漆树WRKY转录因子基因家族生物信息学分析.pdf
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1、西北林学院学报2 0 2 3,3 8(4):1 1 1-1 1 8J o u r n a l o f N o r t h w e s t F o r e s t r y U n i v e r s i t y d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-7 4 6 1.2 0 2 3.0 4.1 4漆树WR KY转录因子基因家族生物信息学分析 收稿日期:2 0 2 2-0 5-2 4 修回日期:2 0 2 2-0 7-0 4 基金项目:“十三五”国家重点研发计划(2 0 1 7 Y F D 0 6 0 0 7 0 5)。第一作者:肖纪元。研究方向:植物分子生物学。E
2、-m a i l:x j y n w a f u.e d u.c n*通信作者:刘朝斌,博士,副教授。研究方向:林木育种及栽培技术。E-m a i l:l i u c h a o b i n 1 2 6.c o m肖纪元,白航宇,宋金禄,张智雯,赵爱国,刘朝斌*(西北农林科技大学 林学院,陕西 杨陵 7 1 2 1 0 0)摘 要:漆树作为中国古老的经济树种,具有巨大的经济价值。WR KY转录因子是植物抗逆过程中最为常见的蛋白家族。为探索WR KY转录因子在漆树生长发育及抗逆境胁迫中的作用,以漆树转录组测序结果为试验材料,通过对保守结构域分析和多序列比对,共筛选出2 0个具有WR KY保守域的
3、基因,根据WR KY结构特征,将筛选出的基因分为3组,其中组根据保守基序分析又可分为5个亚组。通过构建漆树和拟南芥WRKY基因家族系统进化树,分析漆树WRKY基因同源性,并根据其与拟南芥同源漆树基因进行功能预测。同时,对漆树WR KY转录因子在漆树不同部位 的 差 异 表 达 做 分 析,T v WRKY 2、T v WRKY 1 1、T v WRKY 1 4、T v WRKY 1 6、T v WRKY 1 7、T v WRKY 1 9、T v WRKY 8、T v WRKY 1 5在根中表达水平上调。通过对漆树WR KY转录因子基因家族进行系统的生物信息学分析,为进一步分析特定WRKY基因功
4、能提供了参考,同时为后续深入研究漆树WR KY蛋白的结构与功能奠定了理论基础。关键词:漆树(T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m);WR KY;转录因子;生物信息学中图分类号:S 7 1 8.4 6 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 1-7 4 6 1(2 0 2 3)0 4-0 1 1 1-0 8B i o i n f o r m a t i c s A n a l y s i s o f WRKY T r a n s c r i p i t i o n F a c t o r F a m i l y i n T o x i
5、c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u mX I A O J i-y u a n,B A I H a n g-y u,S O N G J i n-l u,Z H A N G Z h i-w e n,Z H A O A i-g u o,L I U C h a o-b i n*(C o l l e g e o f F o r e s t r y,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g 7 1 2 1 0 0,S h a a n x i,C h i n a)A b s t r a c
6、t:A s a n a n c i e n t n o n-t i m b e r t r e e s p e c i e s i n C h i n a,T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m t r e e s h a v e g r e a t e c o-n o m i c v a l u e.I n o r d e r t o e x p l o r e t h e r o l e o f WR KY t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n t h e g r o w t h
7、a n d d e v e l o p m e n t o f T.v e r n i c i f l u u m t r e e a n d t h e r e s i s t a n c e t o s t r e s s,t a k i n g t h e s e q u e n c i n g r e s u l t s o f t h e t r e e t r a n s c r i p t o m e a s e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s,t h r o u g h t h e a n a l y s i s o f c o
8、n s e r v e d d o m a i n a n d m u l t i s e q u e n c e a l i g n m e n t,a t o t a l o f 2 0 g e n e s w i t h WR KY c o n s e r v e d d o m a i n w e r e s c r e e n e d.A c c o r d i n g t o t h e s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f WR KY,t h e s c r e e n e d g e n e s w e r
