柠檬苦素对膝骨关节炎大鼠软骨损伤的影响及机制研究.pdf

2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 柠檬苦素对膝骨关节炎大鼠软骨损伤的影响及机制研究陈应奇1，朱振标2，张少明2（1.海南医学院中医学院 海口 570208；2.海口市人民医院 海口 570208）摘要：目的探讨柠檬苦素（Limonin）对膝骨关节炎（KOA）大鼠软骨损伤的影响及机制。方法采用改良Hulth法制备KOA大鼠模型，造模成功后将大鼠分为模型组、硫酸氨基葡萄糖组、柠檬苦素低剂量组和柠檬苦素高剂量组，另设置假手术组，每组10只。灌胃给予硫酸氨基葡萄糖或柠檬苦素，1次/天，连续8周。测量膝关节肿胀程度；HE染色观察软骨组织病理改变，并进行Mankin s评分；ELISA检测滑膜液中IL-1、TNF-及 MMP-13 水平；实时荧光定量 PCR、Western blot 检测软骨组织中 TLR4、MyD88 及 NF-B p65 mRNA 和蛋白表达水平。结果与假手术组比较，模型组大鼠软骨细胞排列紊乱，边缘结构破坏严重，Mankin s评分显著升高（P0.01），膝关节肿胀明显（P0.01），滑膜液中IL-1、TNF-及MMP-13水平显著增加（P0.01），软骨组织中TLR4、MyD88和NF-B p65 mRNA及蛋白表达水平均显著升高（P0.01）。与模型组比较，柠檬苦素低、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组大鼠软骨细胞分布偶见不均，但结构趋于正常，Mankin s评分均显著降低（P0.05），膝关节肿胀改善明显（P0.05），滑膜液中IL-1、TNF-及MMP-13水平均显著降低（P0.05），软骨组织中 TLR4、MyD88和 NF-B p65 mRNA 及蛋白表达水平均显著降低（P0.05）。结论柠檬苦素能明显改善KOA大鼠关节软骨损伤，其作用机制可能与抑制TLR4/NF-B信号通路有关。关键词：柠檬苦素 大鼠 膝骨关节炎 TLR4/NF-B信号通路 软骨损伤doi:10.11842/wst.20220217007 中图分类号:R285.5 文献标识码:A膝骨关节炎（Knee osteoarthritis，KOA）是骨关节炎（Osteoarthritis，OA）中最常见的类型，是以软骨破坏及滑膜增生为主要特征的一种慢性关节疾病。调查发现，随着人口老龄化和肥胖问题的加剧，世界范围内骨关节炎的患病率逐年升高，严重影响着人们的生活质量1。在中医学中，OA 是“痹症”和“骨痹”的范畴，肾精亏虚及长期劳损是主要病机。柠檬苦素是主要存在于芸香科和楝科植物中的一种三萜类化合物，特别在柑橘属中含量丰富，又名黄柏内酯、吴茱萸内酯，是植物中具有高度生物活性的次生代谢产物2。有研究表明，TLR4/NF-B信号通路的异常激活促使关节软骨细胞凋亡、滑膜组织分泌炎性因子，诱导骨关节炎的发生3。而 Kim等4提出柠檬苦素可能是核转录因子NF-B的抑制剂，通过对CD4+T细胞的抑制发挥抗炎作用。推测柠檬苦素可能会通过抑制TLR4/NF-B信号通路改善 KOA，然而柠檬苦素在 KOA发展中的作用及影响目前鲜有报道。因此，本研究拟构建KOA大鼠模型，探讨柠檬苦素对KOA的影响及可能作用机制。收稿日期：2022-02-17 修回日期：2022-08-16 海南省科学技术厅自然科学基金面上项目（820MS055）：基于CaM/CaMPK信号通路探讨丹参-川芎对多发脑梗死性痴呆（MID）大鼠影响研究，负责人：陈应奇；海口市人民医院海南省卫生健康行业科研项目（60）：基于Nrf-2/HO-1/NF-kB信号通路研究葛根总黄酮抗骨质疏松的作用机制，负责人：朱振标。通讯作者：陈应奇，副教授，硕士，主要研究方向：中医临床及教学工作。1162 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究1 材料与方法 1.1实验动物SPF级8周龄雄性SD大鼠，共50只，体质量300-350 g，由四川大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2018-026。于室温 22-24，湿度50%-60%，12 h明/暗交替的控制环境下饲养，提供充足的水源和饲料，自由进食饮水。本实验经本院动物伦理委员会审批并通过。1.2药物、试剂及仪器柠檬苦素（上海吉至生化科技有限公司，纯度 98%）；硫酸氨基葡萄糖片（新兴同仁药业有限公司）；Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）、髓样分化因子（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）、核转录因子-B p65（Nuclear transcription factor-B p65，NF-B p65）及-actin抗体（英国Abcam公司）；ECL显色液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）标记山羊抗兔抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；HE染色试剂盒、RIPA裂解缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司）；PrimeScript