特异性投射神经元的单细胞分离与测序.pdf

开发一种适用于特异性投射神经元转录组测序的单细胞分离方法。方法：用逆行示踪腺相关病毒（AAV）特异性标记成年小鼠丘脑底核（STN）投射至丘脑前核（ANT）的神经元，通过梯度离心将其制备成单细胞悬液，利用显微操纵器逐个吸取被荧光标记的神经元，运用Smart-seq2构建基因文库并进行质检和测序。结果：利用该方案成功分离到STN投射至ANT神经元；所构建的cDNA文库质量满足测序要求；通过测序结果比对,在目标神经元内检测到病毒表达的荧光蛋白基因。结论：本研究建立了一种适用于转录组测序的单细胞分离方法，可高效、高质量分离特异性投射神经元，为未来在靶细胞数目稀少的组织样本中进行转录组学研究提供了一种新的方案。关键词单细胞分离；投射神经元；单细胞测序；丘脑底核；丘脑前核；小鼠D01:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.002Single-cell isolation and sequence of specific projecting neuronsXIE Wen,ZHOU Xiaojuan,LEI Wanying,ZHANG Hui?,GAO Yan,WANG Yizheng*,ZHANG Chunkui?*(1.School of Medicine,University of South China,Hengyang 421001;2.Institute of Military Cognition and BrainScience,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;3.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China)Abstract Objective:To develop a single-cell isolation and extraction method for transcriptome sequencing of spe-cific projection neurons.Methods:Retrograde adeno-associated viruses(AAV)were used to specifically label subtha-lamic nucleus neurons(STN)that project to the anterior thalamic nucleus(ANT)of adult mice.STN neurons werethen made into single-cell suspension through gradient centrifugation.Using a micromanipulator,the fluorescein-labeledneurons were aspirated.After the gene library construction,the Smart-seq2 technique was used for quality assessmentand sequencing.Results:The STN-ANT projecting neurons were successfully extracted;the constructed cDNA librarymet the sequencing requirements.Furthermore,through sequence alignment,the fluorescent protein genes of the viruswere successfully detected in the targeted neurons.Conclusion:The present study established a novel single-cell isola-tion and extraction method suitable for transcriptome sequencing,which can extract specific projection neurons with highefficiency and high quality.The study provided a new strategy to obtain cells from tissue with sparse number of targetcells for future transcriptome research.基金项目：国家自然科学基金（8 18 30 0 34）；临港实验室“求索杰出青年计划”（LS-QS-202201-04）；科技创新2 0 30 重大项目（2 0 2 1ZD0200903）*通信作者：张春奎电话：[phone],E-mail:;王以政电话：[phone],E-mail:263雯：特异性投射神经示元的单细胞分离与测序谢Key wordssingle-cell isolation;projection neurons;single-cell sequencing;subthalamic nucleus(STN);anteriorthalamic nucleus(ANT);mouse大脑完成精细功能调控依赖于其组织结构的多样性和复杂性 。研究表明，同一脑区内的神经元可具有多种投射模式，而这些具有不同投射模式的神经元在基因表达上是否存在差异尚待明确2.3。因此，探究神经元投射结构与基因表达多样性之间的关系是神经科学领域的重要问题。然而，高效、高质量筛选特异性投射神经元并研究其基因表达仍存在一定的技术挑战3。一方面，成年动物神经元轴突发育完全，因此在进行单个神经元的解离时，细胞质量难以保证，且存活率较低，从而影响测序质量5-7 ；另一方面，常用的单细胞转录组测序技术,如10XGenomics，虽然具有高通量、低成本和周期快的优点，但对单细胞悬液质量有严格要求：样本悬液中细胞总量超过110，活细胞比例大于8 0%，且样本悬液中不能含有细胞残骸等杂质7 。然而，成年哺乳类动物脑中存在大量纤维束，在单细胞悬液中难以去除；且多数情况下特异性投射神经元数量较少,难以达到测序标准。因此，这些技术要求限制了诸多实验的开展。