青海湖裸鲤TNNI1和TNNI2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究.pdf

第5 1卷 第1 0期2 0 2 3年1 0月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t.S c i.E d.)V o l.5 1 N o.1 0O c t.2 0 2 3网络出版时间:2 0 2 3-0 4-1 0 1 7:4 4 D O I:1 0.1 3 2 0 7/j.c n k i.j n w a f u.2 0 2 3.1 0.0 0 1网络出版地址:h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/6 1.1 3 9 0.S.2 0 2 3 0 4 0 7.1 4 3 9.0 0 2.h t m l青海湖裸鲤T NN I1和T NN I2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究 收稿日期 2 0 2 2-0 6-2 7 基金项目 国家自然科学基金项目“青海湖裸鲤鳞片缺失发育的分子机理”(3 1 6 6 0 7 4 5);国家自然科学基金项目“青海湖裸鲤耐盐碱关键蛋白的鉴定及其调控机理的研究”(3 1 9 6 0 7 4 1)作者简介 许保可(1 9 9 7-),男,山东菏泽人,在读硕士,主要从事高原动物生态学研究。E-m a i l:x b k_s m k x 1 6 3.c o m 通信作者 梁 健(1 9 8 3-),男,山东烟台人,副教授,博士,硕士生导师,主要从事高原特色生物资源的生物化学和分子生物学研究。E-m a i l:l a n g j i a n w s 1 2 6.c o m许保可a,b,阿琳林a,b,张海琛a,b,马清花a,b,梁 健a(青海大学 a省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,b生态环境工程学院,青海 西宁 8 1 0 0 1 6)摘 要【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNN I1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNN I2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用R A C E技术克隆TNN I1和TNN I2基因全长c D NA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量P C R法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNN I1 c D NA序列全长为1 2 1 1 b p,其中开放阅读框5 4 0 b p,共编码1 7 9个氨基酸;TNN I2 c D NA序列全长为7 3 7 b p,其中开放阅读框5 3 1 b p,共编码1 7 6个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNN I 1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达9 2.1 3%,TNN I 2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为9 2.6 1%。系统发育树结果显示,从T NN I 1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNN I 2氨基酸序列 来看,青海 湖裸 鲤与 鲤 鱼的 亲缘 关系 最 近,其次 是 鲫鱼 和金 线鲃 属 鱼类。TNN I1和TNN I2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNN I1和TNN I2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNN I1的相对表达量极显著下调(P0.0 1),而TNN I2极显著上调(P0.0 1)。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNN I1、TNN I2基因全长;TNN I1、TNN I2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNN I1、TNN I2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。关键词 青海湖裸鲤;肌钙蛋白;TNN I1基因;TNN I2基因;盐碱胁迫 中图分类号 S 9 6 5.1 9 9 文献标志码 A 文章编号 1 6 7 1-9 3 8 7(2 0 2 3)1 0-0 0 0 1-1 0C l o n i n g o f T N N I1 a n d T N N I2 g e n e s o f G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i a n d e x p r e s s i o n a n a l y s i s i n r e s p o n s e t o s a l i n i t y-a l k a l i s t r e s sXU B a o k ea,b,A L i n l i na,b,Z HAN G H a i c h e na,b,MA Q i n g h u aa,b,L I AN G J i a na(a S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f P l a t e a u E c o l o g y a n d A g r i c u l t u r e,b C o l l e g e o f E c o-E n v i r o n m e n t a l E n g i n e e r i n g,Q i n g h a i U n i v