甜菜碱调控RhoA_ROCK抑制野百合碱致大鼠肺动脉高压.pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15甜菜碱调控RhoA/ROCK抑制野百合碱致大鼠肺动脉高压张波涛1 王雅蓉1 张婷2 李璐11宁夏医科大学总医院（银川 750004）；2宁夏武警医院（银川 750004）【摘要】目的探讨甜菜碱对野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导的大鼠肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）RhoA/ROCK通路蛋白表达的影响。方法将72只SD（Sprague Dawley）大鼠随机分为：对照组、MCT组（50 mg/kg）、西地那非（30 mg/kg）组、甜菜碱低、中和高（100、200、400 mg/kg）剂量组。MCT组大鼠造模成功后第22天开始给药，于第41天检测大鼠右心室收缩压及右心室肥厚指数、脏器指数指标。采用Western blot法分别测定大鼠心肌和肺组织中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白的表达。结果与MCT组比较，甜菜碱（400 mg/kg）和西地那非（30 mg/kg）均可显著降低大鼠平均肺动脉压（mPAP）、右心室收缩压（RVSP）和右室肥厚指数（RVHI）（P 0.01）。与对照组相比，MCT 组中肺组织和心组织 RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达上调，但甜菜碱（400 mg/kg）组抑制其表达水平的增加（P 0.05）。结论甜菜碱可降低MCT诱导大鼠的肺动脉高压，其机制可能与下调大鼠肺组织和心肌组织RhoA/ROCK通路的RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白的表达有关。【关键词】甜菜碱；肺动脉高压；右心室重构；RhoA/ROCK；野百合碱【中图分类号】R541.5Betaine inhibits monocrotaline induced pulmonary hypertension in rats by regulating RhoA/ROCK protein expression ZHANG Botao*，WANG Yarong，ZHANG Ting，LI Lu.*General Hospital，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，ChinaCorresponding author：LI Lu Email：【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of bethaneline on expression of rhoA/ROCK pathway protein in pulmonary arterial hypertension（PAH）induced by monocrotaline（MCT）in rats.Methods72 SD（Sprague Dawley）rats were randomly divided into control group，MCT（50 mg/kg）group，sildenafil（30 mg/kg）group and low，medium，high（100，200，400 mg/kg）group depending on betaine level.Monocrotaline group was adminstered on the 22nd day after successful modeling，and then the right ventricular systolic pressure，right ventricular hypertrophy index and visceral index were measured on the 41st day.The expressions of RhoA，Rock1 and Rock2 in the rat myocardial and lung homogenates were detected by Western blot.ResultsCompared with MCT，both betaine（400 mg/kg）and sildenafil（30 mg/kg）significantly reduced the mean pulmonary artery pressure（mPAP），right ventricular systolic pressure（RVSP）and right ventricular hypertrophy index（RVHI）（P 0.01）.Lung and cardiac tissue expression of RhoA，ROCK1，and ROCK2 proteins were upregulated in the MCT group as compared with the control group，but the expression was significantly suppressed in the betaine group（400 mg/kg）（P 0.05）.Compared with the control group，the expression of RhoA，ROCK1 and ROCK2 proteins in the lung and heart tissues of the MCT group was up-regulated，but the expression was significantly inhibited in the betaine group（400 mg/kg）（P 98.0%）采购于 Singm-Aldrich 公司，分别称取 400、800 和1 600 mg 甜菜碱，溶解在 40 mL 0.9%氯化钠注射液中，放置于 4 储存备用；MCT（纯度 99.0%）采购于 Singm-Aldrich 公司，称取 MCT 0.2 g，放置在烧瓶中。