目前，针对特异性投射神经元的测序分析，常结合生物条形码技术，但技术难度高且价格昂贵；结合全细胞膜片钳和单细胞RNA测序的“Patch-seq”技术虽然可达到目的8 ，但取样过程复杂，能够在脑片上分离单个细胞的深度受限，存在样本易被污染等问题。鉴于以上原因，本研究以丘脑底核（subthalamicnucleus，ST N）投射至丘脑前核(anterior thalamic nu-cleus,ANT)的神经元为例9 ,利用具有逆行示踪功能的腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV)工具，对STN内特异性投射至ANT的神经元进行荧光标记，通过组织匀浆和梯度离心制备单细胞悬液，在荧光显微镜下，借助显微操纵器对目标神经元进行提取，成功建立了一种有效筛选特异性投射神经元并进行转录组测序的新方法。材料与方法1.材料8周龄雄性C57BL/6小鼠，购自北京斯贝福生物技术有限公司，0.2 5%胰酶、DMEM、胎牛血清、青链霉素溶液（penicllin-streptomycin solution，PS）购自美国Gibco公司，磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuff-eredsaline，PBS）购自大连美仑公司，腺相关病毒AAV2/retro-hSyn-mCherry-WPRE-hGHpA购自深圳布林凯斯公司，细胞计数仪、细胞计数板购自美国In-vitrogen公司,35mm细胞培养皿、50 ml离心管购自美国Corming公司，立体定位仪、玻璃电极等手术器械购自深圳瑞沃德公司，电极拉制仪、微操纵器购自美国SutterInstrument公司，常温台式离心机购自美国ThermoFisher公司，倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司，全自动雪花制冰机购自北京德天佑公司，微量注射器购自德国Hamilton公司，微量注射泵购自美国KdScientific公司，振动切片机购自德国Leica公司。2.方法2.1AAV标记特异性投射神经元选取8 周龄雄性C57BL/6小鼠给予腹腔注射0.7%戊巴比妥钠（6 0 mg/k g）。将麻醉小鼠的头部固定在立体定位仪上，7 5%酒精棉球擦拭头皮后剪开并暴露颅骨表面。以前卤点为参考坐标原点，于ANT（A P=0.7 6mm,ML=0.72mm,DV=-3.5 mm)区域利用带有玻璃电极的微量注射泵将逆行示踪病毒以30 nl/min的速度注人。注射完成后停留10 min，而后缓慢移出注射器。7 5%酒精消毒切口后缝合皮肤，3周后进行后续实验。2.2获取目的脑片用0.7%戊巴比妥钠麻醉小鼠，快速断头取脑，并用事先预冷的PBS冲净血渍，而后转移至干净的PBS中。振动切片机从冠状面切出目的脑区（厚度1mm），在体视显微镜下，用刀片小心去除掉STN以外组织。整个过程需快速进行并保持低温。2.3制备单细胞悬液夜如Fig.1所示，将获取到的脑片转移至无菌PBS中,用眼科剪将组织剪碎至糊状，加人1倍体积的0.2 5%胰酶，37 恒温消化10min后,加人等体积胎牛血清培养基终止消化。移液枪轻轻吹打消化液，使组织块完全分散，过2 0 0 目筛网，收集滤液平均分成两份：一份采用10 0 0 r/min、3m i n 直接离心，收集沉淀；另一份先用40 0 r/min离心2 min，收集上清液，然后再用10 0 0 r/min离心2 min，收集沉淀。最后，两份样本各加人2 ml培养基使细胞重悬。独立重复3组实验，每组样本记录3次，每次取10 l用于细胞计数仪计数及活细胞比例统计。2642023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，TrypsindigestionFiltrationSelectthesupernatantCentrifugeCell suspensionCentrifugePrecipitation(400r/min,2min)(1000r/min,2min)Centrifuge(1000r/min,2min)Fig.1 Flow chart of single cell suspension preparation for specific projection neurons.2.4单细胞收集将玻璃电极（尖端直径约10m)移含单细胞悬液的培养皿中，人液前先给予正压，人液后，通过调整玻璃电极内的压力，使细胞悬液液面维持在玻璃电极尖端，找到目标细胞后，将电极缓慢靠近细胞，再给予适当负压，将细胞吸人玻璃电极，此过程尽可能少吸入细胞悬液（总体积小于2l）。将收集到的细胞放人2 l细胞裂解液中，干冰速冻（注意电极尖端除裂解液外不可接触其他物体）。采用Smart-seq2构建单细胞文库，Illumina公司Novaseq平台测序，测序读长为双端PE150。2.5统计学处理利用GraphPadPrism8软件对实验数据进行统计分析。所有数据均用平均数标准误差（xs）表示。采用配对t检验评估差异的显著性。P0.05被认为有统计学意义。结果1.利用逆行示踪病毒可标记STN-ANT投射神经元利用立体定位仪，在成年小鼠ANT脑区注射50nlAAV2/retro型腺相关病毒,该病毒可从神经元的轴突末梢吸收，逆行进人胞体，而后转录表达红色荧光蛋白（mCherry）【10 （Fi g.2 A）。病毒注射3周后，观察病毒表达效果。结果显示：病毒注射区域局限在ANT,注射位置准确（Fig.2B），在ANT上游STN区域可观察到被mCherry标记的神经元胞体，即为STN投射至ANT的神经元（Fig.2C）。RetroAAV-CaMKlla-mCherryDAPI+mCherryDAPI+mCherryANTRetroAAV-CaMKlla-mCherrySTNANTSTNAANTBCFig.2 Adeno-associated viruses labeled neurons in the subthalamic nucleus that project to the anterior thalamic nucleus.A:Schematicof the viral vector strategy.B:Representative image showing the mCherry-expressing neurons in the ANT.Bar=150 m.C:Representative image showing mChery labeled ANT-projecting neurons in STN.Short arrows in C indicated the retrogradely la-beled neurons.Bar=50 m.265雯：特异性投射神经元的单细胞分离与测序谢2.