牛大力提取物对小鼠的急性毒性与遗传毒性研究.pdf
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1、 接收日期:2023-04-14 接受日期:2023-05-29 基金项目:广东普通高校重点领域(乡村振兴战略)项目(2019KZDZX2003)*通信作者。E-mail: 牛大力提取物对小鼠的急性毒性与牛大力提取物对小鼠的急性毒性与 遗传毒性研究遗传毒性研究 赵羽洁1,陈美芬2,李 欣2,张紫虹2,黄金文1,黄俊明1,张 焜1,李冬利1*(1.五邑大学生物科技与大健康学院,广东 江门 529000;2.广东省疾病预防控制中心,广东 广州 510000)摘 要:本研究评价了牛大力提取物的急性毒性和遗传毒性。采用限量法进行急性毒性试验;采用平板掺入法,对有组氨酸营养缺陷的 5 株鼠伤寒沙门氏菌突
2、变型菌株 TA97a、TA98、TA100、TA102 和 TA1535 进行回变菌落计数;经口灌胃法进行哺乳动物红细胞微核试验,计数骨髓嗜多染红细胞占总红细胞的比例及含微核嗜多染红细胞比率;采用中国仓鼠肺细胞(CHL)培养技术进行染色体畸变试验,观察受试样品牛大力提取物致 CHL 细胞株染色体数目及结构变化。结果显示,受试样品牛大力提取物属实际无毒级物质,细菌回复突变试验、红细胞微核试验、染色体畸变试验结果均为阴性。牛大力提取物在本试验剂量范围内未观察到急性毒性和遗传毒性。关键词:牛大力;急性毒性;遗传毒性 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2023.03.004 中
3、图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1009-7791(2023)03-0197-06 Acute Toxicity and Genotoxicity Test Study of Extracts from Millettia speciosa Roots ZHAO Yu-jie1,CHEN Mei-fen2,LI Xin2,ZHANG Zi-hong2,HUANG Jin-wen1,HUANG Jun-ming1,ZHANG Kun1,LI Dong-li1*(1.School of Biotechnology and Health Sciences,Wuyi University
4、,Jiangmen 529000,Guangdong China;2.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 510000,Guangdong China)Abstract:This study evaluated the acute toxicity and genotoxicity of Niudali(Millettia speciosa roots)extracts.The limit method was used in acute toxicity test.The plate
5、 incorporation method was used in bacterial revert mutation test,and five strains of Salmonella typhimurium mutant strains TA97a,TA98,TA100,TA102 and TA1535 with histidine nutritional deficiency were counted back.The proportion of bone marrow polychromatic erythrocytes in total red blood cells and t
6、he proportion of micronucleus-containing polychromatic erythrocyte were counting in mammalian erythrocyte micronucleus test.Chromosomal aberration test was carried out through Chinese hamster lung(CHL)cell culture technology,the chromosome number and structural changes of CHL cell lines infected wit