e r s i t y,X i n i n g,Q i n g h a i 8 1 0 0 1 6,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】T h e s l o w s k e l e t a l m u s c l e t y p e t r o p o n i n I g e n e(TNN I1)a n d t h e r a p i d s k e l e t a l m u s c l e t y p e t r o p o n i n I g e n e(TNN I2)o f G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i w e r e c l o n e d a n d t h e i r e x p r e s s i o n l e v-e l s i n d i f f e r e n t t i s s u e s a n d i n s k i n a n d m u s c l e u n d e r s a l i n e s t r e s s w e r e a n a l y z e d t o p r o v i d e d a t a f o r r e v e a l i n g s l o w g r o w t h a n d r e c o v e r i n g r e s o u r c e s o f G.p r z e w a l s k i i.【M e t h o d】T h e f u l l-l e n g t h c D NA s e q u e n c e s o f TNN I1 a n d TNN I2 o f t h e e n d e m i c f i s h G.p r z e w a l s k i i i n t h e Q i n g h a i-T i b e t P l a t e a u w e r e c l o n e d b y R A C E t e c h n o l o g y,a n d t h e n t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e h o m o l o g y c o m p a r i s o n w a s p e r f o r m e d.R e a l-t i m e P C R t e c h n o l o g y w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f t w o g e n e s i n g i l l s,e y e s,b r a i n,s p l e e n,l i v e r,i n t e s t i n e,k i d-n e y,h e a r t,s k i n a n d m u s c l e a s w e l l a s i n s k i n a n d m u s c l e u n d e r s a l i n e-a l k a l i s t r e s s.【R e s u l t】T h e c D NA s e-q u e n c e o f TNN I1 i n G.p r z e w a l s k i i w a s 1 2 1 1 b p a n d t h e o p e n r e a d i n g f r a m e w a s 5 4 0 b p,e n c o d i n g 1 7 9 a-m i n o a c i d s.T h e c D NA s e q u e n c e o f TNN I2 o f G.p r z e w a l s k i i w a s 7 3 7 b p a n d t h e o p e n r e a d i n g f r a m e w a s 5 3 1 b p,e n c o d i n g 1 7 6 a m i n o a c i d s.S e q u e n c e h o m o l o g y a n a l y s i s f o u n d t h a t t h e h o m o l o g y o f T NN I 1 b e t w e e n G.p r z e w a l s k i i a n d S i n o c y c l o c h e i l u s a n s h u i e n s i s w a s 9 2.1 3%,a n d t h e h o m o l o g y o f T NN I 2 b e t w e e n G.p r z e w a l s k i i a n d C y p r i n u s c a r p i o w a s 9 2.6 1%.T h e p h y l o g e n i e s t r e e s h o w e d t h a t G.p r z e w a l s k i i w a s c l o s e l y r e l a t e d t o S i n o c y c l o c h e i l u s,C.c a r p i o a n d C y p r i n u s a u r a t u s a c c o r d i n g t o T NN I 1 a n d i t w a s c l o s e l y r e l a t e d t o C.c a r p i o,C.a u r a t u s a n d S i n o c y c l o c h e i l u s i n o r d e r a c c o r d i n g t o T NN I 2.TNN I1 a n d TNN I2 d i f f e r e n t i a t e d d u r i n g t h e e v o l u t i o n o f v e r t e b r a t e s.B o t h g e n e s w e r e e x p r e s s e d i n d i f f e r e n t t i s s u e s w i t h t h e h i g h e s t l e v e l s i n m u s c l e.U n d e r s a l i n e-a l k a l i s t r e s s,b o t h g e n e s i n m u s c l e w e r e s i g n i f i c a n t l y d o w n r e g u l a t e d,TNN I1 w a s s i g n i f i c a n t l y d o w n r e g u l a t e d i n s k i n(P0.0 1),a n d TNN I2 w a s s i g n i f i c a n t l y u p r e g u l a t e d i n s k i n(P0.0 1).