梯度离心可提高细胞悬液中活细胞比例为了探究不同离心方法对提取单细胞的影响，如Fig.1所示，于同一样本分别采用不同离心方法制备单细胞悬液，重复3组，每组用细胞计数仪进行3次细胞计数及活细胞比例统计，取3次平均值。结果显示：在显微镜下观察发现梯度离心（Fig.3B）获取的单细胞悬液比直接离心（Fig.3A）获取的单细胞悬液杂质更少；3组样本中，采用梯度离心得到的平均细胞数量为110,直接离心与梯度离心的活细胞数量无明显变化(Fig.3C)；通过细胞计数仪，统计活细胞比例：梯度离心操作下平均活细胞比例显著高于直接离心活细胞比例（53.6 314.0 8）%us(51.2714.76)%，P 0.0 5，Fi g.3D)。提示在制备单细胞悬液时，与直接离心相比，梯度离心可在不减少细胞总量的同时有效减少悬液中杂质及死细胞，从而获取高质量的细胞悬液。AB1.510680a1x106605x10540FCD20DirectDirectIndirectIndirectFig.3 Gradient centrifugation increased the proportion of viable cells in the cell suspension.A-B:Representative images of cell sus-pensions obtained by direct(A)or gradient(B)centrifugation,the short arrows indicated to the cells.Bar=500 um.Inset:magnified views of boxed regions,Bar=100 m.C:Live cell concentrations obtained by different centrifugation methods(n=4).D:Proportion of viable cells obtained by different centrifugation methods(n=4).*P0.05 us Direct group.3.显微操作取样可用于构建高质量单细胞cDNA文库利用显微操纵器，可以清楚的在显微镜下找到活细胞并逐个吸取到玻璃电极内（Fig.4A）。3组样本中，样本1取得5个细胞，样本2 取得10 个细胞，样本3取得3个细胞，从获取样本到取得单细胞总用时分别为：2.5、3.5h和2 h。结果显示：3组样本构建的cDNA文库主峰均在10 0 0 2 0 0 0 bp区间，提示mRNA完整性好，质检达标；但各样本cDNA浓度和总量存在差异，用时最短的样本3获取细胞3个，但cDNA浓度和总量最高分别为0.9 6 4ng/l、19.2 8ng。而样本2 获取细胞最多，用时最长3.5h，c D NA浓度和总量最低分别为0.7 9 8 ng/ul、15.9 6 n g（Fi g.4B-D）。提示在进行单细胞分离时，应尽量缩短采样总时间，以提高样本质量。2662023年5月第39 卷第3期神经解部学杂志，26.68Sample 1000915.4416814.19201002003004005001k2k5kLength(bp)AB16.4514.39Sample 20009Sample3000S6622610.909.725.355.05201002003004005001k2K5k201002003004005001k2k5kLength(bp)Length(bp)CDFig.4 Single-cell extraction and evaluation of cDNA quality.A:Representative images,Single cells were aspirated by glass elec-trodes,Bar=10 m.The right panel is a zoom-in of the left panel,and the arrows refer to the cells,Bar=5 m.B-D:Smart-seq2 technology was used to construct single-cell libraries for different samples.对cDNA文库进一步测序，结果显示：质量评估Q30大于9 0%，表明测序数据质量合格；GC和AT碱基对均衡分布，每条序列的测序质量Q值集中在3040间，测序序列长度主要为150 bp，提示测序结果优良（Fig.5）；共测得37 12 个基因，通过比对序列信息，检测到mCherry基因，提示应用显微操纵器分离单细胞的技术方法成功分离到STN投射至ANT的神经元。讨论神经元基因表达的异质性是大脑结构和功能复杂的关键基础。传统转录组测序手段在细胞群层面进行大规模检测，只能得到群体平均值，造成大量低丰度信息丢失，无法对细胞个体间异质性进行深入研究12.。因此，传统转录组测序手段已不能满足当前研究需求。近年来随着转录组分析技术的发展，尤其是单细胞转录组学的兴起，研究者对许多疾病的发生机制有了更加深刻的认识1416 。例如，在对阿尔茨海默病（Alzheimers disease，A D）患者前额叶皮质及内嗅皮质的细胞进行转录组分析时，研究者发现不同病程中的AD患者具有不同的基因表达,且具有高度细胞类型特异性。进一步结合AD风险位点分析，揭示了AD疾病进展的关键驱动因子，如转录因子EB（t r a n s c r i p t i o n f a c t o r EB，T FEB）等17 18 。因此,利用单细胞测序技术分析疾病发生过程中神经元基因表达的异质性,对于研究脑疾病的致病机制和治疗具有重要意义19,2 0 。近年来,随着“Patch-seq技术的发展,单细胞测序技术不断优化，可实现在半生理状态下对特定类型神经元的基因、形态学特征及电生理特性进行分析8 。