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青稞根边缘细胞的发育特性及其对密花香薷挥发油胁迫的响应.pdf
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1、2023年36 卷7 期Vol.36No.7引用格式:周汐婕,肖云星,谢雨思,马丹炜.青稞根边缘细胞的发育特性及其对密花香需挥发油胁迫的响应J.西南农业学报,2 0 2 3,36(7):139 3139 9.Zhou X J,Xiao Y X,Xie Y S,Ma D W.Developmental characteristics of Hordeum vulgare L.root border cells and their responses to volatile oil of Elsholt-zia densa Benth.J.Southwest China Journal of Ag
2、ricultural Sciences,2023,36(7):1393-1399.D0I:10.16213/ki.scjas.2023.7.005.西南农业学报Southwest China Journal of Agricultural Sciences青稞根边缘细胞的发育特性及其对密花香挥发油胁迫的响应1393周汐婕,肖云星,谢雨思,马丹炜(四川师范大学生命科学学院,成都6 10 10 1)摘要:【目的】探讨农作物青稞(Hordeumvulgare L.)根边缘细胞(Rootbordercells,RBCs)对挥发油的防御响应机制,为青藏高原农田生态系统农作物的保产增产提供理论依据。【方法
3、】采用纯琼脂悬空气培养法,在研究青稞RBCs发育特性基础上,探讨青稞RBCs从细胞活性、粘胶层厚度、胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平变化以及细胞死亡类型等方面对不同浓度密花香需(El s h o l t z i a d e n s a Be n t h.)挥发油的响应。【结果】青稞RBCs围绕根尖形成保护层,细胞形态呈圆形、弧形以及杆形,细胞长30 150m,宽10 30 m;在5 40 mm根长范围内,青稞RBCs数量与根长呈正相关,在根长40 mm时达到峰值(12 6 3个),此时RBCs数量为根长5mm时的2.37 倍;不同根长的RBCs存活率均维
4、持在9 0%以上。经过密花香挥发油处理的青稞RBCs出现浅橘红色荧光,细胞核呈现橘红色荧光亮斑,RBCs活性丧失。随着挥发油处理浓度增加,青稞RBCs粘胶层厚度与细胞活性呈浓度依赖性变化;与对照相比,在最高浓度0.1L/uL作用下,青稞RBCs粘胶层厚度增加1.6 4倍,细胞活性下降59.8 3%;同时,细胞内ROS水平呈上升趋势,在T3(0.06L/L)浓度处理下ROS相对荧光值达到最高(2.2 3);当挥发油和泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同作用时,由挥发油引起的细胞活性降低现象得以缓解,与未使用Z-VAD-FMK相比,细胞活性升高17.3%。【结论】青稞RBCs受到密花香挥发
5、油胁迫后,通过增厚粘胶层抵御外界胁迫侵害,并产生ROS诱导细胞凋亡,从而缓解化感毒性。关键词:青稞;根边缘细胞发育;挥发油;化感胁迫响应中图分类号:S512.3Developmental characteristics of Hordeum vulgare L.root bordercells and their responses to volatile oil of Elsholtzia densa Benth.Abstract:ObjectiveThe present study aimed to elucidate the defense response mechanism of H
6、ordeum vulgare L.root border cells(RBCs)to volatile oil and provide theoretical basis for crop yield preservation and increase in farmland ecosystem of Qinghai-Tibet Plateau.MethodThe pure agar suspension air culture method was adopted.Based on the research of development characteristics of H.ulgare
7、 RBCs,the chan-ges of activity,the mucilage layer thickness,intracellular reactive oxygen species(ROS)levels and cell death types of H.vulgare RBCstreated with different concentrations of Elsholtzia densa Benth.volatile oil(0,0.02,0.04,0.06,0.08 and 0.1 L/L)were investigated.Result The RBCs of H.vul
8、gare which were round,arc and rod-shaped formed a protective layer around the root tip.The cells were 30-150m long and 10-30 m wide.In the range of 5-40 mm root length,the number of RBCs of H.vulgare was positively correlated with theroot length,and reached the peak(1263)when the root length was 40
