同种异体血液输注对创伤性失血患者血浆外泌体miRNA表达的影响.pdf

J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3334DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.03.008*本课题受上海市2020年度“科技创新行动计划”生物医药科技支撑专项项目（No.20S31902900）资助作者单位：200233 上海交通大学医学院附属第六人民医院作者简介：高宗帅，硕士研究生在读，主要从事血型血清学与分子生物学技术研究，（E-mail）。通信作者：李志强，主任医师，硕士研究生导师，主要从事血液病学诊治和输血医学研究，（E-mail）。临床输血 论著同种异体血液输注对创伤性失血患者血浆外泌体miRNA表达的影响*高宗帅 张海方 李志强 【摘要】目的 通过观察异体输血对创伤性失血患者外泌体miRNA的差异表达，筛选出差异表达的外泌体miRNA，为后续靶基因和通路的研究奠定基础。方法 分别采集外伤患者在输异体血前和输血后外周血标本各3例，通过对血浆标本分离收获后的外泌体miRNA高通量测序，分析比较输血前后两组外泌体miRNA差异表达情况，同时以荧光定量PCR法进一步验证差异基因表达情况。结果 通过高通量测序分析，共测序到1 570个miRNA存在差异表达，实验组比较对照组，上调的有1 189个，下调的有381个，以倍数变化Fold change2.0，P-value 0.05作为差异miRNA筛选的阈值，筛选出显著变化的差异表达miRNA有14个，其中显著上调的miRNA有5个，分别为miR-499a-5p、miR-200a-3p、miR-372-3p、miR-novel-chr12_5583、miR-novel-chr22_24253；显著下调的miRNA有9个，分别为miR-6852-5p、miR-452-5p、miR-1287-5p、miR-204-3p、miR-375-3p、miR-502-3p、miR-345-5p、miR-novel-chr7_38986、miR-451a。结论 输注同种异体血液对创伤性失血患者的外泌体miRNA存在差异表达。其发生机制可能通过不同信号通路对患者机体免疫系统调节产生影响。然而，对患者机体免疫调节程度、与肿瘤的相关性有待于扩大样本量进一步研究。【关键词】输血 外泌体 miRNA 高通量测序 【中图分类号】R457 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）03-0334-08Effect of Allogeneic Blood Transfusion on Plasma Exosomal MiRNA Expression in Patients with Traumatic Blood Loss GAO Zongshuai,ZHANG Haifang,LI Zhiqiang.Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth Peoples Hospital,Shanghai 200233【Abstract】Objective To observe the differential expression of exosomal miRNAs in patients with traumatic blood loss induced by allogeneic blood transfusion,screen out the differentially expressed exosomal miRNAs,and lay the foundation for the subsequent study of target genes and pathways.Methods Peripheral blood samples were collected from 3 trauma patients before and after transfusion,respectively.Through high-throughput sequencing of exosome miRNA extracted and harvested from plasma samples,the differential expression of exosome miRNA was analyzed and compared between the two groups.Meanwhile,fluorescence quantitative PCR was used to further verify the differential gene expression.Results High-throughput sequencing analysis found that a total of 1 570 miRNA were differentially expressed.Compared