RT Master Mix 反 转 录 试 剂 盒、SYBR P Remix EX Taq荧光定量试剂盒（日本 TAKARA 公司）；大鼠白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子-（Tumor necrosis factor-，TNF-）及基质金属蛋白酶 13（Matrix metalloproteinase 13，MMP-13）ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；电子数显游标卡尺（分辨率 0.01 mm）（美国 PE 公司）；BioMATE 3S型蛋白、核酸浓度测定仪（美国Thermo公司）；LightCycle96 实时荧光定量聚合酶链式反应仪（美国罗氏公司）。1.3方法1.3.1动物模型制备与分组参考文献5，采用改良Hulth法建立KOA模型，将大鼠麻醉后置于手术台固定四肢，于右膝关节内侧切口暴露关节，切断关节前交叉韧带后摘除内侧半月板，缝合伤口并进行酒精消毒，术后经肌肉注射青霉素 20万 U/天，连续 3天。造模 6周后，计算机 X射线（Computed radiography，CR）片显示大鼠右膝关节内侧间隙明显变窄，关节面粗糙变形，关节边缘有明显骨赘，软骨下骨骨密度明显增高，说明KOA大鼠模型造模成功6。将造模成功大鼠随机分为模型组、硫酸氨基葡萄糖组、柠檬苦素低剂量组和柠檬苦素高剂量组，另设置假手术组大鼠，每组10只。假手术组大鼠仅打开膝关节腔后缝合伤口，不破坏韧带和半月板。根据前期毒理学实验探索的剂量范围并结合文献7，分组后硫酸氨基葡萄糖组大鼠经口灌服硫酸氨基葡萄糖（0.17 gkg-1），柠檬苦素低剂量组和柠檬苦素高剂量组大鼠分别按 20 mgkg-1、100 mgkg-1经口灌服柠檬苦素，模型组及假手术组大鼠给予等量生理盐水灌胃，每天1次，连续8周。1.3.2膝关节肿胀程度测量分别于给药0、4、8周时使用电子数显游标卡尺测量各组大鼠左右膝骨关节直径。右膝骨关节肿胀度（mm）=右膝骨关节厚度（mm）-左膝骨关节厚度（mm）。1.3.3HE染色及Mankin s评分取膝关节软骨组织，4%中性甲醛固定48 h，随后置入20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中连续浸泡10天脱钙。待组织完全脱钙后进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明，随后将组织沉于包埋盒底部浸蜡包埋，于切片机上对蜡块进行连续切片，厚度约5 m，切片先经苏木精染色，再入伊红浸染，最后中性树胶封片、镜检，并根据文献8中评分标准进行Mankin s评分。1.3.4ELISA检测暴露大鼠膝关节腔，完整剪下淡黄色滑膜组织，用生理盐水冲洗关节腔，搜集滑膜液。按照ELISA试剂盒说明书要求操作，根据标准曲线计算各组大鼠滑膜液中IL-1、TNF-以及MMP-13含量。1.3.5Real-time PCR检测取软骨组织，加入一定量 TRIzol提取总 RNA，核酸浓度测定仪测定 RNA 含量。反转录 RNA 合成cDNA第一链，按照SYBR P Remix EX Taq试剂盒说明书操作，配置PCR反应液，两步法进行PCR扩增（引物见表1），扩增标准程序：95预变性30 s，95 5 s，60 30 s，至40个循环。以-actin为内参，采用2-CT法计算 TLR4、MyD88 及 NF-B p65 mRNA 相对表达量。1.3.6Western blot检测取软骨组织，剪碎后加入裂解液混合匀浆，于提前预冷的离心机中13000 rmin-1离心10 min，取上清，提取总蛋白定量变性。将总蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。将PVDF膜置于5%脱脂奶粉中，室温条件下封闭1163 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 1 h，加入一抗稀释液（TLR4，兔抗，1 1000 稀释；MyD88，兔抗，1 1000稀释；NF-B p65，兔抗，1 1000稀释；-actin，鼠抗，1 1000稀释）4孵育过夜，回收一抗，TBST漂洗后加入二抗稀释液（1 10000稀释）继续孵育1 h。加入ECL显色液显色，检测分析显影后的条带灰度值，以-actin 表达水平作为内参，计算TLR4、MyD88、NF-B p65蛋白相对表达水平。1.4统计学处理使用SPSS 26.0软件进行数据分析，结果用均值标准差（x s）表示。多组间数据比较使用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组间数据比较使用LSD-t法。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1各组大鼠膝关节肿胀程度给药前（给药0周时），与假手术组比较，其余各组大鼠的右膝骨关节均明显肿胀（P0.01），且肿胀程度基本一致。给药4、8周时，与假手术组比较，模型组大鼠膝关节肿胀程度显著升高（P0.01）；与模型组比较，柠檬苦素各干预组和硫酸氨基葡萄糖组大鼠膝关节肿胀程度显著降低（P0.05，P0.01）。