通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性.pdf
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1、基金项目:辽宁省“兴辽英才计划”项目()辽宁省教育厅面上项目()沈阳市科技特派团项目()作者简介:于晓淼 女硕士研究生 研究方向为微生物学:.通讯作者 男教授博士博士生导师 研究方向为微生物学:.收稿日期:通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性于晓淼 赵允章 王锋超 孙 悦 刘宏生(.辽宁大学 生命科学院辽宁 沈阳.辽宁大学 药学院辽宁 沈阳.辽宁省生物大分子计算模拟与信息处理专业技术创新中心辽宁 沈阳.辽宁省药物分子模拟与设计工程实验室辽宁 沈阳.沈阳市生物大分子计算模拟与信息处理重点实验室辽宁 沈阳)摘 要 纳豆激酶()是一种纤溶酶可溶解血栓常用于治疗心血管疾病()然而野生型 往往表现
2、出很少的纤溶能力和较低的热稳定性针对如何提高 的热稳定性和活性开展研究 使用重叠延伸 法将 中位于 位的 替换为 为验证突变后的热稳定性将野生型 和突变体 均在不同温度下孵育相同时间使用纤维蛋白板法测定二者酶活验证热稳定性 成功构建了 测量酶活结果显示野生型 和突变体 酶活分别达到./和./结果表明突变体 的酶活比野生型 高(.)将野生型 和突变体 在 温度下孵育 后测量酶活野生型 在 时丧失酶活突变体 在 时丧失酶活耐热温度提高 结果表明突变体 的蛋白结构在突变后发生了改变使 提高了耐热温度关键词 纳豆激酶定点诱变纤溶活性热稳定性分子动力学模拟中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(
3、.)()().()././(.).微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .纳豆激酶(.)()是一种丝氨酸蛋白酶具有单链结构由 个氨基酸组成 催化中心包含三个保守残基:、和 有研究表明 不仅能溶解血栓还具有预防高血压抗凝血和抗血小板聚集的功能 并且 与传统溶栓药物相比其优势在于安全无毒性、成本低、天然生产可以口服 的三维结构于 年通过 射线衍射法分析得到这为进一步研究 的蛋白结构提供了新的思路 传统的突变技术是提高菌株生产性能的重要方法 通过三维结构的构建和分析发现在活性中心和含氧阴离子穴中出现的氢键对蛋白酶水解有着重要作用因此 等将位于活性中心附近的 、和 均突变为 以消除这些氢键的影响结果显示
4、将这四个位点突变后自由能增加催化效率显著降低因此证明氢键的存在主要影响催化效率而不是底物的亲和力 等用 取代位于 号的 发现突变体 的催化效率是野生型的两倍 基于该发现构建了将 位的 改造为 将 位的 改造为 的双突变体 结果表明双突变体比单突变体表现出更强的催化能力抗氧化活性显著提高 刘朔等对 进行了紫外诱变发现当位于 位的 诱变为 后会提高耐热性突变后 的热稳定性最终提高了 酶活性提高了.将紫外射线和 射线结合使用 等成功筛选到比野生型 蛋白产量提高两倍的突变体 刘中美等通过定点突变构建 突变体 和突变体 经检验突变体的热稳定性明显优于野生型 半衰期分别从 增加到 和 基于上述研究本研究
5、的活性位点分别从第 位到第 位进行了定向诱变 当第、位点突变后发现在第 位定点突变后酶活性和催化活性降低但酶催化效率和热稳定性显著提高第、和位点结果相近 这些结果提示在第 位点至第 位点之间存在着影响 活性和热稳定性的位点 因此本研究预测并构建了 突变体进而评估突变体 的纤维蛋白溶解活性和热稳定性 材料与方法.材料.菌 株 及 载 体 纳 豆 枯 草 芽 胞 杆 菌()保存于辽宁大学生命科学院微生物资源实验室(本实验室)质粒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司大肠埃希菌 和 感受态细胞均在本实验室保藏.培养基 培养基:每 液体培养基称量 粉末(胰蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 )称取 琼脂粉加入 培
6、养基配制固体培养基.主要试剂与仪器设备 连接酶、产物纯化回收试剂盒、质粒 小剂量提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司、购自康为生物科技有限公司牛血纤维蛋白原、牛凝血酶和尿激酶购自中国食品药品检定研究院内切酶、购自宝日医生物技术(大连)有限公司 仪(孔赛默飞世尔科技有限公司)定时电泳仪(北京六一仪器厂)紫外成像仪(美国威泰克公司).方法.重组质粒的构建以纳豆枯草芽胞杆菌 的 为模板扩增出 基因将 和扩增的 基因分别双酶切酶切位点为 、连接构建重组质粒 并以此为模板通过重叠延伸 法构建突变质粒()引物列 微 生 物 学 杂 志 卷表见表.重组载体在大肠埃希菌的表达将重组质粒 和 分别转入大肠埃希
7、菌 挑取阳性单菌落接种于 含有卡那霉素(/)的 液体培养基中 /摇床培养 将活化后的菌液作为接种液以体积比 的比例转移到 含有卡那霉素(/)的 液体培养基中 /摇床培养 后在菌液中加入终浓度为./的 诱导表达降低培养温度至 /摇床培养 诱导后菌液 /离心弃上清保留沉淀将菌体沉淀用 润洗后用细胞破碎机进行破碎破碎的菌液 /离心后保留上清和沉淀并用 验证蛋白表达情况表 扩增野生型 和突变体 引物序列 .名称引物序列野生型 .纤维蛋白平板法测量 活性参照 等的方法并稍作改进验证重组 的溶栓活性 称量.琼脂糖和 纤维蛋白原分别加入 /的 缓冲液中混匀放入 水浴锅中保温备用 取./的凝血酶加入琼脂糖 混
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