7、h samples were observed.The results showed that the tested samples were practically non-toxic,and the results of bacterial reversion mutation test,erythrocyte micronucleus test and chromosome aberration test were all negative.No acute toxicity or genotoxicity were observed within the dose range of t
8、his test for Niudali extracts.2023,52(3):197202.Subtropical Plant Science 第 52 卷 198Key words:Millettia speciosa root;acute toxicity;genetic toxicity 牛大力为豆科崖豆藤属美丽崖豆藤 Millettia specisoa 的根,主要分布于广东、广西、海南等长江流域以南地区,可供药用,具有补虚润肺、强筋活络等功效1。此外,牛大力还具有广泛的药理活性,包括免疫调节2、抗疲劳3、抗氧化4等。近年来,牛大力深受大众追捧和热爱,可用作煲汤制药的原料,市场需求
9、不断增加。根据卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知(卫法监发200251号)要求,牛大力并不在既是食品又是药品的物品名单及可用于保健食品的物品名单中。国家卫计委2018 年 6 月对“牛大力粉”申报新食品原料给出的审查结论为“鉴于该产品具有地方传统食用习惯,建议按照食品安全法第 29 条管理,终止审查”,即对牛大力有传统食用习惯的省份可通过制定食品安全地方标准进行管理。但目前对于牛大力毒性研究还不够系统1,5。因此,作者项目团队在对牛大力进行全面的食品安全性毒理学评价基础上牵头制定了广东省食品安全地方标准牛大力干制品(DBS 44/016-2021),为广东省牛大力作为食品开发和应用奠定
10、基础。本文主要报道基于食品安全国家标准610,牛大力提取物的小鼠急性经口毒性试验、细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验及体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果。1 材料与方法 1.1 试验药物 采集广东江门市恩平良西镇种植的牛大力植物新鲜根,洗净切成约 1 cm 小段,晒干或烘干。按以下方法提取:加入 10 倍体积的 50%乙醇煮沸回流提取 2 h,过滤;滤渣再以同样方法提取,过滤;滤渣用 10 倍体积水再次煮沸回流提取 2 h,过滤得滤液和滤渣;将三次滤液合并,浓缩至可流动的浸膏,尽量减小体积,得到牛大力提取物浓缩液样品。700 kg 牛大力干品经提取浓缩得到提取物浓缩液 57.0 L,重量
11、72.0 kg,提取物得率 10.3%,密度为 1.26 gmL1,浓缩比例为 12.3 g(药材)mL1。拟定牛大力干品的人体推荐每日服用量为 15 g,以成人体重 60 kg 计,推荐量为 0.25 gkg1 BW,按牛大力(提取物浓缩液)得率 10.3%折算,则牛大力(提取物浓缩液)每日推荐量为 0.02575 gkg1 BW,以下各试验均采用牛大力(提取物浓缩液)进行。1.2 供试动物 广东省医学实验动物中心提供的昆明种 SPF 级健康小白鼠,生产许可证号:SCXK(粤)2018-0002;颗粒饲料由广东省医学实验动物中心提供,使用许可证号:SYXK(粤)2018-0011;动物实验室
12、为屏障环境,室温 2026,相对湿度 40%70%。1.3 方法 1.3.1 小鼠急性经口毒性试验小鼠急性经口毒性试验 采用限量法11,选用体重 1822 g 健康昆明种小白鼠 20 只(质量合格证编号:44007200080668),雌雄各半,禁食不禁水 4 h 后,空腹灌胃 1 次,灌胃剂量为 0.3 mL10 g1 BW,观察 14 d,记录小鼠的增重量及死亡情况。1.3.2 细菌回复突变试验细菌回复突变试验 采用符合要求的 TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535等5种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株,在加及不加代谢活化系统 S9 条件下采用平板掺入法进行试验
13、11。设牛大力(提取物浓缩液)最高剂量为每皿 5000 g,按 5 倍间隔,共设五个剂量组,分别为每皿 5000、1000、200、40、8 g,以上五组受试液经过 20 min、121、0.103 MPa 高压灭菌后使用。另设各类阳性对照组、蒸馏水对照组、二甲亚砜对照组和未处理对照组。阳性对照物分别为 NaN3、2-AF、丝裂霉素 C、1,8-二羟蒽醌、2-AA和敌克松。在顶层培养基中加入 0.10 mL 试验菌株增菌液,0.10 mL 受试物溶液和 0.50 mL S9 混合液(当代谢活化时加入),混匀后倒入底层培养基平板上,每一剂量组均为 3 个平皿。置于 37 下培养48 h,记录每个