【C o n c l u s i o n】T h i s s t u d y s u c c e s s f u l l y c l o n e d f u l l l e n g t h g e n e s o f TNN I1 a n d TNN I2 o f G.p r z e w a l s k i i.TNN I1 a n d TNN I2 g e n e s w e r e h i g h l y e x p r e s s e d i n m u s c l e,i n d i c a t i n g t h a t t h e y w e r e c l o s e l y r e l a t e d t o m u s c l e d e v e l o p m e n t.U n d e r s a l i n e-a l k a l i s t r e s s,TNN I1 a n d TNN I2 g e n e s w e r e s i g n i f i-c a n t l y d o w n r e g u l a t e d i n m u s c l e,s u g g e s t i n g t h a t e x p r e s s i o n d e c r e a s e m a y b e a n i m p o r t a n t r e a s o n f o r i t s s l o w g r o w t h.K e y w o r d s:G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i;t r o p o n i n;TNN I1 g e n e;TNN I2 g e n e;s a l i n e s t r e s s 肌钙蛋白是介导钙离子和肌肉之间相互作用的一种蛋白,由肌钙蛋白I(t r o p o n i n I,T n I)、肌钙蛋白T(t r o p o n i n T,T n T)和肌钙蛋白C(t r o p o n i n C,T n C)3个亚单位组成。T n I是肌钙蛋白复合物的抑制亚基,该蛋白具有不同的功能区,这些区域分别和肌动蛋白、肌钙蛋白C一起发挥作用1-2,在C a2+参与下能够影响肌球蛋白AT P酶的活性,进而调控肌肉的收缩和舒张3-4。T n I家族通常包括3个成员,分别为慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I(T NN I 1)、快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I(T NN I 2)和心肌型肌钙蛋白I(T NN I 3)。前期研究发现,T NN I 1存在于人胎儿心脏发育早期,之后心肌细胞中的大部分T NN I 1被T NN I 3所取代,只在成熟心脏的传导纤维中持续表达5-6。对哺乳动物研究表明,TNN I1基因影响肌肉发育和脂肪沉积7,其表达量与羊肌纤维的直径、横截面积等相关8。在家禽的研究中发现,与肉鸡相比,蛋鸡骨骼肌TNN I1基因的表达水平更高9。在骨骼肌发育初期,TNN I1和TNN I2都有表达,且能够相互转换,但随着骨骼肌发育时间的延长,TNN I1定向表达于骨骼肌慢肌纤维,而TNN I2定向表达于骨骼肌快肌纤维1 0,因此研究慢肌纤维的特 异 性 表 达 机 制 时 常 将TNN I1作 为 标 志 基因1 1-1 2。TNN I2位点突变能够导致弗里曼-谢尔登综合征(D A 2 A)和面部痉挛1 3,表明人肌肉发育过程中T NN I 2有着不可替代的作用。杨华1 4发现,猪的肌内脂肪含量、瘦肉率、背膘厚等性状变化与TNN I2基因突变有关。以上研究表明,T NN I 1和T NN I 2在肌肉生长发育过程中发挥重要作用。青海湖裸鲤(G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i),为裂腹鱼亚科(S c h i z o t h o r a c i n a e)、裸鲤属(G y m n o c y p-r i s)1 5,是适应高原环境的一种特化鱼类1 6,分布地带主要为青海湖及湖周边支流,在青海湖生态系统平衡中具有核心地位。由于青海湖营养贫瘠和水温低,青海湖裸鲤生长极其缓慢,加之2 0世纪6 0年代过度捕捞,2 0 1 0年被列为世界濒危物种之一1 7。因此青海湖裸鲤是十分宝贵的生物资源1 8,对其种质资源的保护和研究有着重要的生态价值1 9-2 0。为此,本 研 究 克 隆 获 得 了 青 海 湖 裸 鲤TNN I1和TNN I2基因的全长序列,探究其在青海湖裸鲤不同组织中的表达情况,以及盐碱胁迫下2个基因在肌肉和皮肤组织中表达水平的变化,为揭示其在青海湖裸鲤生长发育过程中的作用奠定基础。1 材料与方法1.1 材 料青海湖裸鲤由青海湖裸鲤救护中心提供。供试2西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷青海湖裸鲤先在实验室驯化饲养1 0 d,驯化用水为海水晶盐处理后的自来水(1 L自来水加海水晶盐0.2 5 g,配成盐度为3、碱度为1 mm o l/L的水)。