酸枣仁汤对持续光照干预小鼠行为学的影响.pdf

2023 年第 24 卷第 7 期727实验中医药学727酸枣仁汤对持续光照干预小鼠行为学的影响吴新义，金秀梅，崔真胜，肖云龙，张凯文（西南医科大学中西医结合学院/附属中医医院，四川 泸州 646000）摘要 目的：建立与证候相关的昼夜节律紊乱睡眠障碍动物模型并探讨酸枣仁汤对其行为学的影响。方法：将35只小鼠随机分为实验组、建模组、对照组，实验组与建模组行持续强光照干预后，实验组给予不同浓度酸枣仁汤灌胃，以饮食饮水量、毛色尾色、暴躁程度为指标，观察实验组、建模组的行为学变化。结果：实验组、建模组与对照组相比均出现暴燥、活动度增强等现象，提示持续光照干预有效；实验组给药后饮食饮水量、毛色尾色和体质量均较建模组更接近于对照组，其暴躁程度较建模组显著减弱。结论：酸枣仁汤可显著缓解持续光照导致小鼠阴阳失调、肝火旺盛所致的烦躁、脾胃不和等症状，从而提高睡眠质量，同时也进一步证实昼夜节律紊乱可降低睡眠质量。关键词 睡眠障碍；动物模型；酸枣仁汤；光照；昼夜节律中图分类号：R289.5 文献标识码：A DOI：10.19763/ki.2096-7403.2023.07.05Effect of Suanzaoren Decoction on the behavior of mice interfered by continuous illuminationWuXinyi，JinXiumei，CuiZhensheng，XiaoYunlong，ZhangKaiwen（CollegeofIntegratedChineseandWesternMedicine，SouthwestMedicalUniversity，AffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicine，LuzhouSichuan646000）Abstract Objective：ToestablishtheanimalmodelofsleepdisorderswithcircadianrhythmdisturbancerelatedtosyndromeandexploretheeffectofSuanzaorenDecoctiononthebehaviorofmice.Methods：Atotalof35micewererandomlydividedintotheexperimentalgroup，themodelinggroup，andthecontrolgroup.TheexperimentalgroupandthemodelinggroupweregivendifferentconcentrationsofSuanzaorenDecoctionaftercontinuousstrongilluminationintervention.Thebehavioralchangesoftheexperimentalgroupandthemodelinggroupwereobservedbytakingfoodandwaterintake，haircolorandtailcolor，andirritabilitydegreeasindicators.Results：Comparedwiththecontrolgroup，boththeexperimentalgroupandthemodelinggroupshowedirritabilityandincreasedactivity，whichsuggestedthatthecontinuousilluminationinterventionwaseffective.Afteradministration，thechangesoffoodandwaterintake，haircolorandtailcolorandbodyweightintheexperimentalgroupwereclosertothoseinthecontrolgroupthanthoseinthemodelinggroup，andthedegreeofirritabilityintheexperimentalgroupwassignificantlyreducedthanthatinthemodelinggroup.Conclusion：SuanzaorenDecoctioncansignificantlyalleviatethesymptomsofirritabilityanddisharmonybetweenspleenandstomachduetoimbalanceofYinandYangandhyperactivityofliver-firecausedbycontinuousillumination，therebyimprovingsleepqualityinmice.Itisfurtherconfirmedthatcircadianrhythmdisturbancecanreducesleepquality.Keywords sleepdisorders；animalmodel；SuanzaorenDecoction；illumination；circadianrhythm基金项目西南医科大学国家级大学生创新创业训练项目（202110632044）作者简介 吴新义，在读本科，Email：通讯作者 张凯文，硕士，助教，Email：睡眠是指周期性出现的一种自发的和可逆的静息状态，是新陈代谢速率降低但大脑活动仍然活跃的生理状态。睡眠时间约占人类总生命时长的1/3，是每个人必不可少的生命活动1。睡眠受内环境稳态和生物节律的双重调控，最佳的睡眠状态是内环境稳态和生物节律的同步化2。由于当今社会生活节奏加快，工作学习压力增大，夜间工作学习甚至娱乐时间延长，使得睡眠稳态和生物节律无法同步化，睡眠障碍的情况愈发严重3。临床上，西医治疗睡眠障碍常采用传统镇静安眠药如苯二氮卓类，但其成瘾性、依赖性、对日间睡眠觉醒度的影响、抑制呼吸等不良反应明显，不适于长期使用4。中医药以其不良反应小，疗效佳在睡眠障碍的治疗上显现出独特的优势5-6，酸枣仁汤具有镇静催眠之效7，能够有效改善患者的睡眠质量及睡眠觉醒周期相关调节因子水平，且安全性高8，是治疗睡眠障碍的代表方剂。研究酸枣仁汤在昼夜节律紊乱这一睡眠障碍人群中的运用有非常大的临床意义和实用价值。但临床未有此类人群相应动物模型和中医证型评价，故课题组用延长光照时间的自然模型法建模，模拟夜间工作学习娱乐使昼夜节律紊乱而2023 Vol.24 No.7728实验中医药学728延迟入睡时间，延长入睡时长，加大入睡难度从而导致的睡眠障碍模型，并以实验组小鼠的饮食饮水量变化、暴燥程度、毛色尾色等行为学变化为指标，探讨酸枣仁汤对此类睡眠障碍的疗效。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物健康清洁级雄性6w龄昆明种（KM）小鼠35只，体质量（205）g，由西南医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（川）2018-17，饲喂于西南医科大学实验动物中心SPF屏障系统，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2018-065，饲养及管理均严格按照实验动物饲养原则以及管理要求。本研究由西南医科大学实验动物伦理委员会批准，批准文号：swmu202300731.1.2 实验药物酸枣仁汤按照金匮要略 血痹虚劳病脉证并治第六 原方取量：酸枣仁二升（15g），甘草一两（3g），知母二两（6g），茯苓二两（6g），川芎二两（6g），均购于西南医科大学附属中医医院。酸枣仁汤药物总质量36g，取人体平均体质量60kg，故人体用药量为0.6g/kg，按照不同种实验动物间千克体质量剂量折算系数法9，得小鼠用药量为5.4g/kg，取小鼠平均体质量为0.04kg，得每只灌药量为0.216g。