with the control group,1 189 miRNA were up-regulated and 381 miRNA were down-regulated in the experimental group.When fold change2.0,P-value 0.05 were used as the threshold for differential miRNA screening,there were 14 differentially expressed miRNA with significant changes.5 miRNA were significantly up-regulated,including miR-499a-5p,miR-200a-3p,miR-372-3p,miR-novel-chr12_5583 and miR-novel-chr22_24253.9 miRNA were significantly down-regulated,including miR-6852-5p,miR-452-5p,miR-1287-5p,miR-204-3p,miR-375-3p,miR-502-3p,miR-345-5p,miR-novel-chr7_38986 and miR-451a.Conclusions Allogeneic blood transfusion triggers differential expression of exosomal miRNA in patients with traumatic blood loss.Its mechanism may affect the regulation of the patients immune system through different signaling pathways.However,the degree of immune regulation in patients and the correlation with tumors need to be further studied with larger sample size.【Key words】Blood transfusion Exosome miRNA High-throughput sequencing同种异体血液输注（简称：异体输血）是治疗贫血或（和）失血重要手段之一。有研究认为，血液具有反应原性和免疫原性，输注血液成分时，因其含有多种免疫调节介质，它们相互作用可导致机体促炎症作用和免疫抑制作用。近年来，随着分子生物学和免疫学的大力发展，外泌体在免疫调节中的作用研究受到越来越多的关注。外泌体包含核酸、蛋白质、脂质等一系列生物活性物质，并且能够在多种细胞间发临床输血与检验2023年6月第25卷第3期335挥信息传递的作用，成为细胞间交流的新媒介。它不仅参与人体多种正常的生理过程，而且参与肿瘤、感染性疾病的发生发展过程。由于异体输血是否会对创伤性失血患者外泌体miRNA产生影响的文献报道甚少，因此，著者通过观察异体输血对创伤性失血患者外泌体miRNA的差异表达，期望找到差异基因，为后续靶基因和通路的研究奠定基础。材料与方法1 研究对象 研究对象来自于2020年6月1日2020年9月30日本院外伤致急性失血患者共3例，平均输注红 表1 患者信息组别姓名年龄（岁）血型红细胞输注量（U）血浆输注量（mL）研究组铁*20A+161600顾*57B+111400张*46O+121200验证组傅*66A+121200豆*22A+121200向*50B+151800沈*24B+141400吴*39O+121200范*45O+1316002 实验主要仪器与试剂 低温超速离心机（Optima L-100XP，Beckman Coulter，美国）；透射电镜（HT-7700，Hitachi，日本）；马尔文纳米颗粒追踪分析仪（ZetaView，Particle Metrix，德国）；微量核酸蛋白定量仪（NanoDrop，ND-1000，美国）；高通量测序仪（Illumina NovaSeq 6000，美国）。外泌体分离提纯试剂盒exoEasy Maxi Kit（Qiagen，美国）。3 血浆外泌体的提取和鉴定 将所收集到的EDTA抗凝的血样标本，先以5 000g离心10 min，取上清液即为血浆，使用外泌体分离提纯试剂盒分离和提取血浆外泌体。应用透射电镜对血浆外泌体囊泡的形态和大小进行鉴定。通过马尔文纳米颗粒追踪分析仪对外泌体的纳米粒子进行跟踪分析，鉴定外泌体粒径和浓度。4 血浆外泌体总RNA提取与质控 使用Trizol法提取总RNA，用微量核酸蛋白定量仪对提取的总RNA进行定量和质量评价，用变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性。经质控合格后，应用Illumina NovaSeq 6000测序仪进行测序。