显被感染症状的一类微生物1-2。近年来，内生细菌因其被发现可以提高宿主植物对胁迫环境的耐受性、促进植物生长、提高植物抗病性而受到广泛的关注3。然而，已有研究，特别是关于提高宿主植物抗病性的研究，主要局限于可人工培养的内生细菌4，鲜有难培养内生细菌方面的报道。内生细菌和宿主植物能相互适应并相互作用，形成复杂的共生关系。宿主植物的基因型及不同器官、生长地和环境条件对内生细菌的种类、数量和活性都有显著的影响5-7。植物中大多数内生细菌对宿主的生长有重要影响，包括抗病方面的细菌8。因此，探索内生细菌群落的多样性，可深入了解内生细菌-宿主-环境之间的相互作用。柑橘溃疡病由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种Xanthomonas citri subsp.citri（Xcc）引起，在我国是一种重要的检疫性病害。【前人研究进展】目前，柑橘溃疡病尚无根治方法9，大多数柑橘种植区都是以化学防治为主。Xcc的选择性感染与柑橘品种有关，不同的柑橘品种对柑橘溃疡病的抗病程度有明显差异，甜橙类、脐橙类普遍容易感病，宽皮橘类的抗病性最强，而柚类感病轻重不一10。据报道，柑橘品种所表现出对溃疡病的抗性与柑橘叶片结构（叶片厚度、气孔密度、海绵组织厚度等）11以及柑橘品种中内生细菌的类群12等多种因素有关。【本研究切入点】本研究以柑橘溃疡病的感病品种纽荷尔脐橙为材料，通过高通量测序技术对其内生细菌的多样性进行了测定和分析。【拟解决的关键问题】旨在了解纽荷尔脐橙内生细菌的群落组成及其潜在的生物学功能，为探索内生细菌在脐橙感染溃疡病中的作用提供参考。1 材料与方法1.1材料试验材料来源于江西农业大学科技园，从纽荷尔脐橙树上随机采集未表现任何病害症状的幼果和嫩叶。脐橙幼果记为CSN.F，春、夏、秋采集的嫩叶分别记为CSN.SP、CSN.SU和CSN.AU。每个样品分别采自6株不同脐橙树（果园中随机分布）的6片叶子或果实，置于无菌塑料袋中-20 保存，备用。1.2样品的制备样品先后用体积分数70%酒精表面灭菌1 min，1%次氯酸钠溶液表面灭菌15 min，然后用无菌水洗涤45次，直至最后一遍无菌水洗涤液经涂板检测无细菌污染，样品在无菌纸上晾干。为降低误差，每个样本选取3 g作为1个样品，并设3个重复。1.3DNA提取采用Jiao等13和吴思梦等14报道的方法从植物组织中提取微生物DNA。具体方法是植物用液氮研磨，混合均匀。为排除植物叶绿体对后续细菌基因组 DNA 提取的干扰，将 3 g 植物组织粉末悬浮于 15 mL 酶液（1.5%果胶酶 R-10、1.5%纤维素酶 R-10、0.12%N-吗啉乙烷磺酸、0.36%CaCl22H2O、12.8%D-甘露醇、0.011%磷酸二氢钠，pH为5.6）中，37 温育3 h。用200 g转速离心混合液5 min，重复3次。收集上清液于16 500 g转速离心20 min，收集沉淀。最后，根据生产厂家的说明书，使用全式金EasyPure细菌基因组DNA试剂盒提取DNA。每个样品分析重复3次。1.4DNA扩增和下一代测序以上述DNA为模板进行聚合酶链反应（PCR）扩增。引物341F（5-CCTAYGGGRBGCASCAG-3）和806R（5-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3）15扩增16S rRNA基因的V3-V4可变区。PCR在25 L反应体系中进行，稀释模板DNA 2 L，无菌水8.5 L，每个引物1 L，TaKaRa PCR Mix（中国大连）12.5 L。PCR反应条件为：94 初始变性；94 退火30 s，54 退火60 s，72 延伸2 min，35个循环，最后72 延伸10 min16。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检查，选取主条带清晰的400500 bp片段，经Qiagen凝胶提取试剂盒（Qiagen，Germany）纯化后，在HiSeq 2500平台（Illumina，SanDiego，CA，USA）上利用Novogene生物信息学技术（Beijing，China）进行测序。1.5序列数据处理及统计分析根据特异性序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，然后在FLASH V1.2.7上进行拼接。然后，利用QIIME（quantitative insights into microbial ecological）V1.7.0对产生的原始数据进行质 886第 4 期游婧等:纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测控，然后用Uparse V7.0.10012对有效数据进行聚类，在97%的相似度水平上生成OTU（operational taxonomic units）。为每个OTU挑选一个代表序列，并使用SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.81），获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。