9、e d i v i d e d i n t o t h r e e g r o u p s,o f w h i c h g r o u p c o u l d b e d i v i d e d i n t o f i v e s u b g r o u p s a c c o r d i n g t o t h e a n a l y s i s o f c o n s e r v e d m o t i f.B y c o n s t r u c t i n g t h e p h y l o g e n e t i c t r e e o f T.v e r n i c-i f l u
10、u m a n d A r a b i d o p s i s WRKY g e n e f a m i l y,t h e h o m o l o g y o f WRKY g e n e w a s a n a l y z e d,a n d i t s f u n c t i o n w a s p r e d i c t e d a c c o r d i n g t o t h e h o m o l o g o u s w i t h A r a b i d o p s i s.A t t h e s a m e t i m e,d i f f e r e n t i a l e
11、x p r e s s i o n o f T.v e r n i c i f l u u m WRKY t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n d i f f e r e n t t i s s u e s w a s a n a l y z e d.T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f T v WRKY 2,1 1,1 4,1 6,1 7,1 9,8 a n d 1 5 w e r e u p-r e g u l a t e d i n t h e r o o t.T h e s t u d y
12、c o n d u c t s a s y s t e m a t i c b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f T.v e r n i c i f l u u m WRKY t r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y,w h i c h p r o v i d e s a r e f e r e n c e f o r f u r t h e r a n a l y s i s o f s p e c i f i c WRKY f u n c t i o n s,a n d l
13、a i d a t h e o r e t i c a l f o u n d a t i o n f o r t h e f o l l o w-u p i n-d e p t h s t u d y o f t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f WR KY p r o t e i n.K e y w o r d s:T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m;WR KY;t r a n s c r i p t i o n f a c t o r;b i o i n f o
14、r m a t i c s 漆树(T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m)是漆树科(A n a c a r d i a c e a e)漆属(T o x i c o d e n d r o n)植物,分布在亚热带地区,落叶乔木或小乔木。漆树分泌的生漆是天然树脂涂料,生漆中近8 0%成分是漆酚,具备极佳的耐腐蚀性、耐磨性、耐热性、隔水性、电绝缘性等物理化学特性,在军工领域也十分重要1。利用生漆制成的漆器,具有很高的文化艺术价值,中国漆艺传承七千多年,是世界文化宝库的珍贵资源2。国内外学者在对漆树的研究中,多集中于漆树的栽培、生漆提取加工
15、,以及漆树中其余化学成分的研究,对于漆树WR KY转录因子家族基因的研究较少,且经过研究发现,WR KY转录因子在多种生物和非生物胁迫过程中调节各种信号转导通路发挥了关键作用。这些转录因子通过调节不同的信号转导途径,参与植物的各种过程,包括营养剥夺、胚胎发生、种子和毛发发育、衰老以及其他发育和激素调控过程3以及应对病菌虫害等生物胁迫反应和冷害、干旱、高盐等非生物胁迫4,是植物生命活动中重要的调控枢纽,参与了生长发育过程以及非生物逆境胁迫响应5。WR KY转录因子不是局限于单个基因的分析,从1 9 9 4年第1个WR KY转录因子基因被克隆得到,到目前为止,研究人员对WR KY转录因子生物学功能
16、进行了广泛的研究,筛选并鉴定出几十种高等植物的WR KY转录因子,其中拟南芥7 4个、木瓜6 6个、小立碗藓3 8个6、高粱6 8个、卷柏3 5个、松树8 0个、大麦4 5个、杨树1 0 4个、大豆1 9 7个WRKY基因7,并对WRKY对植物生理生化影响做了系统的研究。国外科学家针对拟南芥WR KY转录因子单基因在植物生长发育过程中以及生物和非生物胁迫应 答过程中 的作用 进 行 了 较 多 的 分析8,但仍有部分基因作用机制以及功能不完全清楚,关于WR KY转录因子在高等植物中的功能挖掘及作用机制的研究仍有挑战。随着部分高等植物测序的完成,越来越多的生物信息学方法用于鉴定和分析WR KY转
17、录因子9,为研究WRKY基因的作用机制提供了初步研究,为WRKY成员用于转基因植物改良植物遗传提供了新的基因资源。本研究以漆树为研究对象,对漆树WR KY转录因子家族进行系统的生物信息学分析,包括漆树WR KY转录因子筛选、WR KY家族保守结构域分析、多序列比对,保守基序分析,系统进化树构建以及WRKY在漆树不同部位的表达模式分析,对漆树WRKY基因家族做一个初步筛选以及功能预测,为漆树以及相近漆树科植物中WR KY转录因子的深入研究提供一定的参考和理论依据。为传统育种结合转基因操作等方法用以提高植物的胁迫耐受性,培育选育抗逆植物新种质,改良漆树的抗逆性提供相关理论依据及前期准备。1 材料与