5 高通量测序和miRNA表达谱分析 经过Illumina NovaSeq 6000测序仪测序、图像分析、碱基识别后，测序得到了原始reads，通过Q30质控，Q3080%表示测序质量良好。使用cutadapt软件（v1.9.3）对原始reads进行去接头，去低质量reads，长度过滤保留长度15 nt的reads，得到去接头后的reads即为Clean reads，使用Novoalign软件（v3.02.12）将每个样品的Clean reads比对到合并的人类pre-miRNAs数据库上，最多允许1处错配。统计比对到每条成熟miRNA上的比对数作为该miRNA的原始表达量，并使用DESeq2包进行标准化，利用标准化的reads数分别计算倍数变化Fold change，P-value和FDR（以Benjamini Hochberg方法修正得到的P值），以倍数变化Fold change2.0，P-value 0.05作为差异miRNA筛选的阈值，筛选出差异表达的miRNA。6 生物信息学分析 使用R包的heatmap2函数，以标准化reads进行差异表达分析，绘制差异表达miRNA的聚类图；用散点图表示两组间样品差异表达数据的分布图，用于评估组间差异表达miRNA的整体分布趋势；绘制火山图，用以直观的展示整体miRNA表达水平，以及差异miRNA的分布情况。7 实时定量荧光RT-qPCR验证 从测序结果中，分别选取上调最显著的miR-499a-5p和下调最显著的miR-6852-5p进行RT-qPCR验证。收集相同类型的患者6细胞13 U，血浆1400 mL；研究患者纳入标准：男性；创伤患者（车祸伤、坠落伤、摔伤等）；无其他疾病史；无输血史。均否认有其他基础疾病和输血史。排除标准：未成年男性，年龄18岁；由于丧失行为能力或无法提供知情同意；自身为过敏体质；合并输注其他血液成分，比如冷沉淀、血小板等；经抢救无效死亡患者。设输血前1 h内采集的肘正中静脉EDTA抗凝血5 mL为对照组；输血后24 h采集的肘正中静脉EDTA抗凝血5 mL为实验组。另外收集相同病例6例，扩大样本对显著差异基因进行了RT-qPCR验证。9例患者信息内容见表1。J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3336 表2 PCR引物序列一览表GeneForward Primer（5-3）Reverse Primer（5-3）miR-499a-5pGGGTTAAGACTTGCAGTGCAGTGCGTGTCGTGGAGTmiR-6852-5pGGGCCCTGGGGTTCTGAGCAGTGCGTGTCGTGGAGT内参U6CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT例，Trizol试剂提取外泌体总RNA后，用小分子反转录试剂盒（Mir-X miNA First Strand Synthesis Kit），具体步骤按照试剂盒说明书，将RNA反转录成 cDNA，以cDNA为模板进行片段的扩增，以U6作为内参基因，使用2-CT法分析扩增基因的相对表达量，并与转录测序结果相关基因表达量进行比较。PCR引物序列见表2。8 统计学分析 使用SPSS 22.0软件进行统计资料的分析。对于符合正态性分布的数据，采用 s表示，两两比较采用t检验，P0.05为差异具有统计学意义。结 果1 血浆外泌体的鉴定 使用透射显微镜观察和测量外泌体的形态和大小，镜下放大40 000倍可见大小均200 nm，呈圆形或者椭圆型的膜性囊泡，见图1。使用纳米颗粒跟踪分析仪测量外泌体的浓度粒径，其范围在30150 nm，中位数为77.75 nm，见图2；外泌体浓度为5.03E+10 Particles/mL，见图3。2 血浆外泌体总RNA质控 使用微量核酸蛋白定量图1 透射电镜下外泌体的大小和形态（40 000倍）注：横轴Size代表外泌体粒径大小，纵轴Events代表样品采集的颗粒数。图2 外泌体粒径分布注：纵坐标的荧光强度（FITC-H）代表了该外泌体粒径。横坐标的同步信号表示该外泌体出现的频率，也就是外泌体浓度。图3 外泌体浓度图仪测量每个样品的RNA浓度和纯度。以OD260/OD280比值作为RNA纯度指标。若OD260/OD280比值范围在1.82.1，则RNA纯度合格。实验结果显示，所有样本的纯度都在1.821.87，均为合格。3 血浆外泌体miRNA测序结果 本次共测序到1570个miRNA存在差异调节，实验组（输血后）相比对照组（输血前），上调的有1 189个，下调的有381个，显著变化的miRNA有14个，其中显著上调的miRNA有5个，分别为miR-499a-5p、miR-200a-3p、miR-372-3p、miR-novel-chr12_5583、miR-novel-chr22_24253；显著下调的miRNA有9个，分别为miR-6852-5p、miR-452-5p、miR-1287-5p、miR-204-3p、miR-375-3p、miR-502-3p、miR-345-5p、miR-novel-chr7_38986、miR-451a。结果见表3。