敲除tp53对斑马鱼高温耐受能力和运动能力的影响.pdf
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1、生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 580 587Current Biotechnology ISSN 20952341研究论文研究论文Articles敲除tp53对斑马鱼高温耐受能力和运动能力的影响杨倩婷,田晓英,张俊芳,韩兵社*上海海洋大学水产与生命学院,水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306摘 要:研究了敲除tp53基因对斑马鱼高温耐受能力和运动能力的影响。通过RT-qPCR、Western blot等技术发现高温下野生型的斑马鱼tp53表达上调,暗示tp53可能在高温下发挥作用,而敲除tp53基因的斑马鱼
2、在高温下的存活时间降低。进一步研究发现,tp53-/-斑马鱼在高温下ROS水平升高(P0.05),ATP水平降低(P0.001),H2A.X蛋白水平显著升高。通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色发现tp53-/-斑马鱼高温下肝脏组织充血更严重。Danio Vision斑马鱼行为轨迹分析显示34 下tp53-/-斑马鱼的运动能力减弱。研究结果表明,tp53在高温下对斑马鱼的高温耐受能力和运动能力起正向调节作用,为斑马鱼高温耐受机制和运动行为学研究提供了新思路。关键词:斑马鱼;高温;tp53;运动能力;肝DOI:10.19586/j.20952341.2023.0039
3、 中图分类号:Q958.8 文献标志码:AEffect of tp53 Knockout on High Temperature Tolerance and Swimming Capacity in ZebrafishYANG Qianting,TIAN Xiaoying,ZHANG Junfang,HAN Bingshe*National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education,Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genet
4、ic Resources,Ministry of Education,College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China Abstract:The aim of the study was to investigate the effect of tp53 knockout on high temperature tolerance and swimming capacity in zebrafish.Through RT-qPCR,Western blot and othe
5、r technologies,it was found that the expression of tp53 in wild-type zebrafish at high temperature was upregulated,suggesting that tp53 may play a role at high temperature,while zebrafish with the tp53 gene knockout had a reduced survival time at high temperature.Further studies found that tp53-/-ze
6、brafish had increased ROS levels(P0.05),decreased ATP levels(P0.05水平上差异无统计学意义;*表示在P0.05水平上差异具有统计学意义;*表示在P0.01水平上差异具有统计学意义;*表示在P0.05),*表示差异在P0.05)。在43 下,tp53-/-斑马鱼的ROS水平明显高于WT斑马鱼(P0.05),ATP 水平显著低于 WT 斑马鱼的ATP水平(图4B)。为检测43 高温对WT与tp53-/-斑马鱼在蛋白水平的DNA损伤,H2A.X作为DNA损伤的标记物,其表达变化可以用来说明DNA损伤水平。取斑马鱼全鱼,使用Western
