铜死亡基因在子宫内膜癌中的预后意义.pdf

铜死亡基因在子宫内膜癌中的预后意义张亚萍1，李朝明2a，韩 红2b，刘红艳2b，冲喜会2b，刘小凤3，陈 凡3，魏林珍3，张芸中4,5，秦天生3,4,51 平凉市第二人民医院 妇产科，甘肃 平凉 744000；2 陇南市第一人民医院 a 泌尿外科，b 妇产科，甘肃 陇南 742500；3 甘肃中医药大学 第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；4 兰州大学第二医院妇产科，甘肃 兰州 730000；5 兰州大学 第二临床医学院，甘肃 兰州 730000 收稿日期：2023-03-01基金项目：甘肃省教育厅重大专项资助项目（LCCX2021011）；甘肃省中医药管理局科研资助项目（GZKG-2021-52）；甘肃省自然科学基金资助项目（20JR5RA332）；兰州市科技局科研资助项目（2020-RC-52）作者简介：张亚萍，女，副主任医师，研究方向为妇科微创和妇科内分泌，e-mail:秦天生，女，主任医师，博士，研究方向为妇科肿瘤，e-mail:，通信作者摘要：目的目的 近年来铜死亡机制备受关注，但它在子宫内膜癌中的作用机制尚不清楚，本文探讨了铜死亡相关基因在子宫内膜癌中的预后与应用价值。方法方法 使用癌症基因组图谱（TCGA）数据库获取原始数据，“limma”软件包用于鉴定癌组织和正常组织之间的差异表达基因；“ConsensusClusterPlus”包将子宫内膜癌病例分为两个亚组；“ggplot2”分析分型间差异基因与临床特征间的相关性，最后通过环氧合酶分析确定与子宫内膜癌患者预后相关的铜死亡基因。基于铜死亡基因鉴定了子宫内膜癌的亚型（C1、C2），分析2个亚型与富集的信号通路、总生存期（OS）、临床特征和免疫浸润的相关性。结果结果 在10个铜死亡基因中筛选出子宫内膜癌组织与正常癌旁组织中差异表达的6个基因。功能富集分析表明C1激活了癌症相关的信号通路，C2激活了抑癌相关的信号通路，差异有统计学意义（P 0.05）。C1的OS大于C2，二者差异有统计学意义（P 0.001）。病理分级、分期、年龄等临床特征在2个亚型中存在显著差异（P 0.05）。与C2相比，C1存在更大的免疫细胞浸润（P 0.05）。结论结论 基于铜死亡基因，可鉴定子宫内膜癌的亚型，基因PDHA1、GLS、CDKN2A与子宫内膜癌预后存在相关性。关键词：铜死亡；子宫内膜癌；预后；生物信息学中图分类号：R737.33文献标识码：Adoi：10.13885/j.issn.1000-2812.2023.06.009Prognostic significance of copper death gene inendometrial cancerZhang Yaping1,Li Chaoming2a,Han Hong2b,Liu Hongyan2b,Chong Xihui2b,Liu Xiaofeng3,Chen Fan3,Wei Linzhen3,Zhang Yunzhong4,5,Qin Tiansheng3,4,51 Department of Obstetrics and Gynecology,Pingliang Second Peoples Hospital,Pingliang,744000,China;2 a Departmeat of Urinary Surgery,b Obstetrics and Gynecology,The First Peoples Hospital of Longnan,Longnan 742500,China;3 The First Clinical Medical School,Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;4 Department of Obstetrics and Gynecology,Second Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730030,China;5 The Second Clinical Medical School,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China Abstract：Objective The mechanism of copper death has attracted much attention in recent years,but its mechanism of action in endometrial cancer is still unclear.This paper explored the prognostic and application value of copper death-related genes in