18、方法1.1 试验材料采自西北农林科技大学漆树园(3 4 1 5 5 4 N,1 0 8 5 4 1 E)的2年生漆树 大红袍,随机采取生长较为均匀的漆树(T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m),并采集其幼嫩的根、茎、叶。漆酶基因源于实验室已构建的漆树转录组数据库(登录号:P R J NA 5 8 7 8 3 0)。漆树的转录组数据为大红袍漆树根、茎、叶转录组 测 序 数 据,N C B I数 据 库 获 取 号 为P R J-NA 5 8 7 8 3 0。1.2 漆树WR K Y转录因子筛选将B L A S T和HMME R两种方法
19、相结合的,从拟南芥转录因子数据库下载WR KY转录因子序列,获得拟南芥中WRKY基因家族成员的I D及所有基 因 的c D NA序 列、基 因 组 序 列 和 氨 基 酸 序列1 0。用每一个基因的氨基酸序列作为Q u a r y,对漆树转录组数据进行本地B L A S T P搜索,将结果中E值(e x p e c t v a l u e)1 e-2 0的基因作为初步的候选基因,筛选出WRKY基因并剔除不完整的基因以及长度小于3 0 0个碱基的WRKY基因1 1。为确保无基因遗漏,从P f a m数据库中下载保守结构域的HMM(H i d d e n M a r k o v M o d e l
20、)文 件:WRKY(P F 0 3 1 0 6)。利用HMME R 3.0中h mm b u i l d建立模型,进 而 通 过h mm s e a r c h检 索 漆 树 中 具 有WRKY D NA-b i n d i n g d o m a i n保守结构域的候选蛋白序列,设置E值为1 e-2 01 2。综合2种方法得到的结果,手动去除冗余后获得目的序列。1.3 漆树WR K Y家族保守结构域分析利用O R F f i n d e r将筛选出的WR KY转录因子翻译成蛋白质,借助E x P A S y提供的一系列的蛋白质理化性质的工具,使用P r o t P a r a m(h t t
21、 p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)在线工具线上分析漆树家族基因编码蛋白的理化性质。预测家族成员的等电点(P I)、相对分子质量、氨基酸长度、蛋白质亲疏水性等性质。1.4 漆树WR K Y家族保守结构域分析通过 美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心N C B I的C D D(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c t u r e/c d d/w r p s b.c g i)与B i t c h(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h
22、.g o v/b i t c h)1 3对筛选出的漆树WRKY基因进行保守结构域分析,筛选出其中含有WR KY保守结构域的基因序列。其中,C D D只可以进行单条序211西北林学院学报3 8卷 列分析,B i t c h可以选择文件来上传,也可以直接输入批量递交多条序列,所以研究过程中先把所有的漆树WRKY基因序列放入一个文件上传到B i t c h,批量进行 保守结构域 分 析 后,再 用C D D对 通 过B i t c h筛 选 出 的 不 具 有WR KY保 守 结 构 域 的WR KY序列单个进行确认,以保证保守结构域分析的准 确 性。将 蛋 白 序 列 导 入U n i p r o
23、 t(h t t p s:/www.u n i p r o t.o r g/a l i g n/)进行序列对齐处理,将得到的序列保存为f a s t a格式,导入G e n e D o c中获得保守结构域对比图。1.5 漆树WR K Y转录因子的多序列比对利用O R F f i n d e r将得到的WR KY蛋白序列通过线上工具U n i p o r t(h t t p s:/www.u n i p r o t.o r g/a-l i g n/)对齐并转换为F a s t a格式,并导入到G e n e D o c中,进行多序列比对。参照E u l g e m等对WRKY基因家族的分类标准,
24、将鉴定得到的候选漆树WR KY转录因子基因家族成员进行分类。通过多序列对比导出的F a s t a文件,根据多序列对比的分类结果,利用G e n e D o c进行漆树WRKY家族保守结构域类别比对分析1 4。1.6 漆树WR K Y蛋白保守位点分析利用在线软件MEME(M u l t i p l e E x p e c t a t i o n M a x i m i z a t i o n f o r M o t i f E l i c i t a t i o n)(h t t p:/m e m e-s u i t e.o r g/t o o l s/m e m e)进 行 预 测1 1,对
25、 漆 树WR KY蛋白家族的保守基序进行分析,参数设置为1 0个m o t i f,基序位点设置为序列出现次或0次,最大基序 5 0,最小基序 6得到相关性最高的保守元件。分析图片利用T B o o l s进行处理美化1 5。1.7 漆树WR K Y转录因子系统进化树的构建下载拟南芥WRKY基因序列(h t t p:/p l a n t-t f d b.c b i.p k u.e d u.c n),进行系统进化树的构建,由于转录因子类亚家族有2个WR KY保守结构域,将N端C端分别命名为-N和-C亚组,独立参与构建。将拟南芥WRKY数据与筛选出的具有WR KY保守结构域的漆树序列以f a s
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