将驯化后的青海湖裸鲤分为对照组和盐碱胁迫组,对照组继续用海水晶盐处理后的自来水养殖;盐碱胁迫组使用海水晶盐、N a HC O3和N a2C O3按比例(m(海水晶盐)m(N a HC O3)m(N a2C O3)=6 491)配制成相应的盐碱处理水养殖。试验期间盐碱 胁 迫 浓 度 每 天 以5%递 增(盐 度 每 天 以0.6 5递增,碱度每天以1.5 5 mm o l/L递增),至2 0 d时达到1 0 0%盐碱胁迫(养殖水盐度1 6,碱度3 2 mm o l/L)2 1。养殖2 1 d时每组随机选取3尾青海湖裸鲤剖杀,对照组采集鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉等组织,盐碱胁迫组采集腹侧肌肉、皮肤组织,液氮速冻后于-8 0 冰箱保存,备用。1.2 组织样品总R NA提取及反转录采用T r i z o l研磨法提取对照组和盐碱胁迫组青海湖裸鲤各组织总R NA,利用微量核酸测定仪(德国I m p l e n N P 8 0 M o b i l e)检测提取质量。取1 g总R NA,按照P r i m e S c r i p tTM 1 s t S t r a n d c D NA S y n-t h e s i s K i t(T a K a R a,J a p a n)试剂盒操作说明反转录为c D NA,-2 0 保存备用。1.3 青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因c D NA克隆及测序参考本课题组前期青海湖裸鲤皮肤组织转录组全长测序数据(第3代测序方法),在编码区设计特异性引物T NN I 1 F、T NN I 1 R和T NN I 2 F、T NN I 2 R(表1),用于扩增TNN I1和TNN I2基因中间片段。取对照组青海湖裸鲤腹侧肌肉组织c D NA为模板,扩增TNN I1和TNN I2基因中间片段,具体反应程序和体系参考文献2 2 进行。根据扩增的中间序列设计引物T NN I 1-5、T NN I 1-3 和T NN I 2-5、T NN I 2-3(表1),用于5 R A C E和3 R A C E试验,扩增对照组青海湖裸鲤腹侧肌肉组织TNN I1和TNN I2基因的5 端和3 端,具体反应程序和体系参考文献2 2 进行。对P C R产物进行1%凝胶电泳检测后,切胶回收目的片段,具体操作按照胶回收试剂盒说明书进行。将上述扩增的基因片段分别连接 至p MD 1 9-T载 体,具 体 反 应 体 系 参 考 文 献2 3,转化至大肠杆菌感受态细胞DH 5,均匀涂布于L B固体培养基(含氨苄青霉素1 0 0 m g/L)中,培养6 h后挑取阳性单克隆进行P C R检测,将P C R检测为阳性的克隆送至上海生工生物工程有限公司进行测序。用D NA S T A R软件对测序所获的中间片段、5 端和3 端序列进行拼接,获得TNN I1和TNN I2基因全长序列。以拼接获得的TNN I1和TNN I2基因全长序列为参考,设计引物T NN I 1-F C、T NN I 1-R C和T NN I 2-F C、T NN I 2-R C(表1),克隆TNN I1和TNN I2全长序列,进行序列测序结果准确性验证,具体程序和体系参考中间片段的克隆。表1 试验所用引物信息T a b l e 1 I n f o r m a t i o n o f p r i m e r s u s e d i n e x p e r i m e n t引物名称P r i m e r n a m e引物序列5 3 P r i m e r s e q u e n c e 5 3 用途A p p l i c a t i o nT NN I 1 FT T A T T GAAGAA G G C C A C A T C T A T G C中间片段克隆I n t e r m e d i a t e f r a g m e n t c l o n i n gT NN I 1 RAAAAG T G G T C C AA C A T AA C AAAA C CT NN I 1-5 T T C C T G C A G C T C C T G T G TA G G C A GA CTNN I1-5 R A C ET NN I 1-3 C AA GA T T GAT G T T G T T GA T GA G G C T C GA TA CTNN I1-3 R A C Eq T NN I 1-FAA C T A T C T G G T C T G C C T A C A C ATNN I1实时荧光定量P C RTNN I1 f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e P C Rq T NN I 1-RC A T C AA T C T T G C G G T GAA G C T CT NN I 2 FG C T T AA T C T GAA GA G C C T G G T G中间片段克隆I n t e r m e d i a t e f r a g m e n t c l o n i n gT NN I 2 RA C C A G C C T T A T C C T C AA T G T T C TT NN I 2-5 C A C C A G G C T C T T C AGA T T AA G C C T A C GTNN I2-5 R A C ET NN I 2-3 C AA GAA G GA G G T C AAA GA G GA G T C T G CTNN I2-3 R A C ET NN I 1-F CC T C C T AG T T C AA G C G T C T A TTNN I1序列全长验证TNN I1 s e q u e n c e f u l l-l e n g t h v a l i d a t i o nT NN I 1-R CC AAA G T G C T AAGA T C A C C T GT NN I 2-F CG C T C A C C AG T C T T T C C A G T T C TTNN I2序列全长验证TNN I2 s e q u e n c e f u l l-l e n g t h v a l i d a t i o nT NN I 2-R