4 差异miRNA的生物信息学分析 绘制差异表达miRNA的聚类图，见图4；散点图用于评估组间差异表达miRNA的整体分布趋势，见图5；火山图直观的展示整体miRNA表达水平，以及差异miRNA的分布情况，见图6。5 RT-qPCR验证结果 为了验证二代测序结果的准确性，分别选取前上调最显著的miR-499a-5p和下调最显著的miR-6852-5p进行RT-qPCR验证，实验组和对临床输血与检验2023年6月第25卷第3期337 表3 差异表达的外泌体miRNA结果miRNA InformationStatistics&Regulationmature-miRNApre-miRNAmature-sequenceFold ChangeP-valueFDRRegulationhsa-miR-200a-3phsa-mir-200aUAACACUGUCUGGUAACGAUGU7.391502258 0.017207682 0.945914441uphsa-miR-372-3phsa-mir-372AAAGUGCUGCGACAUUUGAGCGU6.738978092 0.030308003 0.945914441uphsa-miR-499a-5phsa-mir-499aUUAAGACUUGCAGUGAUGUUU7.8631257270.012560350.945914441uphsa-miR-novel-chr12_5583hsa-mir-novel-chr12_5583CUGCUCUGACUGUGUCUCUGUGG6.730215352 0.042673724 0.945914441uphsa-miR-novel-chr22_24253hsa-mir-novel-chr22_24253UGCCUUCCUUCUGAGAAC6.539485781 0.042305443 0.945914441uphsa-miR-1287-5phsa-mir-1287UGCUGGAUCAGUGGUUCGAGUC-5.985174632 0.041235437 0.945914441downhsa-miR-204-3phsa-mir-204GCUGGGAAGGCAAAGGGACGU-5.789869910.049409001 0.945914441downhsa-miR-345-5phsa-mir-345GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC-5.154117767 0.047514878 0.945914441downhsa-miR-375-3phsa-mir-375UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-5.652740088 0.018851628 0.945914441downhsa-miR-451ahsa-mir-451aAAACCGUUACCAUUACUGAGUU-4.604297146 0.025306276 0.945914441downhsa-miR-452-5phsa-mir-452AACUGUUUGCAGAGGAAACUGA-7.256803265 0.005461944 0.945914441downhsa-miR-502-3phsa-mir-502AAUGCACCUGGGCAAGGAUUCA-5.342089994 0.041682991 0.945914441downhsa-miR-6852-5phsa-mir-6852CCCUGGGGUUCUGAGGACAUG-7.377734056 0.008788634 0.945914441downhsa-miR-novel-chr7_38986hsa-mir-novel-chr7_38986AGGUCAGGAGUUCGAGAC-5.090499689 0.025954083 0.945914441down注：横轴表示实验样本，纵轴表示不同的miRNA；红色代表显著上调的差异miRNA，绿色代表显著下调的差异miRNA。图4 外泌体miRNA差异表达聚类分析图 J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3338注：红色点表示上调，绿色点表示下调，中间部分的紫色点代表无差异的miRNA。图5 miRNA表达的散点图注：横轴用log2（FoldChange）表示，纵轴用-log10（P-value）表示，带颜色的圆点代表差异表达的miRNA，绿色圆点代表显著下调，红色圆点代表显著上调，灰色圆点代表无明显变化。图6 miRNA表达的火山图照组比较存在差异，具有统计学意义（P0.05），见表4。溶解曲线未见双峰，扩增曲线各期明显，完成特异性扩增，说明扩增结果可信，见表5。6 miR-499a-5p和miR-6852-5p靶基因预测 上调最显著的miR-499a-5p和下调最显著的miR-6852-5p靶基因预测前5结果，见表6。