见表2。2.2各组大鼠膝关节软骨组织学变化及 Mankin s评分HE染色结果（图1）显示，假手术组关节软骨细胞排列整齐，分布均匀，无炎性细胞浸润；模型组软骨严重破坏，软骨细胞核出现浓缩，排列紊乱，结构模糊，有细胞簇集；柠檬苦素低剂量组软骨细胞出现排列紊乱、核浓缩，有少量细胞簇集，但较模型组有所改善；柠檬苦素高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组软骨细胞排列偶见不均，较模型组有较大改善，软骨结构趋于正常。Mankin s评分结果显示（表3），与假手术组比较，模型组评分显著升高（P0.01）；与模型组比较，柠檬苦素各干预组和硫酸氨基葡萄糖组评分显著降低（P0.05）。2.3各组大鼠滑膜液中 IL-1、TNF-和 MMP-13水平ELISA结果显示（表4），与假手术组比较，模型组图1各组膝关节软骨组织病理学观察（HE染色，200）表1引物序列引物名称TLR4-FTLR4-RMyD88-FMyD88-RNF-B p65-FNF-B p65-R-actin-F-actin-R序列5-TGGATACGTTTCCTTATAAG-35-GAAATGGAGGCACCCCTTC-35-TGGTGGTTGTTTCTGACGAT-35-GATCAGTCGCTTCTGTTGGA-35-GTATTGCTGTGCCTACCCGAAAC-35-GTTTGAGATCTGCCCTGATGGTAA-35-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-35-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3表2各组膝关节肿胀程度比较（x s，mm，n=10）组别假手术组模型组柠檬苦素低剂量组柠檬苦素高剂量组硫酸氨基葡萄糖组0周0.120.063.741.12*3.621.07*3.710.95*3.661.42*4周0.170.074.062.08*3.541.31#2.771.55#2.531.39#8周0.240.084.281.91*3.211.56#2.191.04#2.050.87#注：与假手术组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。1164 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究滑膜液中IL-1、TNF-和MMP-13水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，柠檬苦素各干预组和硫酸氨基葡萄糖组滑膜液中IL-1、TNF-和MMP-13水平显著降低（P0.05）。2.4各组大鼠软骨组织中 TLR4、MyD88 和 NF-B p65 mRNA表达水平Real-time PCR 结果显示（表 5），与假手术组比较，模型组软骨组织中 TLR4、MyD88 和 NF-B p65 mRNA表达水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，柠檬苦素各干预组和硫酸氨基葡萄糖组软骨组织中TLR4、MyD88和NF-B p65 mRNA表达水平显著降低（P0.05）。2.5各组大鼠软骨组织中 TLR4/NF-B信号通路相关蛋白表达水平Western blot结果显示（图2、表6），与假手术组比较，模型组软骨组织中TLR4、MyD88和NF-B p65蛋白表达水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，柠檬苦素各干预组和硫酸氨基葡萄糖组软骨组织中TLR4、MyD88 和 NF-B p65 蛋白表达水平显著降低（P0.05）。3 讨论与结论 3.1研究柠檬苦素对KOA治疗效果的意义膝骨关节炎（KOA）多发于中老年人，患者会出现膝关节软骨退变、骨赘形成，严重者可出现关节畸形，进而致残9。目前KOA的临床治疗以药物治疗和手术治疗为主，手术治疗仅适用于KOA终末期保守治疗已无明显效果的情况，西医推荐KOA早、中期治疗使用局部或口服非甾体消炎药（Non-steroidal anti-inflammatory，NSAID），但使用 NSAID 会增加心血管疾病风险，因此，疗效显著且副作用小的中医药治疗KOA成为研究热门10。本研究通过证明柠檬苦素对 KOA的治疗作用及相关机制，以期为后续开发以柠檬苦素为主要成分的中医药药物参与KOA临床治疗提供依据。3.2阳性药物设置依据及目的相关研究表明11，NF-B通路可通过TLR4早期激表4各组滑膜液中IL-1、TNF-和MMP-13含量（x s，n=10）组别假手术组模型组柠檬苦素低剂量组柠檬苦素高剂量组硫酸氨基葡萄糖组IL-1（pgmL-1）57.467.03172.1814.51*133.2612.09#75.348.30#70.618.12#TNF-（pgmL-1）20.574.4862.949.53*54.646.22#35.884.62#31.814.16#MMP-13（pgmL-1）804.95126.121538.62263.05*1264.91202.16#951.34183.43#897.52160.09#注：与假手术组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。