endometrial cancer.Methods Raw data were acquired using TCGA database;the limma package was used to identify differentially expressed genes between cancerous and nor-文章编号：1000-2812(2023)06-0055-07第49卷 第6期2023年6月兰州大学学报（医 学 版）Journal of Lanzhou University（Medical Sciences）Vol.49 No.6June.2023子宫内膜癌是女性第六大最常见的癌症，2020年全球新增病例417 000例，死亡病例97 000例1-2，严重威胁女性生命健康3。子宫内膜癌是一种免疫原性癌症，具有独特的分子亚型，与不同的免疫浸润有关4。由于子宫内膜癌患者对治疗的反应存在显著的异质性，转移和复发的患者治疗效果不佳，预后也无显著改善5。子宫内膜癌与多种因素相关，如年龄、体质量指数（body mass index，BMI）、生活方式、遗传因素等6。近年来提出的子宫内膜癌的分子分型，在提高患者预后和癌症治疗中至关重要。但很少有令人满意的生物标志物或方法可以准确预测子宫内膜癌患者的预后。铜死亡是近年研究的热点，它通过铜与线粒体代谢的关键蛋白酯化蛋白结合，或干扰代谢酶铁硫簇的表达，使细胞进入一种应激状态而导致细胞死亡7。研究8发现，铜在人类肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用，而且铜可以通过充当酶功能的正、负变构调节剂影响细胞代谢过程。研究9发现，子宫内膜癌患者体内血清铜水平发生了变化，并与子宫肌层浸润深度相关。以往研究10-11也发现铜死亡相关基因的抑制剂和调节剂能作为癌症治疗的潜在方法。因此铜离子载体有望成为一种新的抗癌药物12。CDKN2A是一种肿瘤抑制因子，通常抑制肿瘤的发生发展，以负调节G1/S细胞周期进程，但在子宫内膜癌中处于过表达状态，CDKN2A已被证明与不良预后显著相关13。然而，铜死亡基因在子宫内膜癌预后中的作用尚不清楚。因此本研究针对542名子宫内膜癌患者，利用在生物信息数据库筛选出的与铜死亡相关的10个基因对子宫内膜癌的亚型重分类，分析2个亚型与富集的信号通路、总生存期（overall survival，OS）、临床特征和免疫浸润的相关性，鉴定与预后相关的关键基因，以期明确子宫内膜癌的预后及应用价值。1材料和方法材料和方法1.1 数据集的来源和处理2022 年 3 月 27 日在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https:/Por-tal.gdc.cancer.gov/repository）14获取 542 例子宫内膜癌患者的原始数据和临床数据，包括年龄、分级、分期、生存时间、生存状态（表1）。1.2 铜死亡基因的鉴定有 研 究15已 确 定 10 个 基 因（FDX1，LIAS，LIPT1，DLD，DLAT，PDHA1，PDHB，MTF1，GLS 和 CDKN2A）与铜死亡的发生和发展密切相关。因 此，本 文 选 择 这 10 个 基 因，利 用“limma”软件包鉴定癌组织和正常组织之间的差异表达基因，“pheatmap”软件包绘制热图展示 10 个差异表达基因，共表达网络分析与铜死亡基因之间的相关性。1.3 一致性聚类为了研究子宫内膜癌患者铜死亡基因的生物mal tissues.Endometrial cancer cases were divided into two subgroups using the ConsensusClusterPlus package;correlations between differential genes and clinical characteristics were analyzed using ggplot2,and finally,copper death genes associated with prognosis in endometrial cancer patients were identified by Cox analysis.Overall,endometrial cancer subtypes(C1 and C2)were identified based on copper death genes,and the correlation between the two subtypes and enriched signaling pathways,overall survival(OS),clinical features,and immune infiltration were all analyzed.Results Screened were 