使用MUSCLE（V3.8.31）分析多样性（样本内）和多样性（样本间）。利用Tax4Fun功能预测对脐橙内生细菌进行基因预测，具体做法为提取KEGG数据库内生细菌全基因组16S rRNA基因序列并利用BLASTN算法将其比对到SILVA SSU Ref NR数据库（BLAST bitscore1 500），通过UProC和PAUDA 2种方法将功能信息对应到SILVA数据库中，实现功能注释。2 结果与分析2.1OTUs分析对不同脐橙叶片样本在 97%一致性阈值下的 Alpha Diversity 分析指数（shannon、simpson、chao1、ACE、goods_coverage、PD_whole_tree）进行统计，了解样本内生细菌群落的多样性和丰富度，结果如表1所示。所有样本的goods_coverage值均大于99%，表明测序数据具有较高的完整性。对脐橙内生细菌进行群落丰富度指数分析（Chao1 指数和 ACE 指数）和群落多样性指数分析（simpson 指数和Shannon指数）。由表 1可知，各样品的 Chao1指数和 Shannon指数等多样性指数各不相同，表明季节和采摘部位对4种脐橙内生细菌群落组成的多样性和物种丰富度存在一定的差异。其中样品CSN.SP的 chao1 指数值（219.442）、ACE 指数值（223.704）最高，表明春天脐橙叶片的内生细菌物种丰富度比其他3个样品高；样品CSN.SU的simpson指数值（0.718）和Shannon指数值（3.529）最高，表明夏天脐橙叶片的内生细菌物种多样性比其他3个样品高；CSN.AU的simpson指数最低（0.561），但是Chao1指数并不是最小（145.762），说明秋天脐橙叶片的内生细菌多样性相对于脐橙幼果的多样性较低，但是丰富度相对幼果更高。为了考察指定样品（组）间的基因数目分布情况，分析不同样品（组）之间的基因共有、特有信息，绘制了韦恩图（Venn graph）。脐橙所有果实和叶片（包括3个季节）中均含有丰富的OTUs。Venn图分析结果（图1A）表明，4个柑橘样本中内生细菌共有的OTU数目有6 439个，说明这些OTUs可能是在脐橙内生细菌群落中相对稳定的成分；共有的OTU数目占比达到99%以上，所以不同脐橙样本独有的内生细菌群体种群组成存在较小差异。脐橙幼果内生细菌特有OTU数目较多（图1A），其独有的OTU数目有36个，其次为夏季采摘叶片（9个）、秋季采摘叶片（6个）、春季采摘叶片（1个）；不同季节的样品相比（图1B），夏季叶内生细菌群落丰富度高，具有相对更多独特的OTUs（21个），其次是春季（12个）、秋季（4个）。2.2内生细菌群落组成2.2.1不同脐橙样本内生细菌群体门水平的优势种群分析如图2所示，脐橙内生细菌在门水平上主要有厚壁菌门（Firmicutes）、蓝菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteriota）、unidentified_Bacteria、泉古菌门（Crenarchaeota）、酸杆菌门（Acidobacteria）和粘球菌门（Myxococcota）。其中，厚壁菌门、变形菌门和蓝菌门为主要优势细菌门，相对丰度总计覆盖了4个柑橘样本的87.34%99.44%，说明脐橙内生细菌群体在门水平上的组成相似，但丰度占比不同。4个样本中，CSN.SU中厚壁菌门的相对丰度最低，变形菌门和蓝菌门相对丰度最高。表1不同脐橙样本内生细菌OTU及其多样性分析Tab.1OTU and diversity analysis of endophytic bacteria from different orange samples样品Sample nameCSN.SPCSN.FCSN.SUCSN.AUObserved_species指数Observed_species204.000103.333151.333128.333香农指数Shannon2.6621.7253.5292.306辛普森指数Simpson0.6930.6080.7180.561Chao1指数Chao1219.442138.488153.940145.762ACE指数ACE223.704142.516155.082149.582覆盖度Goods_coverage0.9990.9991.0000.999谱系多样性PD_whole_tree21.59412.72419.70213.981 887江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷2.2.2不同脐橙样本内生细菌纲水平的优势种群组成分析如图3所示，4个样本在纲水平上最大丰度排名前10的分别是芽孢杆菌纲（Bacilli）、Cyanobacteriia、-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）、梭菌纲（Clostridia）、放线菌纲（Actinobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、梭杆菌纲（Fusobacteriia）、红蝽菌纲（Coriobacteriia）和Nitrososphaeria。这10个细菌纲的总相对丰度覆盖了4个脐橙样本的 98.69%99.94%，各优势细菌纲数目、组成及其丰度随不同脐橙样本而异。其中 Nitrososphaeria仅存在于CSN.SU。图1不同脐橙样本内生细菌群落Venn分析Fig.1Venn diagram of endophytic bacterial community in different navel orange samples图2不同脐橙样本内生细菌群落优势细菌门组成及其相对丰度Fig.2Dominant bacterial phylum composition and relative abundance of endophytic bacterial communities in different navel orange samples 888第 4 期游婧等:纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测图3不同脐橙样本内生细菌群落优势细菌纲组成及其相对丰度Fig.3The dominant bacterial class composition and relative abundance of endophytic bacterial communities in different navel orange samples图4不同脐橙样本内生细菌群落优势细菌属组成及其相对丰度Fig.4Composition and relative abundance of dominant bacteria in endophytic bacterial community of different navel orange samples 889江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷2.2.3不同脐橙样本内生细菌属水平的优势种群组成分析图4表明优势细菌属的数目、组成及其丰度随脐橙样本的不同而有所差异。在属水平上，共有18个属的相对丰度大于1.0%，其中平均相对丰度最高的属为厚壁菌门芽孢杆菌科的芽孢杆菌属（Bacillus）（24.34%）。希瓦氏菌属（Shewanella）和盐单胞菌属（Halomonas）在CSN.SP和CSN.SU中均有少量分布，而在CSN.F和CSN.AU中未被检测出分布。此外，这4个脐橙样本中的内生细菌还存在大量未能在属水平归类的OTU序列，其范围为37.27%57.51%，说明可能还存在大量的未知属。2.3不同脐橙样本内生细菌功能基因预测利用Tax4Fun功能预测对脐橙内生细菌进行基因预测，这种方法能在一定程度上反映微生物群落功能。结果如图5所示，脐橙内生细菌功能主要涉及环境信息处理、遗传信息处理、新陈代谢、有机系统、人类疾病和细胞过程6个方面。脐橙夏天叶片的细胞过程和环境信息处理功能信息高于其他3种样品，幼图5脐橙内生细菌功能基因分类Fig.5Classification of endophytic bacteria functional genes in navel orange 890第 4 期游婧等:纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测果的遗传信息处理、新陈代谢、有机系统和人类疾病功能信息高于其他3种样品。各样品中功能丰度1%且由高到低依次顺序为膜运输（membrane transport）2.73%、碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）2.46%、氨基酸代谢（amino acid metabolism）2.44%、翻译（translation）2.33%、复制和修复（replication and repair）2.16%、能量代谢（energy metabolism）1.45%、辅因子和维生素代谢（metabolism of cofactors and vitamins）1.14%。3 讨 论纽荷尔脐橙原产美国，是我国目前种植面积最大的脐橙品种，但其对于柑橘溃疡病的抗性不高17。目前，柑橘溃疡病主要以化学防治为主，这导致了许多环境问题和食品安全问题的发生。用生物防治的方法防治脐橙溃疡病有安全、高效、污染少等优点，但也存在一些问题，如生防菌效果不稳定等3。近年来，内生细菌用于植物病害生物防治的研究越来越多，其较一般生防菌具有独特优势，如内生细菌更容易被植物接受且可以长时间甚至永久定殖在植物内部发挥生防作用18，在防治柑橘溃疡病方面有很大的潜力。然而，对于防治溃疡病内生细菌仅局限于可培养的菌株，而通过调节脐橙内生细菌菌群防治该病未见报道。有研究表明，柑橘溃疡病的发生可能与其体内的细菌菌群有关19，因此明确纽荷尔脐橙内生细菌群落结构、组成和功能，可以为其溃疡病的生物防治提供新思路。李佳等20的研究表明，感染了柑橘黄龙病的长春花其原有内生细菌的菌群结构改变，且菌群多样性下降，说明长春花内生细菌在一定程度上受到柑橘黄龙病菌的抑制。类似的研究结果21-22也表明，菌群失调症的发生发展，是一种与细菌病原密度增加有关的微生物失衡，因此也可以在解释柑橘溃疡病发病动态方面发挥重要作用。