药物按照原方煎法“上五味，以水八升，煮酸枣仁，得六升，内诸药，煮取三升”，即加入1600ml水10先煮酸枣仁，药液煎煮至1200ml时，加入余下5味，继续煎煮至600ml，将所得溶液浓缩制成0.6g/ml的酸枣仁汤药液60ml（另有0.06g/ml低浓度组60ml，以相同方法获得），置于4冰箱保存备用。1.1.3 实验仪器灌胃针（北京创博环球生物科技有限公司，10#55mm），1ml普通塑料注射器（安徽增志医疗器械销售有限公司），实验用照明灯（广东久量光电科技有限公司，DP1063A），小鼠电子称（河南智科生物科技有限公司，ZK-DST），数码摄像头（小米科技有限责任公司，云台版2k）。1.2 实验方法1.2.1 动物分组与模型制备将35只KM种小鼠采用随机数字表法分为对照组（10只）、实验组（10只）、建模组（15只）3组。各组小鼠在相同正常条件下适应性饲养4d后，对照组保持正常昼夜更替，将建模组和实验组小鼠放入自制黑箱中，放置照明灯为唯一光源，24h持续照射进行睡眠剥夺，以打乱小鼠正常昼夜节律，使其发生睡眠障碍。持续适应性低光照10d后，加强光照强度（增加照明灯数量）7d，饲养期间小鼠自由进食及饮水，温度（255），适应性饲养期间光暗周期12h/12h，光照建模期间光暗周期24h/0h，实验期间用数码摄像机观察小鼠饮食饮水量、活动情况、精神状态等。1.2.2 造模成功标准实验组和建模组小鼠早期表现为一定的兴奋行为，如活动度增加、暴躁、攻击性增加等，实验后期行为由兴奋转为抑制状态，表现为活动度减少、萎靡不振，毛色暗淡等疲劳状态11，模型制备中小鼠出现异常兴奋状态并持续3d即为建模成功。同时，睡眠障碍模型建立后小鼠饮食量降低，体质量增加减少12。1.2.3 给药方法沈鸿等13研究表明酸枣仁汤药效与给药天数有依赖关系，且给药天数与自发活动次数呈正相关，故给药天数不宜过多，为增加实验重复性，实验选取3d为给药时长。建模成功后于每日中午13 00（小鼠正常睡眠时间）对实验组小鼠予低浓度（生药量0.06g/ml）酸枣仁汤药液0.4ml/d，灌胃3d，以排除药物不良反应及灌胃造成的应激状态，3d后于相同条件下对实验组小鼠灌胃高浓度（相当于生药量0.6g/ml）酸枣仁汤药液0.4ml/d，继续灌胃3d，建模组和对照组在给药期间均在相同时间灌胃等体积生理盐水。1.2.4 检测指标与方法实验过程中记录建模前、建模后、给药后各组小鼠体质量变化。给药期间每天对各组小鼠饮水量、饮食量进行记录，每天采用数码摄像机进行录像监控，观察并记录小鼠的睡眠觉醒行为、行为学变化，包括精神状态、活动情况、毛色、尾爪、进食、反应灵敏度和警惕性等。1.3 统计学方法采用SPSS29.0统计学软件进行统计分析，2023 年第 24 卷第 7 期729实验中医药学729计量资料以均数标准差（xs）表示，小鼠各组间饮食饮水量比较用秩和检验，各组间体质量比较采用独立样本t检验，P0.05），造模后实验组和建模组体质量均低于对照组，且与对照组相比差异均有统计学意义（P0.05），推测其原因与失眠模型影响小鼠脾胃运化有关，给药后实验组、建模组体质量仍低于对照组，但实验组体质量增加值大于建模组（P0.01），差异有统计学意义。结果见表4。3 讨 论3.1 建模原因及依据睡眠障碍是睡眠-觉醒正常节律性交替紊乱的表现，是指睡眠的量、质或定时的异常，可由躯体性疾病、生理因素（时间）、心理因素（焦虑抑郁）、环境等多种因素引起14，可表现为失眠、早醒、易醒、多梦、睡眠觉醒节律障碍和睡眠呼吸障碍等多种形式。由于社会压力的增大、娱乐活动不节制等原因，夜间工作或娱乐时间延长，昼夜节律紊乱，使睡眠障碍发生率逐年升高，相关研究显示世界上有40%50%的人口睡眠不足15。根据“2020中国睡眠指数报告”显示，在中国有超过3亿人出现睡眠障碍，其中36.1的成年人会发生经常性失眠，青少年失眠的发生率约16.57%38.2%16-17。