加入1 mol/L HCl溶液中，直到MCT在溶液中溶解，然后逐滴添加在 NaOH 溶液中，pH调节至约 7.4，最终使用双蒸馏水稀释成 10.0 mL备用。RhoA、ROCK1、ROCK2的一抗体采购于Abcam生物技术公司（美国加利福尼亚州）；-actin采购于Proteintech公司（美国芝加哥）；全蛋白提取和蛋白定量试剂盒均采购于凯基生物科技有限公司；山羊抗兔二抗和-actin二抗采购于北京中杉金桥生物技术公司。细胞超声粉碎机（TY96-N 型）（宁波新芝生物科技有限公司）；PowerPac Basic电泳仪（BIO-RAD公司）；Mutiskan Go酶标仪（Thermo Fisher公司）；凝胶成像分析仪（培清JS-860B，上海培清科技有限公司）。1.2方法1.2.1实验动物分组及处理将72只清洁级成年雄性SD大鼠随机分成为6组（每组12只）：空白对照组、MCT组、甜菜碱组（100、200和400 mg/kg）、西地那非（30 mg/kg）组。处理：在SD大鼠腹部皮下注射 MCT（50 mg/kg）连续 21 d，待构建大鼠 PAH模型成功后，正常对照组和MCT组给予相应体积的生理盐水灌胃，其他各实验组分别继续灌胃甜菜碱（100、200、400 mg/kg）或西地那非（30 mg/kg）20 d。实验终点是第41天，各组大鼠采用乌拉坦（100 mg/kg）麻醉后固定，进行有创血流动力学、脏器指数检测。1.2.2血流动力学指标的测定各组大鼠末次用药后均禁食不禁水 24 h，称体重后使用 20%乌拉坦（6 mL/kg，ip）麻醉固定，暴露大鼠右侧颈部，局部备皮后切开皮肤，分离其右侧颈外静脉周围的肌肉、神经，剥离出血管，埋线结扎血管的远心端，用显微剪剪一“v”字型切口。使用聚乙烯导管（北京协和医学院病理生理学系，中国北京）插入 SD大鼠右颈外静脉中，依次通过右心房和右心室，导管远端与压力传感器（Alcott Biotech，中国上海）相连接，用于测量右心室收缩压（RVSP），测量时间为2 min。最终将导管置于肺动脉中，监测记录平均肺动脉压（mPAP）。血流动力学评估结束，使用颈椎脱位法处死大鼠。然后将其腹腔剖开，切开膈肌暴露其胸腔，切断肋骨后可见肺和心脏，切除其整个肺和心脏组织。摘取SD大鼠心脏、肺和肝脏，首先使用生理盐水清洗余血，再用滤纸吸干多余的液体吸，遂即进行称重后与大鼠的体重进行对比得到脏器指数。为进一步观察右心室肥厚情况，首先需沿心耳下缘将整个心室从心脏上剪下，然后再沿心室间隔的边缘剪下右心室，依次称取右心室（right ventricle，RV）重量和左心室加室间隔LV（left ventricle）+S（septum）重量，计算得出右室肥厚指数RVHI=RV/（LV+S）。最后将右心室和肺组织冷冻在液氮中保存进行Western blot分析。1.2.3Western blot检测取约50 mg经液氮研磨的右心室或肺组织，将其加入至冷裂解缓冲液0.3 mL 中，在冰浴下使用超声破碎细胞。然后在4，10 000 r/min离心20 min，分别取右心室、肺组织上清液用 BCA 蛋白质分析试剂盒进行蛋白定量，剩余的上清液加入上样缓冲液后在 100 水浴 10 min，置于-20 保存。取蛋白样本 60 g 上样，12%SDS-PAGE 凝胶电泳（80 V/120 V 电压），200 mA恒定电流转膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），在室温下用封闭PBST（PBS含有0.1%吐温-20）缓冲液封闭膜2 h，然后需在4 下培养过夜。首先分1877实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15别使用抗 Rho A（1 g/mL）、抗 ROCK1（1 2 000）、抗ROCK2（1 g/mL）及抗-actin抗体（内参，1 1 000）在4 孵育过夜。然后分别加入山羊抗兔IgG二抗（偶联有HRP，1 3 000）常温孵育2 h，加入超级化学发光底物反应液后曝光胶片。采用Quantity-one软件分析胶片扫描结果，将得到的目的条带的光密度值与其相对应的内参-actin的光密度值相对比以校正误差，所得出的比值则代表该目的蛋白的相对含量。1.3统计学方法实验结果以 SPSS 19.0 统计分析软件包进行分析，以（x s）表示计量数据，多组间均数比较采用单因素方差分析，P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1甜菜碱抑制MCT诱导大鼠PAH和右心室肥大通过检测大鼠mPAP、RVSP和RVHI评估甜菜碱对MCT诱导大鼠的肺和心脏损伤。与对照组相比，MCT组大鼠在21 d内持续出现显著PAH（P 0.01）。甜菜碱（400 mg/kg）组大鼠的mPAP显著低于MCT组（P 0.05）。MCT组大鼠由于肺动脉压升高，故 RVSP 明显升高。甜菜碱（400 mg/kg）组与西地那非组均可降低 PAH 大鼠 RVSP（P 0.05和P 0.01）。甜菜碱（400 mg/kg）组降低了PAH大鼠RVHI（P 0.05），与西地那非降低了PAH 大鼠RVHI相仿（P 0.01）。上述结果表明甜菜碱可以保护MCT诱导的PAH大鼠的肺和心脏，见表1。2.2甜菜碱抑制MCT诱导PAH大鼠肺和右心室组织RhoA/ROCK的表达通过Western blot分析，进一步检测了甜菜碱对 MCT 诱导 PAH 大鼠的肺组织和右心室组织RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白的表达。