然而，“Patch-seq技术的技术门槛较高，操作人员需具备熟练的膜片钳操作经验，采样过程中需确保靶细胞的状态及活性；由于显微镜成像深度的267雯：特异性投射神经的单细胞分离与测序谢361.2B734.3208204285421.0B780000006000000400000010620000004200AB123456789110-114125-129140-14415014151617181920212223242526272829303132333435363715-1925-2935-3945-4955-5965-6975-7985-8995-99Positioninread(bp)MeanSequenceQuality(Phred Score)1002.0B7901.75E7801.5E770601.25E7501.0E740750000030500000020250000010014915015112345678915-1925-2935-3945-4955-5965-6975-7985-8995-99110-114125-129140-144150CDSequenceLength(bp)Position inread(bp)Fig.5 Single-cell identification and sequence assessment.A-D:Sample 3 was subjected to single cell identification and sequencequality assessment.A:Q value box plot statistics,the black line above and below represents the base quality value correspond-ing to 90%and 10%,the blue line represents the average quality value,the green background represents the high-quality val-ue part,the orange background represents the reasonable quality value part,and the red background represents the low-qualityvalue part.B:Distribution of sequence quality scores.C:Base profile.D:Sequence length profile.限制，仅能在脑片表面分离到部分细胞，提取深度有限。同时，吸取过程细胞容易破损，样本极易受到污染,这使得“Patch-seq技术难以普及。本研究中,直接将目的组织进行消化，降低了技术门槛，操作更简便；吸取过程中细胞不易破损，得到的样本转录组信息基本完整。此外，该方法不仅适用于本文提到的特异性投射神经元的提取，还适用于其他靶细胞数量稀少的组织样本。但是该方法也存在一定局限性，一方面，样本经过胰酶消化成单细胞后，细胞脱离了正常生理状态，可能会影响神经元的基因表达；另一方面，对组织匀浆和对细胞悬液进行离心处理时,不可避免损失一些目标细胞。因此,在实验过程中，需要设置对照实验并对样本进行严格质量把控。单细胞测序技术在各研究领域尤其是神经科学领域拥有广阔的应用前景和潜力，但当前仍有诸多问题呕待解决，包括精准高效取样和低丰度信息筛选等2 1。本研究结合病毒示踪技术,优化单细胞悬液制备方案，利用显微操纵器，建立了一种适用于特定脑区、特定网络、特异神经元的细胞分离方法。该方法具有稳定、高效及可重复的特点，为深入研究神经网络、探索脑疾病机制和治疗提供了一个可参考的实验方法。参考文献1 Kim DW,Yao Z,Graybuck LT,et al.Multimodal analysis of celltypes in a hypothalamic node controlling social behavior J.Cell,2019,179(3):713728.D01:10.1016/j.cell.2019.09.020.2 Moffitt JR,Bambah-Mukku D,Eichhorn SW,et al.Molecular,spa-tial,and functional single-cell profiling of the hypothalamic preopticregionJ.Science,2018,362（6 416):e a a u 532 4.D 0 I:10.1126/science.aau5324.3 Poo MM.Transcriptome,connectome and neuromodulation of the pri-mate brainJ.Cell,2022,185(15):2636-2639.DOI:10.1016/j.cell.2022.05.011.4 Him A,Altuntas S,Oztirk G,et al.Isolation and culture of adult2682023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，mouse vestibular nucleus neurons J.Turkish J Med Sci,2017,47(6):1903-1911.D0I:10.3906/sag-1706-158.5 Brewer GJ,Torricelli JR,Evege EK,et al.Optimized survival ofhippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal,a new ser-um-free medium combinationJ.J Neurosci Res,1993,35(5):567-576.D0I:10.1002/jnr.490350513.6 Goslin K,Banker G.Experimental observations on the developmentof polarity by hippocampal neurons in culture J.J Cell Biol,1989,108(4):1507-1516.D01:10.1083/jcb.108.4.1507.7 Gao 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