7、 blot检测 H2A.X 蛋白的表达。结果表明,在 28,WT与tp53-/-斑马鱼的H2A.X蛋白表达水平无明显差异;在43 高温下,tp53-/-斑马鱼的H2A.X蛋白表达水平显著高于 WT 斑马鱼(图 4CD)。上述结果说明,高温环境下敲除tp53的斑马鱼损伤更加严重。2.4高温对斑马鱼肝组织的影响为检测高温对于斑马鱼组织的影响,我们分别取28 和43 处理2 h的WT和tp53-/-斑马鱼的脑、肝、眼和心脏,进行HE染色,结果(图5)显示,28 下,WT斑马鱼与tp53-/-斑马鱼的肝脏之间没有显著差异;高温处理下,WT和tp53-/-斑马鱼肝脏均出现充血状态,肝细胞变形且形状不规则
8、,细胞之间的接触变得松散,细胞质丢失,但是与WT斑马鱼相比,tp53-/-斑马鱼的肝脏组织充血现象更严重(图 5D)。然而,在 WT和 tp53-/-斑马鱼的其他组织中没有发现明显差异。2.5敲除tp53基因对高温下斑马鱼运动能力的影响为探究敲除tp53基因是否会影响高温下斑马鱼的运动能力,本研究利用斑马鱼行为轨迹分析系统在34 对1月龄WT和tp53-/-斑马鱼进行运动行为学监测,生成了斑马鱼的运动轨迹图(图6A)和热图(图6B)。对斑马鱼的移动距离(图6C)、平均速度(图6D)、最大加速度(图6E)和活跃度(图6F)进行统计学分析,发现在28 条件下,tp53-/-斑马鱼的移动距离、平均速
9、度、活跃度和最大加速度与WT 斑马鱼相比没有显著差异;在 34 条件下,tp53-/-斑马鱼的各指标显著降低,这说明tp53敲除后,斑马鱼在高温下的运动能力降低。A:28 和43 的ROS水平;B:28 和43 的ATP水平;C:28 和43 的DNA损伤水平;D:蛋白条带灰度值处理(H2A.X/-actin)。ns表示差异无统计学意义,*、*、*分别表示差异在P0.05、P0.01、P0.001水平具有统计学意义。图4高温对不同基因型斑马鱼的影响Fig.4Effects of high temperature on zebrafish of different genotypes584杨倩婷
10、,等:敲除tp53对斑马鱼高温耐受能力和运动能力的影响A:脑;B:眼睛;C:心脏;D:肝脏;黑色箭头指向充血部位。图5WT和tp53-/-斑马鱼不同组织的HE染色Fig.5HE staining of different tissues in WT and tp53-/-zebrafish585生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology3讨论tp53可被辐射、DNA损伤剂、温度、低pH等因素激活,从而对下游靶基因进行调控13。本研究发现tp53在高温下被激活,且敲除tp53可以降低斑马鱼的存活时间和运动能力,导致肝脏严重受损。在结肠癌细胞和斑马鱼胚胎中发现40 高温压
11、力下,tp53会通过激活HSP90的表达促进细胞存活,但是在43 下tp53会激活细胞凋亡进而促进细胞的死亡14。此外,温度处理方式也会影响鱼类的温度耐受能力。适度的高温驯化会增加鱼类的抗热能力,改善微生物的群落结构15。研究发现,Hela细胞在获得高温耐受性后可以提高抗凋亡蛋白的表达,进而保护由过氧化物引起的细胞凋亡16。在仓鼠卵巢癌细胞和人宫颈癌细胞中也发现40 预处理3 h后,可抵抗随后在43 下的致死性热休克17。本研究中,高温下tp53可能是通过激活热休克蛋白的表达,从而提高斑马鱼的高温耐受能力。43 下,与 WT 斑马鱼相比,tp53-/-斑马鱼ROS水平显著升高,ATP水平显著降
12、低,H2A.X蛋白水平显著升高,说明tp53参与了DNA损伤修复的相关通路。活性氧的不断积累会导致生物机体的衰老,机体的抗氧化能力和不断产生的氧自由基之间的动态平衡一旦被打破,就会引起组织损伤18。还有研究提示,ROS 的积聚引起氧化应激,导致线粒体中 ATP水平下降,对细胞结构产生损伤19。tp53 通过上调抗氧化基因使细胞降低 ROS 的氧化,进而对细胞起到保护作用20。例如,在 tp53 基因敲除小鼠的脾细胞和胸腺细胞中观察到了 tp53 缺失的细胞中 ROS水平持续增加,促进了氧化作用19。当刺激因素引起DNA损伤时,P53蛋白会被迅速活化并且聚集,阻滞细胞周期并修复受损 DNA21-
13、24。因此,可能是由于 ROS 水平升高导致 ATP 合成能力降低,DNA 损伤增加使得敲除 tp53 斑马鱼存活时间降低。本研究对高温下斑马鱼脑、心脏、眼和肝组织进行HE染色,发现tp53-/-斑马鱼肝脏充血现象更加严重,其余组织在高温下并没有观察到显著差异。温度升高会增加肝脏负荷,严重时会造成肝损伤25。有研究显示,斑马鱼胚胎在辐射下会引起tp53在肝脏的积聚26。但是高温下关于tp53与肝脏的研究还未见报道,所以高温导致 tp53-/-斑马鱼肝脏充血现象严重的具体机制还需要进一步研究。高温下,敲除tp53基因后斑马鱼的移动距离、平均速度、加速度以及活跃性显著降低,这说明tp53的缺失影响
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