9、mm.In this case,the number of RBCs was 2.37 times that when theroot length was 5 mm.The survival rate of RBCs with different lengths was above 90%.After treatment with volatile oil of E.densa,the RBCsof H.vulgare showed light orange red fluorescence,and the nucleus showed bright orange red fluoresce
10、nce spots,which indicated the loss ofRBCs activity.With the increase of the concentration of volatile oil,the mucilage layer and cell activity of the RBCs of H.vulgare changed in aconcentration dependent manner.Compared with the control,at the highest concentration of O.1 L/L,the mucilage layer of t
11、he RBCs in-creased by 1.64 times,and the cell activity decreased by 59.83%.At the same time,intracellular ROS levels showed an upward trend,and theROS relative fluorescence value reached the highest(2.12)at T3 concentration(0.06 L/L).When the volatile oil and pan-caspase inhibi-收稿日期:2 0 2 2-0 9-0 8基
12、金项目:四川省科技厅应用基础重点项目(2 0 2 0 YJ0335);第四次全国中药资源普查(2 0 19 PC006)第一作者:周汐婕(2 0 0 0),女,硕士,主要从事化感作用研究。E-mail:通讯作者:马丹炜(19 6 3),女,博士,教授,主要从事化感作用研究。E-mail:d a n w e i 10 ma 12 6.c o m文献标识码:AZHOU Xi-jie,XIAO Yun-xing,XIE Yu-si,MA Dan-wei(College of Life Science,Sichuan Normal Universtiy,Chengdu 610101,China)文章编
13、号:10 0 1-48 2 9(2 0 2 3)7-139 3-0 71394tor Z-VAD-FMK were combined together,the decrease in cell activity caused by volatile oil was alleviated,and the cell activity was increasedby 17.3%compared with that without Z-VAD-FMK.ConclusionJThe RBCs of H.ulgare resist the external stress by thickening the
14、 mucilagelayer,and produce ROS to induce cell apoptosis after the stress of volatile oil of E.densa,thereby further alleviating its allelopathic toxicity.Key words:Hordeum vulgare L.;Root border cells development;Volatile oil;Response to allelopathic stress【研究意义】青藏高原独特的“高”“寒”自然环境,形成了高寒草甸敏感脆弱的生态系统 。受
15、到全球气候变化、人类干扰以及过度放牧等因素的影响,青藏高原草地逐渐退化,毒杂草扩张,严重威胁了青藏高原农作物的生长2 。青稞(Hordeum vul-gare L.)因具有适应性广、耐寒、抗逆能力强等特点,常被种植在海拔140 0 410 0 m的地方3,是青藏高原地区极为重要的农作物4。探究青稞面对毒杂草扩张采取的防御响应机制为青藏高原农田生态系统农作物的保产增产提供理论依据。【前人研究进展化感作用是指植物通过淋溶、挥发、残株分解等途径向周围环境释放化感物质,从而对周围植物或微生物造成有利或有害影响5,其中负面影响被称为化感胁迫。类似于人侵植物的“新武器假说”,除了争夺光照、水分、养分等资源
16、竞争外,毒杂草例如黄花棘豆(Oxytropis ochrocephala)、瑞香狼毒(St e l l e r a c h a ma e j a s me)、黄帚吾(Ligularia virgau-rea)等会利用化感作用提高自身的竞争力7 。根边缘细胞(Rootbordercells,RBCs)由根冠分生组织发育形成,被程序化分离后聚集在根冠周围,并与其分泌的粘液共同组成根胞外陷阱(Root extracellulartraps,BETs)【。当受到包括化感作用在内的外界胁迫时,BETs能吸附、中和土壤中的有毒物质,调节根际环境,保护根尖免遭伤害,是植物抵御土壤环境胁迫的的重要屏障9 。植
17、物产生的RBCs对外界刺激十分敏感,其数量因种类而异,大多数植物每天都会产生数千个具有特殊基因表达模式、代谢活跃的RBCs10。以往研究更关注化感物质对受体植物RBCs防御功能以及周围环境的干扰作用,而忽略受体植物RBCs对化感胁迫的防御响应6,1。密花香(El s h o l t z i a d e n s a Be n t h.)是唇形科(Labiatae)香需属(Elsholtzia)芳香类的多年生草本植物,含有丰富的挥发油12】,是青藏高原农田生态系统常见的优势毒杂草13,其水浸提液对受体植物具有显著的化感抑制效应14。在密花香需不断扩张的同时,其挥发性化感物质必定会通过土壤吸附、残株