结果显示，与对照组相比，MCT组中肺组织和右心室组织RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表达上调，但西地那非（50 mg/kg）组和甜菜碱（400 mg/kg）组显著降低了 RhoA、ROCK1 和 ROCK2 蛋白表达（P 0.05）。见表2、图1和表3、图2。表2MCT诱导PAH大鼠肺组织RhoA/ROCK的影响Tab.2Effect of RhoA/ROCK in lung tissue of MCT-induced PAH ratsx s组别空白组MCT组西地那非组甜菜碱组（400 mg/kg）RhoA0.61 0.061.42 0.05#0.76 0.05*0.88 0.06*RoCK10.72 0.051.05 0.07#0.8 0.02*0.81 0.05*RoCK20.79 0.051.29 0.05#0.80 0.02*0.82 0.03*注：与空白组比较，#P0.01；与MCT组比较，*P0.05，*P0.01空白组MCT组西地那非组甜菜碱组Rho Aactin20 kDa43 kDaROCK1actinROCK1actin158 kDa43 kDa171 kDa43 kDa空白组 MCT组西地那非组甜菜碱组空白组 MCT组西地那非组甜菜碱组图1 MCT诱导PAH大鼠的肺组织RhoA/ROCK表达（n=8）Fig.1MCT-induced RhoA/ROCK expression in lung tissue of PAH rats（n=8）表1MCT对PAH大鼠mPAP、RVSP和RVHI的影响Tab.1Effects of MCT on mPAP，RVSP and RVHI in PAH ratsx s组别空白组MCT组西地那非组甜菜碱组（100 mg/kg）甜菜碱组（200 mg/kg）甜菜碱组（400 mg/kg）mPAP(mmHg)20.53 0.7952.72 2.06#31.82 1.72*50.96 4.1550.42 1.5641.25 2.43*RVSP(mmHg)32.43 2.3596.79 2.15#71.54 2.67*97.90 1.7395.25 1.6171.78 1.68*RVHI0.31 0.020.72 0.03#0.50 0.03*0.71 0.030.70 0.040.53 0.03*HR（次/min）353.67 14.32404.5 14.56357.75 13.57399.67 12.57396.42 13.58369.58 18.99注：与空白组比较，#P 0.01；与MCT组比较，*P0.05，*P 0.011878实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.153讨论本实验提示甜菜碱对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压产生治疗效果。结果表明，西地那非组和甜菜碱（400 mg/kg）组治疗前后大鼠 mPAP、RVSP和 RVHI 均明显减低，提示甜菜碱可减缓 PAH 大鼠的肺动脉高压以及其右心室扩大的进展。同时，Western blot 检测结果表明给药甜菜碱抑制了PAH大鼠心肺组织中RhoA，ROCK1和ROCK2的表达。综上所述，甜菜碱可能通过下调RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表达，对MCT所致PAH大鼠起到显著疗效。PAH 作为一种进行性疾病，其病理生理学特征包括肺动脉平滑肌细胞的异常增殖、凋亡抵抗和肺血管重构，最终导致右心衰竭7-9。西地那非作为治疗PAH 的常用药物，已被美国食品药物管理局及临床广泛认可，故本研究选择西地那非为阳性药物。YADAV等10研究表明，西地那非可有效减缓PAH大鼠肺动脉高压，与本研究中结果一致，常用与构建动物 PAH 模型主要以下几种方式：野百合碱诱导模型、肺栓塞型、低氧诱导模型、遗传修饰模型和手术分流模型等11。野百合碱作为一种双吡咯类生物碱，其在动物肝脏内的氧化代谢产物，可选择性地损伤肺动脉内皮细胞，使细胞间隙增大，引起血小板源性生长因子等大量释放，促进平滑肌细胞增殖、迁移，进而引起肺中小动脉重构、狭窄、甚至闭塞，最终导致PAH。给SD大鼠注射野百合碱构建PAH模型最为常见12-14。在本实验中MCT组的大鼠出现了血流动力学和右心功能的异常：血流动力学参数 mPAP 和 RVSP显著升高，RVHI 显著升高15-16，这与 HUMBERT等17-18的报道一致，表明构建PAH大鼠模型成功。大量研究示人类PAH的特征在于肺血流动力学异常，包括mPAP，RVHI和RVSP的异常升高。同样在动物PAH模型中，mPAP、RVHI和RVSP 的类似变化通常被认为是PAH发生发展的证据。因此，本研究通过检验用药前后血流动力学指标和RVHI的变化得出甜菜碱（400 mg/kg）对PAH大鼠的治疗作用。MONTAGNOLI等19-20研究RhoA/ROCK信号传导通路作为人体细胞常见的信号传导通路，过度激活对PAH 的形成产生重要作用。RhoA 是一类具有GTP酶活性的小分子，在心、脑、肺、平滑肌等组织中均广泛的存在，其作用机制包括炎性因子产生，细胞迁移和凋亡，平滑肌细胞增殖等21-22。KIM 等23研究表明，RhoA 之所以可以发挥上述生物效应，主要通过调节其下游靶蛋白 ROCK。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分为ROCK1和 ROCK2 两种同种型，两者具有高度同源性，常通过 caspase-3 介导途径调控细胞凋亡。越来越多的研究24-25表明 ROCK 抑制剂、西地那非和辛伐他汀都对 PAH 有治疗作用，可以使 ROCK 的表达恢复到正常水平。在本实验中，与空白组相比，MCT 组 RhoA，ROCK1 和 ROCK2 的表达水平显著升高，提示 RhoA/ROCK 信号通路的异常激活在PAH模型中起到了至关重要的作用，与文献26报道一致，因此抑制 RhoA/ROCK 信号通路的活化对于治疗 PAH 具有重要作用。