CGA G C G G GA G G T T C A C AG T A T A Gq T NN I 2-FG C T T AA T C T GAA GA G C C T G G T GTNN I2实时荧光定量P C RTNN I2 f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e P C Rq T NN I 2-RC T T C A T C AA C C T T G T C GA T C T GE F 1 FG T A T T A C C A T T GA C A T T G C内参基因E F1实时荧光定量P C RR e f e r e n c e g e n eE F 1 RC T GA GAA G TA C C A G T GA T3第1 0期许保可,等:青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究1.4 青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因生物信息学分析克隆获得TNN I1和TNN I2基因全长序列后,确定TNN I1和TNN I2基因起始密码子、终止密码子、C D S区及编码氨基酸数等。根据TNN I1和TNN I2基因的C D S区,将其翻译成氨基酸序列,然后通过P r o t P a r a m在线工具预测TNN I1和TNN I2基因所编码蛋白质的等电点、分子质量及正负电荷氨基酸残基数、不稳定指数、脂肪系数。将青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因所编码的氨基酸序列在N C B I网站进行B L A S T比对,找到与之同源性较高的鱼类和哺乳动物的T NN I 1和T NN I 2序列,采用D NAMAN 8.0软件进行多序列对比。用C l u s t a l W对比鱼类及其他哺乳动物的T NN I 1、T NN I 2氨基酸序列,用ME GA 6.0软件中的邻位相连(n e i g h b o r-j o i n i n g)算法构建系统进化树。1.5 青海湖祼鲤组织中TNN I1和TNN I2基因mR NA表达水平检测以E F1 为内参基因,采用实时荧光定量P C R法检测对照组青海湖裸鲤的鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮 肤、腹 侧 肌 肉 组 织 中TNN I1和TNN I2基因的相对表达量,所需引物见表1中的q T NN I 1-F、q T NN I 1-R、q T NN I 2-F、q T NN I 2-R、E F 1 F、E F 1 R。反 应 体 系 为 上、下 游 引 物(1 0 m o l/L)各0.8 L,T B G r e e nTM P r e m i x E x T a qTM 1 0 L,d d H2O 6.4 L,c D NA 2 L。采用2-C t法计算结果,以脑组织表达量为1,确定其他组织的表达水平。以E F1 为内参基因,采用实时荧光定量P C R法检测对照组和盐碱胁迫组青海湖裸鲤皮肤和腹侧肌肉组织中TNN I1和TNN I2基因的相对表达量。反应体系同上,采用2-C t法计算结果,以对照组织表达量为1,确定盐碱胁迫组表达水平。组间差异显著性采用S P S S分析。2 结果与分析2.1 青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因c D NA的克隆及生物信息学分析扩增获得的青海湖裸鲤TNN I1基因序列全长为1 2 1 1 b p(G e n B a n k登录号:MW 8 4 5 7 6 5),其中3 非编码区5 3 3 b p,5 非编码区1 3 8 b p,开放阅读框5 4 0 b p,共编码1 7 9个氨基酸(图1);TNN I2基因序列全长为7 3 7 b p(G e n B a n k登录号:O P 3 4 1 8 0 1),其中3 非编码区1 2 2 b p,5 非编码区8 4 b p,开放阅读框5 3 1 b p,共编码1 7 6个氨基酸(图2)。图1 青海湖裸鲤TNN I1基因及其编码的氨基酸序列F i g.1 TNN I1 s e q u e n c e s o f G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i a n d t h e i r e n c o d e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s P r o t P a r a m在线预测结果显示,TNN I1编码的氨 基 酸 理 论 分 子 质 量 为2 0.6 9 k u,等 电 点 为9.6 1,带正负电荷的氨基酸残基总数分别为4 2和3 0,不稳定指数为3 9.7 5,属于稳定蛋白质,脂肪系4西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷数为7 4.1 3。TNN I2编码的氨基酸理论分子质量为2 0.2 0 k u,等电点为8.9,带正负电荷的氨基酸残基总数分别为3 1和3 5,不稳定指数为5 9.7 0,属于不稳定蛋白质,脂肪系数为8 3.0 7。图2 青海湖裸鲤TNN I2基因及其编码的氨基酸序列F i g.2 TNN I2 s e q u e n c e s o f G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i a n d t h e i r e n c o d e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s2.2 青海湖裸鲤T NN I 1和T NN I 2氨基酸序列D NAMAN 8.0软件比对结果(图3和图4)显示,青海湖裸鲤T NN I 1氨基酸序列与安水金线鲃的同 源 性 最 高(9 2.1 3%),其 次 为 犀 角 金 线 鲃(9 1.5 7%),与鲤鱼和鲫鱼的同源性均为9 1.0 1%,与滇池金线鲃的同源性为8 9.8 9%;T NN I 2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高(9 2.6 1%),其次为鲫鱼(9 1.4 8%),与安水金线鲃、犀角金线鲃、滇池金线鲃的同源性分别为8 9.7 7%,9 0.3 4%和8 8.6 4%。