研究结果显示，所有样品中共有6 439个OTUs，表明这些样品中存在相同的内生细菌。叶片内生细菌丰度由大到小依次为夏季、春季和秋季，推测主要原因可能是夏季能够提供更高的温度，促进内生细菌生长；春季气温较夏季更低，这可能会导致内生细菌丰度的减少；脐橙树的生理活动在秋季减慢，内生细菌的丰度下降23。本研究发现，在门水平上，厚壁菌门、变形菌门和蓝菌门为主要优势细菌门，部分属于厚壁菌门的内生细菌通过抗菌肽的产生、细菌溶解和生态位竞争等多种方法对引起柑橘溃疡病的Xcc有抑制作用24。夏季是柑橘溃疡病发病风险最高的时期，为了抵抗病原菌的入侵，处于竞争地位的厚壁菌与病原菌相互作用，导致夏季样品中其种群数量急剧减少，丰度最低。因此，推测厚壁菌内生细菌的含量差异和变化趋势可能预示着柑橘溃疡病抗性的进程。脐橙内生细菌的动态变化与宿主对溃疡病的抗性之间是否存在关系尚不明确，需要通过分析对柑橘溃疡病具有不同抗性脐橙品种中的内生细菌来做进一步探索。属级水平上的优势种群分析显示，纽荷尔脐橙嫩叶内生细菌群落种类较多，幼果内生细菌较少。其中，平均相对丰度最高的属为芽孢杆菌属，其平均丰度为24.34%。研究表明，芽孢杆菌属极易分离培养，可以产生耐热抗逆的芽孢，而且制剂稳定、抑菌能力强、施用方便、便于运输、储存期长，是一种重要的防病促生微生物25-26。内生细菌的生物学功能与其所拥有的功能基因息息相关。本研究采用Tax4Fun对纽荷尔脐橙的内生细菌进行功能预测发现，脐橙内生细菌包含大量关于碳水化合物、蛋白质、脂质、糖类、核苷酸、辅酶及代谢产物合成的基因信息，说明脐橙内生细菌可能参与代谢脐橙中各种营养物质，为脐橙植株生长发育提供必要的营养、激素等作用27。其中，在一级功能通路的预测结果中新陈代谢通路相关功能基因的丰度最大，成为纽荷尔脐橙内生细菌群落最主要的功能；且在该通路的二级功能通路中，功能基因丰度较大的为碳水化合物代谢和氨基酸代谢，说明纽荷尔脐橙内生细菌基因的优势功能主要集中在将碳、氮2种元素的进行分解，转化能量，为细菌生存提供保障。Tax4Fun基因预测中出现了具有一定丰度的人类疾病相关基因信息，纽荷尔脐橙内生细菌中是否存在具有潜在致病性的菌株，还有待下一步深入研究。本研究通过高通量测序分析明确了纽荷尔脐橙内生细菌群落结构及多样性，初步了解了纽荷尔脐橙中细菌种群的功能，可为确定内生细菌在脐橙感染溃疡病中的作用提供参考，同时为挖掘纽荷尔脐橙内生细菌的功能研究和利用以及柑橘溃疡病的生物防控提供了准确的微生物信息。试验仅对脐橙单一 891江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷品种、单一区域的内生细菌群落结构及多样性进行了分析，品种数量和地域分布有限，后续研究中将会对多个地域的多个柑橘品种进行分析。致谢：江西农业大学大学生创新创业训练计划项目（202210410118）同时对本研究给予了资助，谨致谢意！参考文献 References：1ZHANG Y，YU X X，ZHANG W J，et al.Interactions between endophytes and plants：beneficial effect of endophytes to ameliorate biotic and abiotic stresses in plants J.Journal of plant biology，2019，62（1）：1-13.2王志伟，纪燕玲，陈永敢.植物内生菌研究及其科学意义 J.微生物学通报，2015，42（2）：349-363.WANG Z W，JI Y L，CHEN Y G.Studies and biological significances of plant endophytes J.Microbiology China，2015，42（2）：349-363.3石晶盈，陈维信，刘爱媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展 J.生态学报，2006，26（7）：2395-2401.SHI J Y，CHEN W X，LIU A Y.Advances in the study of endophytes and their effects on control of plant diseases J.Acta ecologic Sinica，2006，26（7）：2395-2401.4刘起丽，张建新，徐瑞富，等.柑橘皮内生细菌分离及柑橘青霉病菌拮抗菌筛选研究 J.中国农学通报，2011，27（28）：235-239.LIU Q L，ZHANG J X，XU R F，et al.Studies on isolation of endophytic bacteria from Citrus skins and screening of antagonistic strains against Penicillium italicum J.Chinese agricultural 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