讨 论已有大量研究表明外泌体在人体生理过程中发挥各种作用，在细胞的生长和分化，以及致癌、耐药和免疫调节等病理生理过程1-4，并且人体内几乎所泌体中最多的非编码RNA，在各生理过程发挥重要作用。随着分子生物学和免疫学的快速发展，越来越多的研究揭示外泌体miRNA调节免疫机制的重要性。外泌体miRNA通过抑制mRNA的翻译或者促进mRNA降 表4 验证差异表达的miRNA表达水平准确性实验组对照组PmiR-499a-5p2.371.670.700.270.04miR-6852-5p0.500.311.741.260.04有的活性细胞均可分泌外泌体（细胞外囊泡），包括红细胞、白细胞、血小板。通常外泌体大小约30 200 nm，在透射电镜下成圆形或者椭圆型，含有丰富的DNA、RNA、蛋白质和脂质5，其中miRNA作为外临床输血与检验2023年6月第25卷第3期339 表5 扩增的溶解曲线和扩增曲线结果基因名溶解曲线扩增曲线miR-499a-5pmiR-6852-5p内参U6 表6 miR-499a-5p和miR-6852-5p靶基因预测前5结果miRNAGeneEnergyStylehsa-miR-499a-5pSOX629.21uphsa-miR-499a-5pAP2B123.63uphsa-miR-499a-5pDIAPH222.48uphsa-miR-499a-5pIMPG221.43uphsa-miR-499a-5pERLIN121.29uphsa-miR-6852-5pORAI383.48downhsa-miR-6852-5pNCOA580.44downhsa-miR-6852-5pGINS475.53downhsa-miR-6852-5pMAGEB369.45downhsa-miR-6852-5pFBXL1669.07down解来调控转录后基因的表达，控制着大约三分之一的蛋白质编码基因，从而调节免疫细胞的功能。近年来的研究表明，外泌体miRNA不仅可以调节免疫细胞的分化和增殖来影响免疫反应的强度，还可以影响免疫细胞产生的物质（如多种细胞因子和抗体）来调节炎症反应和免疫应答，甚至外泌体miRNA还可以调节肿瘤细胞的生长和转移，影响肿瘤的发展和扩散，但是外泌体miRNA调节免疫作用机制仍然不是很清楚。本实验研究发现，创伤性失血患者经输血治疗后，血浆外泌体miRNA表达明显上调有5个，分别是miR-499a-5p、miR-200a-3p、miR-372-3p、miR-novel-chr12_5583、miR-novel-chr22_24253，其中miR-499a-5p上调最为明显；表达明显下调的有9个，分别为miR-6852-5p、miR-452-5p、miR-1287-5p、miR-204-3p、miR-375-3p、miR-502-3p、miR-345-5p、miR-novel-chr7_38986、miR-451a，其中miR-6852-5p下调最为明显。大量研究发现，miRNA在癌症中发挥重要作用，有研究表明6，miR-499a-5p是胰腺癌的一种致癌基因，它的过度表达可以加快胰腺癌细胞的增殖和迁移；万沛等7发现，在膀胱癌组织中miR-200a-3p表达水平明显上调，miR-200a-3p过表达不仅促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和炎性细胞因子释放，抑制癌细胞凋亡；还有研究发现，miR-372-3p是雷帕霉素引起肝移植患者甘油三酯升高的关键调控因子8。国外一篇文献报道9，miR-6852-5p可能是lncRNA LINC01235调控TWIST2的关键基因，进而影响胃癌细胞的迁移和侵袭，推测也与癌症相关；miR-452-5p在结直肠癌中显著上调10；miR-1287-5p在慢性鼻窦炎组中表达下调，miR-1287-5p的上调可抑制了IL-6、IL-8、TNF-等因子的产生，J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3340导致促炎症细胞因子的减少11；在脂多糖诱导的肺损伤小鼠模型中，miR-204-3p表达上调，其miR-204-3p表达下调可抑制TNF-、IL-6和IL-1的分泌，从而减轻肺泡损伤12；miR-375-3p在炎症过程中发挥作用，miR-375-3p的表达与炎症因子IL-1和IL-6的释放呈负相关13；在结核患者中，miR-502-3p具有抗炎作用，通过靶向作用ROCK1基因来抑制促炎症细胞因子的表达，促进结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活，调控宿主对结核分枝杆菌的免疫应答14；miR-345-5p是近年来在一些人类癌症中发现的一种抑癌基因，赵明等15研究证明，miR-345-5p在甲状腺癌中表达明显下调，并且通过靶向SETD7蛋白可有效抑制甲状腺癌的肿瘤发生；miR-451a在癌症细胞的增殖、迁移和侵袭中起到重要作用，已有大量文献报道miR-451a分别在非小细胞肺癌16、前列腺癌17、口腔癌18、乳腺癌19和胆管癌20、甲状腺癌21中均显著下调；miR-novel-chr7_38986为新发现的miRNA，国内外研究文献报道罕见。