图3 青海湖裸鲤与其他物种TNN I 1氨基酸序列的多重比对F i g.3 M u l t i p l e c o m p a r i s o n o f TNN I 1 a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i w i t h o t h e r s p e c i e s5第1 0期许保可,等:青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究图4 青海湖裸鲤与其他物种TNN I 2氨基酸序列的多重比对F i g.4 M u l t i p l e c o m p a r i s o n o f TNN I 2 a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i w i t h o t h e r s p e c i e s 氨基酸序列多重比对结果(图3和图4)显示,青海湖裸鲤T NN I 1氨基酸序列长度与所选参比鱼类相同,但比哺乳动物缺少7个氨基酸残基;青海湖裸鲤T NN I 2比电鳗和黄颡鱼少2个氨基酸残基,比哺乳 动 物 少6个 氨 基 酸 残 基。青 海 湖 裸 鲤 的T NN I 1和T NN I 2氨基酸序列相似度为4 6%。2.3 青海湖裸鲤的系统发育结果基于T NN I 1和T NN I 2氨基酸序列,用ME GA 6.0软件通过n e i g h b o r-j o i n i n g算法构建系统进化树,分析青海湖裸鲤与其他物种的亲缘关系。结果(图5)显示,从T NN I 1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从T NN I 2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。T NN I 1和T NN I 2氨基酸序列分析结果均显示,青海湖裸鲤与哺乳动物的亲缘关系较远。2.4 青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因的组织表达采用实时荧光定量P C R方法检测TNN I1和TNN I2基因在青海湖裸鲤1 0个不同组织中的表达水平。结果(表2)显示,TNN I1和TNN I2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,说明TNN I1和TNN I2 2个基因均不存在组织特异性;2个基因均在腹侧肌肉中相对表达量最高,其次TNN I1基因在皮肤和心脏组织中相对表达量较高,TNN I2基因在眼和皮肤组织中相对表达量较高。2.5 盐碱胁迫下青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因的表达情况青海湖裸鲤大部分时间生活在具有较高盐碱度的青 海 湖 中,为 探 究 盐 碱 胁 迫 对 青 海 湖 裸 鲤TNN I1和TNN I2基因表达的影响,利用实时荧光定量P C R检测盐碱胁迫条件下腹侧肌肉和皮肤组织中TNN I1和TNN I2基因相对表达情况。结果(图6)显示,在盐碱胁迫条件下,青海湖裸鲤腹侧肌肉组 织 中TNN I1基 因 相 对 表 达 量 显 著 下 调(P0.0 5),TNN I2基因相对表达量极显著下调(P0.0 1);皮肤组织中TNN I1基因相对表达量极显著下调(P0.0 1),而TNN I2基因相对表达量极显著上调(P0.0 1)。6西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷图5 基于T NN I 1和T NN I 2氨基酸序列的青海湖裸鲤系统发育进化树F i g.5 P h y l o g e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i b a s e d o n T NN I 1 a n d T NN I 2 a m i n o a c i d s e q u e n c e s表2 青海湖裸鲤TNN I1和TNN I2基因在不同组织中的相对表达量T a b l e 2 R e l a t i v e e x p r e s s i o n o f TNN I1 a n d TNN I2 i n d i f f e r e n t t i s s u e s o f G y m n o c y p r i s p r z e w a l s k i i基因G e n e脑B r a i n眼E y e鳃B r a n c h i a脾脏S p l e e n肝脏L i v e rTNN I11.0 0 00.1 1 00.6 9 40.0 2 63.9 8 20.3 5 72.0 3 30.1 6 41.0 1 60.1 7 9TNN I21.0 0 00.0 4 83 9 9 3.2 1 04 6.6 8 79.4 4 80.8 8 20.0 8 20.0 0 50.3 8 60.0 4 4基因G e n e肠I n t e s t i n e s肾K i d n e y心H e a r t皮肤S k i n腹侧肌肉M u s c l eTNN I10.6 7 10.1 7 10.1 7 60.0 9 66 2.8 2 82.5 4 23 6 0.3 7 03 4.7 0 35 7 5 2.6 0 69 4.4 5 3TNN I20.0 3 30.0 0 80.8 7 30.1 4 00.5 6 90.0 2 41 5 3.9 8 78.2 3 05 1 4 1 8.5 0 3+1 7 3.3 3 5图柱上标*表示同一基因不同处理相比差异显著(P0.0 5),标*表示差异极显著(P0.0 1)*i n d i c a t e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e