6 out of 10 copper death genes differentially expressed in endometrial cancer tissues and normal paracancerous tissues.Functional enrich-ment analysis showed that C1 activated cancer-related signaling pathways and C2 activated cancer-inhibiting-related signaling pathways,with statistically significant differences(P 0.05).Overall survival(OS)analysis showed a statistically significant difference in superior OS in C1 compared to C2(P 0.001).Clinical charac-teristics,including pathological grading,staging and age,were significantly different between the two groups in both subtypes(P 0.05).Conclusion Based on copper death genes,subtypes of endometrial cancer were identified,and analysis identified PDHA1,GLS and CDKN2A as genes associated with prognosis of endome-trial cancer.Keywords:copper death;endometrial cancer;prognostic;bioinformatics第49卷兰州大学学报（医 学 版）56第6期张亚萍，等：铜死亡基因在子宫内膜癌中的预后意义学特性，使用“ConsensusClusterPlus”将子宫内膜癌病例分为2个亚组。聚类和临床特征的相关性通过卡方检验和 R 语言包分析。通过软件“survival”和“survminer”呈现分型之间的生存分析。使用“ggplot2”分析分型间差异基因与临床特征间的相关性，并用“pheatmap”绘制热图。1.4 功能富集分析GSVA富集分析用于2个聚类显著富集的通路。1.5 筛选预后相关基因通过环氧合酶（cyclooxygenase，Cox）分析确定与子宫内膜癌患者预后相关的铜死亡基因。“forestplot”软件绘制森林图，用于显示每个预后相关基因的 P 值、风险比（hazard rate，HR）和95%置信区间（confidence interval，CI）。1.6 统计分析所有统计分析均在 R 软件（v4.1.1）进行；两亚型（C1和 C2）间的基因表达水平和免疫细胞浸润差异采用箱图描述并采用两独立样本秩和检验；采用功能富集分析方法绘制两亚型 OS的生存曲线并采用 Cox 分析方法对 OS 进行比较，P 0.05 表示差异有统计学意义。2结果结果2.1 铜死亡基因在子宫内膜癌中表达比较子宫内膜癌组织与正常组织中10个铜死亡基因的表达水平，共鉴定出6个差异表达基因。分析显示，与正常组织比较，2个基因（PDHA1、CDKN2A）在子宫内膜癌组织中高表达，4个基因（LIAS、LIPT1、MTF1、GLS）在子宫内膜癌组织中低表达（图1A）。共表达网络分析结果显示，铜死亡基因的表达与子宫内膜癌的预后存在正相关性（图1B）。2.2 基于铜死亡基因的子宫内膜癌亚型鉴定和富集分析对542名子宫内膜癌患者进行一致性聚类分析，获得2个亚型：第1组326例（C1）、第2组216例（C2）。在回顾性10年临床随访后，与C2相比，C1的OS更高，差异具有统计学意义（P 0.001）（图2），表明C1的预后较C2好。为探索与正常组织比较，*P 0.05，*P 0.01，*P 45岁不明G1G2G3不明S1S2S3S4存活死亡3 年 3 年 数量/n305235298120 31311 338 51 12429 46181346196比例/%56.2743.360.3718.0822.1457.752.0362.369.4122.885.3585.0614.9463.8436.16表1 纳入的子宫内膜癌患者临床资料572组亚型生物学行为的差异，进行基因集富集分析（图3），结果表明，与C1相比，C2激活了促癌相关通路，如DNA复制、错配修复（mis-match re-pair，MMR）等。MMR是维持基因组稳定性的重要途径。MMR的缺乏或失活导致微卫星不稳定性（microsatellite Instability，MSI），从而触发新抗原的产生并抑制肿瘤生长。