西地那非组和甜菜碱组均抑制了PAH大鼠RhoA，ROCK1和ROCK2的表达。空白组 MCT组西地那非组甜菜碱组Rho Aactin20 kDa43 kDaROCK1actinROCK1actin158 kDa43 kDa171 kDa43 kDa空白组 MCT组西地那非组甜菜碱组空白组 MCT组西地那非组甜菜碱组图2 MCT诱导PAH大鼠心脏组织RhoA/ROCK表达（n=8）Fig.2Effect of RhoA/ROCK in MCT-induced PAH rat heart tissue（n=8）表3MCT诱导PAH大鼠心脏组织RhoA/ROCK的影响Tab.3Effect of RhoA/ROCK in MCT-induced PAH rat heart tissuex s组别空白组MCT组西地那非组甜菜碱组（400 mg/kg）RhoA0.65 0.031.16 0.11#0.71 0.02*0.70 0.02*RoCK10.67 0.050.94 0.07#0.69 0.02*0.79 0.02*RoCK20.71 0.041.12 0.03#0.83 0.03*0.87 0.05*注：与空白组比较，#P 0.01；与MCT组比较，*P 0.05，*P 0.011879实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15因此，本研究推测甜菜碱对MCT所致PAH大鼠保护作用可能与RhoA/ROCK信号通路有关，未来将进一步行相关实验研究明确其分子机制。【Author contributions】ZHANG Botao made conceptualization，methodology，writing-original draft preparation，writing-reviewing and editing.WANG Yarong provided resources and investigation.ZHANG Ting made data curation and visualization.LI Lu made validation and supervision.All authors read and approved the final manuscript as submitted.参考文献1 ZEDER K，BANFI C，STEINRISSER-ALLEX G，et al.Diagnostic，prognostic and differential-diagnostic relevance of pulmonary haemodynamic parameters during exercise：a systematic reviewJ.Eur Respir J，2022，60（4）：2103181.2 陈晨，张妍蓓.Rho激酶抑制剂联合葛根素通过抑制TGF-1/Smads信号通路和炎症反应来减轻缺氧诱导肺动脉高压对肺血管的损伤 J.实用医学杂志，2021，37（5）：591-595.3 SUGIMOTO K，YOKOKAWA T，MISAKA T，et al.Endothelin-1 Upregulates Activin Receptor-Like Kinase-1 Expression via Gi/RhoA/Sp-1/Rho Kinase Pathways in Human Pulmonary Arterial Endothelial Cells J.Front Cardiovasc Med，2021，8：648981.4 中华医学会呼吸病学分会肺栓塞与肺血管病学组，中国医师协会呼吸医师分会肺栓塞与肺血管病工作委员会，全国肺栓塞与肺血管病防治协作组，等.中国肺动脉高压诊断与治疗指南（2021版）J.中华医学杂志，2021，101（1）：11-51.5 SONG R，LEI S，YANG S，et al.LncRNA PAXIP1-AS1 fosters the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension via ETS1/WIPF1/RhoA axisJ.J Cell Mol Med，2021，25（15）：7321-7334.6 YANG Y，ZENG Q，XIONG C.O233：Elevated betaine is associated with poor prognosis of patients with pulmonary hypertensionJ.Respirology（Carlton，Vic.），2021，26（S3）：61.7 LEBER L，BEAUDET A，MULLER A.Epidemiology of pulmonary arterial hypertension and chronic thromboembolic pulmonary hypertension：identification of the most accurate estimates from a systematic literature reviewJ.Pulm Circ，2021，11（1）：765570412.8 PERROS F，JUTANT E M，SAVALE L，et al.Physiopathology and treatment of pulmonary arterial hypertensionJ.M S-Med Sci，2023，39（4）：359-369.9 OTANI N，WATANABE R，TOMOE T，et al.Pathophysiology and Treatment of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension J.Int J Mol Sci，2023，24（4）：3979.10YADAV H N，SHAH 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