18、腐解等途径不断进入土壤作用邻近植物的根系15。而青稞RBCs为了保护根尖会作出怎样的响应并未得到解决。【本研究切入点】以密花香挥发油为供体,采用纯琼脂悬空气培养法,在研究青稞RBCs发育特性的基础上,探讨青稞RBCs从细胞活性、粘胶层厚西南农业学报度、胞内ROS水平变化以及细胞死亡类型等方面对不同浓度密花香需挥发油的响应。【拟解决的关键问题】探讨农作物青稞RBCs面对密花香需挥发油化感胁迫的响应机制,为青藏高原农田生态系统农作物的保产增产提供理论依据。1材料与方法1.1材料及来源供体植株密花香需,2 0 19 年7 月采于四川省阿坝藏族羌族自治州红原县阿西乡(10 2 55.9 44E,334
19、1.023N)的高寒草甸。该地海拔347 0 m,属高原寒温带湿润季风气候,常年无夏,无绝对无霜期16 。青稞种子购于四川省甘孜藏族自治州道孚县。泛 Caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK(20 mmol/L 0.02mL)和活性氧检测试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司。1.2挥发油母液的制备将采集的成熟期密花香全株阴干后剪成12cm的小段,采用水蒸气蒸馏法提取密花香需挥发油17 ,经无水 Na,SO4除水后置于棕色试剂瓶-2 0保存。取挥发油10 L,用体积分数为2 5%的二甲基亚砜(DMSO)稀释至10 0 L得到0.1 L/L挥发油处理母液。1.3材料培养及处理1.3.1材料培养挑
20、选颗粒饱满、大小均一的青稞种子,用0.5%KMnO4溶液消毒10 min,蒸馏水清洗6 次后置于2 5恒温培养箱浸种12 h,转移至铺有湿润双层无菌纱布的瓷盘中继续在2 5环境中无光照催芽2 4h。待种子露白后,胚根朝外插人装有0.8%质量分数纯琼脂的培养瓶(容积2 0 0 mL、直径9 cm、高8.5 cm)中无光照倒置培养15。1.3.2RBCs的收集待青稞根长达到5、10、15、20、2 5、30、35、40、45和50 mm时,分别随机剪取5mm根尖10 个,置于装有10 0 L ddH,0的离心管中,漩涡振荡30 s,吸出细胞悬液,再用50 LddH,0冲洗根尖2 次,收集细胞悬浮液
21、并用微量进样器(规格10 0 0 L)吸打34次,使成团的RBCs分离,制得细胞悬液15。1.3.3试验处理A组:分别吸取挥发油母液1、2、3、4和5L,用DMSO补充至5L配置成浓度为0.02、0.0 4、0.0 6、0.0 8 和0.10 L/L的处理液(记36卷7期为 T1、T 2、T 3、T 4 和 T5,T5 与挥发油处理母液的浓度一致)。加人2 0 0 L根长为40 mm时制得的细胞悬液(此时RBCs数量达到峰值,活性较高)并混匀。以5L25%体积分数的DMSO为溶剂对照,以5LPBS溶液为阴性对照(记为Control),所有处理均置于2 5恒温培养箱中暗培养30 min,每个处理
22、重复6 次。B组:分别将5LPBS溶液(Con-trol)、5L挥发油处理母液、5L挥发油处理母液+泛Caspase 抑制剂Z-VAD-FMK(终浓度为10mol/L)(记为Mixture)加人装有2 0 0 L细胞悬液的离心管中,混匀并置于2 5恒温培养箱中暗培养30min,每处理重复6 次。处理结束后,用蒸馏水漂洗2 次进行指标测定。1.4指标测定1.4.1RBCs原位观察随机取1个长度约为4.0cm的根尖置于载玻片上,在根尖上滴1滴蒸馏水,将根冠浸人水中数秒后滴1滴吖啶橙/溴化乙锭(A O/EB)染液,室温下避光染色3min,用NikonE-CLIPSE55i荧光显微镜观察并拍照。1.4
23、.2RBCs形态观察和数量测定在载玻片上滴1滴细胞悬液,用0.1%质量分数的番红溶液染色,再用测微尺测定细胞大小,每个细胞长度和宽度各测定3次,测定每种形态的细胞各10 个。参考Ku-bo等18 的方法,取10 L细胞悬液于细胞计数板上,滴加5L1%体积分数的台盼蓝染液,均匀混合后室温避光染色5min,立即在NikonECLIPSE55i显微镜下计数观察并统计细胞存活率,染成蓝色的为死细胞,未着色的为活细胞。每个处理重复8 次。计算细胞数量:周汐婕等:青稞根边缘细胞的发育特性及其对密花香需挥发油胁迫的响应数据为平均值标准差。2结果与分析2.1青青稞RBCs的发育特性2.1.1青稞RBCs的形态
24、特征青稞RBCs围绕根尖释放,形成RBCs群保护层(图1-A);青稞的RBCs呈弧形(图1-B)、椭圆形(图1-C)和杆形(图A1395细胞个数/mL=N/4104稀释倍数式中,N为4个16 格细胞总数。1.4.3RBCs粘胶层厚度测定参考Ropitaux等19 的方法,取细胞悬液8 L,加入8 L印度墨水均匀混合后染10 min,用NikonECLIPSE55i显微镜在明场下40 观察并拍照测量粘胶层厚度。每处理测5个细胞,每个细胞测6 个不同位置。1.4.4RBCs 活性测定参考Singh等2 0 的方法,取细胞悬液2 0 L加人离心管中,滴加8 LAO/EB混合染液并混匀,染色2 min
25、。LEI C A D M 30 0 荧光显微镜下观察并拍照。每个处理重复5次。橘红色为死细胞,绿色为活细胞。统计死亡细胞的数量和细胞总数,计算RBCs存活率:RBCs存活率=活细胞数/总细胞数10 0%1.4.5RBCs内ROS含量测定按照上海碧云天生物科技有限公司的ROS检测试剂盒操作说明,用多功能细胞分析仪(SpectraMax M2,Molecular De-vices,美国)在激发波长为48 8 nm、发射波长为52 5nm下测定 ROS 相对荧光值15 1.5数据统计与分析用SPSS20.0对相关指标进行单因素方差分析(O n e-w a y A NO VA)和Tukey检验多重比较
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