表5各组软骨组织中TLR4、MyD88和NF-B p65 mRNA相对表达水平（x s，n=10）组别假手术组模型组柠檬苦素低剂量组柠檬苦素高剂量组硫酸氨基葡萄糖组TLR4 mRNA0.980.047.221.35*5.380.94#3.720.42#3.950.61#MyD88 mRNA1.030.056.541.21*5.070.75#2.660.37#3.080.42#NF-B p65 mRNA0.860.032.920.56*2.210.40#1.340.36#1.460.51#注：与假手术组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。图2各组软骨组织中TLR4/NF-B信号通路相关蛋白表达水平注：1：假手术组；2：模型组；3：柠檬苦素低剂量组；4：柠檬苦素高剂量组；5：硫酸氨基葡萄糖组。表6各组软骨组织中TLR4/NF-B信号通路相关蛋白相对表达水平（x s，n=10）组别假手术组模型组柠檬苦素低剂量组柠檬苦素高剂量组硫酸氨基葡萄糖组TLR4 蛋白0.080.020.930.10*0.280.07#0.150.02#0.190.03#MyD88 蛋白0.030.021.040.11*0.370.09#0.160.07#0.210.02#NF-B p65 蛋白0.040.031.070.10*0.260.07#0.110.06#0.130.07#注：与假手术组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。表3各组改良Mankin s评分比较（x s，分，n=10）组别假手术组模型组柠檬苦素低剂量组柠檬苦素高剂量组硫酸氨基葡萄糖组Mankin s评分0.330.1413.673.54*9.332.62#4.681.31#3.781.56#注：与假手术组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05，#P0.01。1165 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 活免疫因素进而触发滑膜分泌炎性因子，滑膜增生增加并介导KOA的发生。硫酸氨基葡萄糖可抑制胶原酶对关节软骨的损害，是人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的重要成分，也是目前临床上治疗骨关节炎的常用药物，同时有研究发现硫酸氨基葡萄糖可抑制NF-B激活12，故将其设置为阳性药物，为柠檬苦素对KOA的治疗效果增加可比性。3.3柠檬苦素对KOA大鼠病理学改变及炎症反应的治疗作用本研究HE染色结果显示，模型组大鼠软骨细胞排列紊乱，软骨组织病理改变明显，Mankin s评分及各时间点膝关节肿胀程度较假手术组显著升高，以上提示KOA大鼠造模成功。柠檬苦素治疗后大鼠软骨结构趋于正常，关节软骨表面光滑，Mankin s评分及各时间点膝关节肿胀程度较模型组显著降低，说明柠檬苦素可以促进KOA大鼠软骨修复，有效地改善KOA大鼠软骨损伤。相关研究显示，KOA患者血清中炎症因子TNF-和IL-1含量显著升高，通过抑制其表达，可有效改善KOA患者临床症状13。TNF-常通过促使软骨细胞和滑膜细胞分泌IL-1，从而改变软骨细胞微环境、破坏软骨细胞，加重滑膜炎症反应14。MMPs是一种可降解细胞外基质的蛋白酶，MMP-13作为MMPs家族中的一员，其通过降解关节软骨细胞外基质和促进滑膜炎症反应，参与KOA的发展过程，所以MMP-13的表达水平也是反映KOA病变程度的重要指标之一15。本研究结果显示，经柠檬苦素治疗后大鼠滑膜液中IL-1、TNF-及MMP-13水平较模型组显著降低，提示柠檬苦素可通过下调相关炎症因子表达，有效地减轻KOA大鼠膝关节炎症反应。3.4柠檬苦素治疗KOA的可能机制TLR4/NF-B信号通路主要介导着先天性免疫和炎症反应，NF-B是广泛存在于胞浆的一种快反应转录因子，一般由p65和p50两个亚基组成，通常与其抑制性蛋白结合而呈非活性状态，可被TLR4/MyD88信号通路等多种刺激因素激活16。有研究表明，TLR4/NF-B信号通路在膝骨关节炎发展过程中异常活化，TLR4蛋白高表达于膝骨关节炎软骨细胞中，参与软骨破坏，与膝骨关节炎发病机制密切相关17。而TLR4的信号转导通过相应的配体与MyD88结合，激活下游转录因子NF-B，诱导IL-1、TNF-等炎症细胞因子的表达，进一步加重炎症反应18。本研究结果显示，经柠檬苦素治疗后，在基因和蛋白层面大鼠软骨组织中TLR4、MyD88及NF-B p65 mRNA和蛋白表达较模型组均显著降低。考虑柠檬苦素可能是通过调控TLR4、MyD88 及 NF-B p65 基因和蛋白，抑制 TLR4/NF-B信号通路的激活，减少炎症因子表达，从而达到治疗KOA的目的。3.5结论综上所述，柠檬苦素可能是通过抑制 TLR4/NF-B信号通路活化，进而调控IL-1、TNF-和MMP-13炎症因子表达，起到改善KOA大鼠软骨损伤的作用。本研究结果从动物水平证明了柠檬苦素对KOA病理损伤、炎症损伤的治疗作用及可能机制，为中医药治疗KOA提供了新的思路，在后续研究中还将深入发掘柠檬苦素对KOA病机的影响。参考文献 21靳天,程志祥.膝骨关节炎非手术治疗的现状与思考.