14、平皿回变菌落数,计算各试验组 3个平皿回变菌落数的均数和标准差。如在背景生长良好的条件下,测试菌株 TA98、TA1535 的回变菌落数等于或大于未处理对照组的 2 倍,测试菌株第 3 期 赵羽洁等:牛大力提取物对小鼠的急性毒性与遗传毒性研究 199TA97a、TA100、TA102 的回变菌落数等于或大于未处理对照组的 2 倍,并具有以下 a、b 两种情况之一的可判定为阳性结果:a 为有剂量-反应关系;b 为某一测试点有可重复的阳性结果。1.3.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 选择昆明种小鼠 50 只(质量合格证编号:44007200082167),体重 253
15、5 g,随机分为 5 组,每组 10 只,雌雄各半。设 10.0、5.0、2.5 gkg1 BW三个剂量组,另设阴性对照组(超纯水)和阳性对照组(40 mgkg1 BW 环磷酰胺)。采用 30 h 给受试物法进行试验,经口灌胃,灌胃剂量 0.2 mL10 g1 BW,第一次灌胃 24 h 后以同样剂量进行第二次灌胃,6 h后处死小鼠,取胸骨骨髓材料制片、染色,每只小鼠观察 2000 个嗜多染红细胞(PCE),计数含有微核的嗜多染红细胞数;若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上微核,仍按一个有微核细胞计数,计算各组含微核细胞率()。同时记录观察 200 个红细胞(RBC)中嗜多染红细胞数(PCE
16、),计算 PCE/RBC比值。1.3.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验体外哺乳类细胞染色体畸变试验 根据受试物对细胞的毒性及其溶解度,确定受试物最高剂量为 2500 gmL1,称取牛大力(提取物浓缩液)2.5 g,加 PBS 至 100.0 mL,混合均匀,以此为基础用 PBS 依次作 2 倍稀释得一系列相应剂量的染毒液(2500、1250、625 gmL1),于 121,0.103 MPa 高压灭菌 20 min 后使用,另设阴性对照组(PBS)、阳性对照组(15 gmL1环磷酰胺、0.5 gmL1丝裂霉素 C)。将中国仓鼠肺细胞(CHL)接种于六孔培养板中,接种密度 5105个孔1,置于
17、37、5%CO2培养箱中培养 24 h 后,吸去培养板中的培养液,加入不同浓度受试物溶液、S9 混合液(不加 S9 混合液时,需用培养液补足)以及一定量不含血清的培养液,置培养箱中染毒 4 h 后用 PBS 洗细胞,加入含 10%胎牛血清培养液,继续培养 24 h收获细胞,收获前 4 h 加入秋水仙素(终浓度为 1.0 gmL1)。按常规方法消化、低渗、固定、制片、Giemsa 染色,在油镜下阅片观察。每处理分别选取 100 个分散良好的中期分裂相细胞,分析染色体结构和数目改变情况,并计算染色体畸变细胞率。1.4 数据统计 采用 SPSS 16.0 统计软件分析数据。微核发生 率以含微核 PC
18、E 千分率计,均按泊松分布进行统计分析;计量数据以平均数标准差表示,采用单因素方差分析对多个试验组与对照组之间均数进行比较;其余计数资料采用卡方检验。2 结果与分析 2.1 急性毒性分析 受试样品牛大力(提取物浓缩液)20.0 gkg1 BW剂量组未观察到动物出现中毒反应和死亡,因此雌雄性小鼠 LD5020.0 gkg1 BW,相当于受试物人体推荐每日服用量的 777 倍(表 1)。按照保健食品安全性毒理学评价程序和检验方法规范中的剂量分级规定,受试样品牛大力(提取物浓缩液)属实际无毒级物质。表 1 小鼠急性经口毒性试验结果 Table 1 Results of acute oral toxi
19、city test in mice 剂量/gkg1 BW动物数/只 始重/g 终重/g 死亡数/只 LD50/gkg1 BW 雌性 20.010 19.81.234.31.2 0 20.0 雄性 20.010 20.01.035.71.1 0 20.0 2.2 细菌回复突变结果 受试样品牛大力(提取物浓缩液)对鼠伤寒沙门氏菌 TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 等 5种试验菌株的细菌回复突变结果显示,加或不加S9,五个剂量组处理的不同菌株回变菌落数均未超过未处理对照组的 2 倍,亦无剂量-反应关系或可重复的并有统计学意义的阳性反应测试点(表 2、表 3)。因此,在该试验
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