以西南医科大学的学生群体为例，本研究前期调查了150例西南医科大学在校大学生（0例脱落，150例纳入最终研究），结果显示有睡眠问题为95例，睡表 1 行为学变化组别n建模前建模后低剂量给药 高剂量给药对照组10-建模组15-+实验组10-+注：暴躁程度、毛色尾色变化以对照组为标准，+越多表明与对照组相差越大，-为正常表2 酸枣仁汤对睡眠障碍模型小鼠饮食量的影响（g，xs）组别n造模后低剂量给药后高剂量给药后对照组107.82.78.32.94.21.0建模组154.81.57.22.53.00.5实验组105.31.87.32.64.31.2表3酸枣仁汤对睡眠障碍模型小鼠饮水量的影响（ml，xs）组别n造模后低剂量给药后高剂量给药后对照组107.92.48.72.17.52.5建模组156.82.410.63.66.92.8实验组108.10.810.02.947.72.1表4酸枣仁汤对睡眠障碍模型小鼠体质量的影响（g，xs）组别n造模前造模后给药后对照组1028.94.234.55.035.26.1建模组1529.64.134.06.71）33.97.62）实验组1028.92.233.02.01）33.22.0注：与对照组相同时间点比较，1）P0.05；与实验组相同时间点比较，2）P0.012023 Vol.24 No.7730实验中医药学730眠问题发生率为63.33%（95/150），没有睡眠问题的有55例（36.67%）；95例有睡眠问题大学生中，睡眠问题超过3个月的37例，即慢性失眠发生率38.95%；其睡眠问题的主要类型：入睡困难38.95%（37/95），易醒14.74%（14/95），对其睡眠质量分析参照中医生命质量评价量表中睡眠质量评价条例18，结果显示仅有42.11%的人表示随时随地可以入睡，而入睡时间在30min以上占比达到38.95%，有14.74%的人表示入睡后易被细小的声音吵醒，有25.26%的人夜间觉醒次数在两次以上，仅有13.68%的人能保证8h以上的睡眠，甚至有10.53%的人大多数时间睡眠时间在6h以下。故问卷调查结果显示该类人群睡眠质量差、睡眠时间少。在此基础上，进一步分析影响其睡眠的危险因素，发现其产生睡眠问题的主要原因为学习工作压力大（64.21%）和电子产品（58.95%）使睡眠时间推迟（其入睡时间在231点之间的人数最多，达73.68%），导致昼夜节律紊乱，产生睡眠障碍。而昼夜节律紊乱导致的睡眠问题其影响因素的特异性使西医的化学因素、强迫运动等造模方法不能满足中医临床病证需求，理想的动物模型需遵循以下原则，动物疾病模型与人类疾病具有相似的发生、发展过程，具备该疾病的主要症状和体征，针对药物治疗，与人类疾病具有相似的反应，模型可重复19，且王心明等20指出强光是导致失眠的主要环境因素之一，陈均等21所做实验表明光照可影响睡眠质量。滕柳等22研究发现失眠小鼠出现白天活动度增加、攻击性增加、睡眠时间减少、后期毛发暗淡、饮食饮水情况不佳、体质量逐渐下降等行为学变化。灵枢 口问言：“阳气尽，阴气盛，则目暝；阴气尽而阳气盛，则寤矣”23，故阴阳平衡则睡眠节律正常，此为“昼精夜寐”24。但当今社会节奏加快，学习工作压力大，休闲娱乐方式多元化，夜间工作学习甚至娱乐不节制的现象时有发生，导致其入睡时间延长，难度加大，打破正常睡眠节律，阴阳失交，营卫不和，以致心神失养或又致心神不宁而出现睡眠障碍。酸枣仁汤出自东汉张仲景金匮要略，以酸枣仁为君药，茯苓、知母为臣药，川芎为佐药，甘草为使药，具有宁心安神、养血调肝，清热除烦、镇静催眠之效7，25，为治疗睡眠障碍的代表方，特别其补益肝血、宁心除烦之功，能针对夜间工作学习人群肝血易虚，心火偏盛之特点，取得更好疗效。基于以上分析，团队提出用光照模拟常见昼夜节律紊乱的主要影响因素建立睡眠障碍小鼠模型，以警惕性、暴燥程度、饮食量、饮水量、毛色、尾色等行为学变化为指标，研究并探讨酸枣仁汤对持续光照干预致昼夜节律紊乱的睡眠障碍模型小鼠的疗效。