相反，C1上调了抑癌相关信号通路，如P53、TGF、FcRI和GnRH信号通路，还富集在氨基酸代谢、聚糖降解、磷脂酰肌图2 亚型间生存分析图3 亚型间富集通路分析醇等信号系统，这与C1有更好的OS结果相一致。2.3 C1和C2的临床特征和免疫细胞浸润2组之间的病理分级、分期、年龄（45或45）在 2 个亚型中存在显著差异（P 0.05，图4），且 C1 的分级与分期级别更低，年龄更小（P 0.001）。此外，铜死亡基因CDKN2A在C2中高表达，差异有统计学意义（P 1 的高风险基因。这表明随着第49卷兰州大学学报（医 学 版）58PDHA1、GLS、CDKN2A基因表达的增加，患子宫内膜癌的风险越大，患者的预后越差（图6）。3讨论与展望讨论与展望子宫内膜癌是威胁女性最常见的妇科恶性肿瘤，发病率逐年增高。目前子宫内膜癌的主要治疗方式是手术治疗16。子宫内膜癌可分为 4种分子亚型，包括具有极点突变的超突变病例和25%30%的微卫星不稳定性表型伴错配修复缺陷17。由于子宫内膜癌患者对治疗的反应存在显著的异质性，转移和复发的患者治疗效果仍不佳5。因此，临床上迫切需要提高患者疗效及预后。本研究为子宫内膜癌的治疗提供了一种新的思路。铜是人体必需的营养素，过量或缺乏会导致细胞功能受损并最终导致细胞死亡。不平衡的铜稳态会影响肿瘤的生长，造成不可逆转的损害。铜可以通过各种机制（包括活性氧积累、蛋白酶体抑制和抗血管生成）诱导多种形式的细胞死亡，包括细胞凋亡和自噬18。因此，体内铜的改变引起了极大的关注，并成为肿瘤治疗领域的研究热*表示2个亚型之间差异具有统计学意义（P 0.001）。图4 亚型间临床特征相关性分析 图5 亚型间免疫细胞浸润差异2个亚型间，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001。图6 与预后相关铜死亡基因第6期张亚萍，等：铜死亡基因在子宫内膜癌中的预后意义59点。本文通过阐述铜死亡基因与子宫内膜癌之间的关系能反映出铜死亡基因在人体内的表达与子宫内膜癌密切相关。目前基于基因表达的子宫内膜癌的分子分型，已在临床发挥重大的指导价值19。同样，本研究依据铜死亡基因，将子宫内膜癌患者进行一致性聚类，分为C1和C2 2个亚型。在临床特征相关性分析中，与C2相比，C1的分级与分期级别更低、年龄更小。另外，本研究发现与 C2相比，C1 的总生存期更高。随后应用 Cox 回归方法，筛选出3个子宫内膜癌中预后相关的铜死亡基因（PDHA1、GLS 和 CDKN2A），表示随着基因表达增加，患子宫内膜癌的风险增加。这些发现证实了铜死亡与子宫内膜癌之间的密切联系，表明基于铜死亡基因的子宫内膜癌再分类有望转化为临床应用。虽然在本文中分析出3个铜死亡基因与子宫内膜癌的预后密切相关，但是铜死亡基因与子宫内膜癌之间的作用机制值得进一步研究。富集分析结果显示C1和C2在富集的通路中存在差异，C1富集在抑癌通路，如DNA复制与错配修复。研究20发现在所有肿瘤类型中，子宫内膜癌错配修复缺陷/微卫星不稳定状态的发生率最高。错配修复系统检测DNA复制过程中出现的碱基对和DNA链错位，通过切除和重新合成，提高复制的保真度21。另外错配修复途径可阻止全基因组微卫星不稳定性，但新出现的证据表明，一些错配修复因子直接参与产生重复扩增疾病的发生22。研究23发现 DNA MMR基因突变可促使癌症发生并促进肿瘤发展。微卫星不稳定状态的主要原因是修复不匹配碱基的 DNA MMR 基因缺陷20。微卫星不稳定性已成为免疫治疗策略中敏感度较高的重要预测指标24，免疫检查点抑制剂可用于错配修复缺失的肿瘤25。因此可以将免疫检查点抑制剂的疗法应用于子宫内膜癌的治疗当中。免疫浸润分析表明，C1和C2的免疫微环境存在差异，C1存在更大的免疫细胞浸润，与较高的存活率密切相关。此外有研究发现微卫星不稳定性会增加免疫细胞浸润，微卫星不稳定的遗传或散发起源会影响免疫反应26。肿瘤微环境在癌症发展中起着重要作用，可能是治疗靶点以及癌症发展的调节剂27-31。因此在子宫内膜癌中铜死亡联合免疫治疗在改善患者预后方面是一个有前景的治疗方向。虽然本研究得出一些相关性结论，但仍存在一些局限性。首先从机制方面，铜死亡基因在子宫内膜癌中的作用机制尚未阐明，需要进一步研究。其次对于 2个亚型与富集的信号通路、OS、临床特征和免疫浸润的相关性的分析仅得出初步结论，未能进行具体的细胞学或组织学验证，因此具体能否应用于临床还需通过体内外试验进一步论证。4结论结论综上所述，本研究揭示了铜死亡相关基因在子宫内膜癌中的作用，表明铜死亡基因参与了关键信号通路，在子宫内膜癌的发生发展、免疫浸润、预后中发挥重要作用。但在未来，还需进一步的体内及体外研究来验证这些结果。参 考 文 献1 Siegel RL,Miller KD,Fuchs HE,et al.Cancer 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