外泌体miRNA除了参与肿瘤的发生、发展，还通过调节免疫细胞的功能和活性来影响免疫系统。外泌体miRNA可以调节T细胞的发育、增殖和功能。有文献报道22，miR-150的过表达通过抑制FOXP1和RC3H1促进T细胞向效应T细胞和记忆T细胞分化，增强T细胞凋亡，抑制细胞增殖，增加促炎因子的分泌。外泌体miRNA也能够调节巨噬细胞的极化和功能，外泌体miR-223通过靶向调控单核细胞白血病锌指蛋白（MOZ）来促进巨噬细胞的M2极化23，还促进单核/巨噬细胞分泌IL-6，激活信号转导及转录激活蛋白3（TAT3）活性，促进免疫应答24。miR-21可以加速单核细胞的分化成熟25，也成为巨噬细胞抗炎反应的关键中介。miR-150可以有效地阻止CD28/B7共刺激信号转导，有效诱导免疫耐受26。外泌体miRNA也可以通过调节炎症相关的信号通路，影响炎症反应的发生和发展。OLIVIERI研究发现27，miR-21和miR-146通过NF-B和NLRP3通路来调节炎症反应，并且首次将miR-21和miR-146确定为调节炎症的免疫系统调节因子。也有研究发现28，miR-146a抑制炎症反应。DANESH等29表明了库存血液的外泌体囊泡主要与单核细胞相互作用并诱导促炎症细胞因子和TNF-的分泌，调节炎症反应。黄豪博等人30研究了库存血中外泌体miRNA表达量随储存时间的变化，研究miR-125b-5p的表达在大于21天后显著增加，35天库存血miR-125b-5p表达量达到峰值。而miR-4454和miR-451a的表达随着保存时间的延长逐渐升高。总之，外泌体miRNA调节免疫机制的研究进展已经取得了显著的进展，其在肿瘤、感染性疾病和免疫性疾病等方面的作用已经得到了广泛的研究和应用。未来，随着技术和研究的进一步深入，外泌体miRNA在临床中的研究价值和应用前景将会更加广阔。本研究的全部思路是通过观察创伤性失血患者输血前后血清中外泌体miRNA的表达量，利用生物信息学技术，找到显著变化的miRNA并研究其相关信号通路，进一步探究外泌体miRNA对创伤性失血患者在输血后免疫调节的作用。目前发表的差异表达的miRNA只是我们初步的研究成果，并不是所有的研究，研究中虽然存在一些缺点和不足，比如没能完整的测出每袋异体血的外泌体miRNA，每个创伤病人的免疫紊乱状态可能因伤情严重程度或不同病情阶段而不同，或者不同供血来源、患者的年龄、性别和血型等变量均可能影响外泌体miRNA的表达，以上问题也未有文献研究，均有待于我们进一步研究，希望本次研究能为外泌体miRNA在输血相关免疫调节的作用提供新思路。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献 1 JAN A T,RAHMAN S,KHAN S,et al.Biology,pathophys iological role,and clinical implications of exosomes:a critical appraisalJ.Cells,2019,8(2):99.2 QING L M,CHEN H W,TANG J Y,et al.Exosomes and their microRNA cargo:new players in peripheral nerve regenerationJ.Neurorehabil Neural Repair,2018,32(9):765-776.3 MATHIEU M,MARTIN-JAULAR L,LAVIEU G,et al.Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communicationJ.Nat Cell Biol,2019,21(1):9-17.4 R E M Y K E,H A L L M W,C H O L E T T E J,e t al.Mechanisms of red blood cell transfusion-related immunomodulationJ.Transfusion,2018,58(3):804-815.5 PEGTEL D M,GOULD S J.ExosomesJ.Annu Rev Biochem,2019,88:487-514.6 OUYANG L,LIU R D,LEI D Q,et al.miR-499a-5p promotes 5-FU resistance and the cell proliferation and migration through activating PI3K/Akt signaling by targeting PTEN in pancreatic cancerJ.Ann Transl Med,2021,9(24):1798.7 WAN P,CHEN Z L,HUANG M Z,et al.miR-200a-3p 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