3.2 实验结果分析3.2.1 饮食量在建模后，建模组和实验组饮食量均低于正常组，说明持续光照模型导致小鼠出现食欲不振现象，分析其原因为子时阳气生，阴气由盛转而敛降，及时睡眠有助阴气敛藏，若光照致入睡时间推迟，则阴气敛藏受限而持续被消耗，敛降不及，于是胃之和降亦不及，导致胃不能受纳；子时阳气生，阳气要生长健旺，需要夜间到黎明的长养，若此时未进入睡眠，阳气生发势必受影响；子时所生之阳气，为甲木升发之气，甲木不升，则己土升清不及，脾胃运化无力，戊土己土升降失序，故食纳不佳。而给药后特别是高浓度给药后实验组饮食量与建模组相比更接近正常组，甚至略高于正常组，说明酸枣仁汤可帮助恢复阴阳平衡从而有效改善昼夜节律紊乱后阴阳失调所导致的食欲不振现象。3.2.2 饮水量建模后，实验组饮水量高于对照组，低剂量给药后由于药物浓度不足，实验组饮水量由于睡眠障碍影响而上升，而在高剂量给药后其饮水量下降接近对照组，探究其原因为昼夜节律紊乱，入睡时间延长易伤阴，阴伤易耗损津液，故出现饮水量增加，而酸枣仁汤可帮助恢复阴阳平衡，改善症状，故给药干预后饮水量下降，且数值较建模组更接近对照组。3.2.3 体质量变化研究表明在造模后实验组和建模组体质量均低于对照组，且实验组与对照组、建模组与对照组相比差异均有统计学意义（P0.05），且建模组小鼠在造模后未给药情况下体质量出现负增长，2023 年第 24 卷第 7 期731实验中医药学731说明持续光照模型由于睡眠时间减少，打破阴阳平衡，增加脾胃负担从而对脾胃运化产生不良影响，而实验组小鼠在酸枣仁汤干预后体质量增加值更大，说明酸枣仁汤可在一定程度上缓解昼夜节律紊乱造成的脾胃受损，帮助恢复阴阳平衡以舒缓脾胃，助其运化。张哲等12药理实验进一步证明了酸枣仁汤能改善失眠模型小鼠的体质量减轻现象。综上所述，本研究模型小鼠光照建模后出现烦躁、活动度增加、攻击性增强、警惕性高等行为学变化，并能影响其饮食饮水量和体质量变化，符合失眠模型小鼠的行为学变化。故研究表明光照可导致昼夜节律紊乱，是影响睡眠质量的重要因素，可用于建立睡眠障碍模型。酸枣仁汤可显著缓解昼夜节律紊乱后模型小鼠因阴阳不交、肝火旺盛导致的烦躁、食欲不振、脾胃不和等症状，其具有补益肝血、养心安神、清热除烦之效，可显著改善失眠症状，提高睡眠质量，但光照影响睡眠的机制仍需要进一步研究。参考文献1 秦聪聪，金鑫，王静，等.睡眠障碍与心血管疾病关系研究进展J.心脏杂志，2023，35（1）：76-82.2 韩芳.人为什么要睡眠?J.科学通报，2018，63（1）：16-21.3 郑莹，鲍文文，廖锡庆，等.倒班作业对石油化工企业员工睡眠质量的影响J.中国工业医学杂志，2019，32（4）：311-313.4 中国中医科学院失眠症中医临床实践指南课题组.失眠症中医临床实践指南（WHO/WPO）J.世界睡眠医学杂志，2016，3（1）：8-24.5 曹文聪，海英.金匮要略经方酸枣仁汤治疗失眠中医辨治探究J.辽宁中医药大学学报，2019，21（5）：181-183.6 杨艳红，黄政德.中医药治疗失眠的研究概况J.湖南中医杂志，2014，30（6）：156-158.7 杨文潮.酸枣仁汤联合常规西药治疗失眠的价值研究J.中药药理与临床，2017，31（4）：257-259.8 刘晨曦.加味酸枣仁汤联合西药治疗失眠 42 例临床观察J.湖南中医杂志，2020，36（9）：36-38.9 赵伟，孙国志.不同种实验动物间用药量换算J.畜牧兽医科技信息，2010，22（5）：52-5310 徐凤凯，吴汇天，曹灵勇.伤寒杂病论特殊计量药物换算考证J.中华中医药杂志，2017，32（9）：4159-4162.11 吴丽丽.老年肝郁失眠大鼠模型的建立及舒郁安神方作用的研究D.武汉：湖北中医学院，2008.12 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