中华医学杂志,2021,101(43):3525-3527.2尤文挺,王洒,何龙,等.柠檬苦素单体的药理活性研究进展.中药材,2017,40(1):242-246.3Ding Y J,Wang L F,Zhao Q,et al.MicroRNA-93 inhibits chondrocyte apoptosis and inflammation in osteoarthritis by targeting the TLR4/NF-B signaling pathway.Int J Mol Med,2019,43(2):779-790.4Kim W,Fan Y Y,Smith R,et al.Dietary curcumin and limonin suppress CD4+T-cell proliferation and interleukin-2 production in mice.J Nutr,2009,139(5):1042-1048.5王云峰,白人骁,张扬,等.改良Hulth模型复制膝不同时期骨关节炎的实验研究.天津医科大学学报,2009,15(3):400-404.6陈俊,林洁,赵忠胜,等.乌头汤对膝骨关节炎模型大鼠滑膜组织TLR4/NF-B 信号通路的影响.中国组织工程研究,2019,23(27):4381-4386.7张媛媛,李西海,吴明霞.电针调节Wnt/-catenin信号通路抑制大鼠膝骨关节炎软骨退变的研究.中国针灸,2019,39(10):1081-1086.8Jin J,Lv X,Wang B,et al.Limonin inhibits IL-1-induced inflammation and catabolism in chondrocytes and ameliorates osteoarthritis by activating Nrf2.Oxid Med Cell 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performed;The levels of IL-1,TNF-and MMP-13 in synovial fluid were determined by ELISA;The mRNA and protein expression levels of TLR4,MyD88 and NF-B P65 in cartilage tissues were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot.ResultsCompared with sham operation group,model group rats chondrocytes were disorderly arranged,and the edge structure was seriously damaged,and Mankins score was significantly increased(P0.01),the knee joint swelling significantly(P0.01),IL-1,TNF-and MMP-13 levels in synovial fluid were significantly increased(P0.01),mRNA and protein expression levels of TLR4,MyD88 and NF-B p65 in cartilage were significantly increased(P0.01).Compare with the model group,the distribution of chondrocytes in limonin low-dose and high-dose groups and glucosamine sulfate groups was occasionally uneven,but the structure tended to be normal,and Mankins score was significantly decreased(P0.05),swelling in the knee joint to improve significantly(P0.05),IL-1,TNF-and MMP-13 levels in synovial fluid were significantly decreased(P0.05),mRNA and protein expression levels of TLR4,MyD88 and NF-B p65 in cartilage tissues were significantly decreased(P0.05).ConclusionLimonin can significantly improve articular cartilage injury in KOA rats,and the mechanism may be related to the inhibition of TLR4/NF-B signaling pathway.Keywords:Limonin,Rat,Knee osteoarthritis,TLR4/NF-B signaling pathway,Cartilage damage（责任编辑：李青）1167