毕业设计开题报告-活性污泥中反硝化菌的分离与鉴定.doc

毕业设计（论文）开题报告

课 题 名 称：活性污泥中反硝化菌的分离与鉴定

课题
名称
活性污泥中反硝化菌的分离与鉴定
课题来源
教师科研
课题类型
应用（实验）研究类
选题的背景及意义
随着工业的发展和人民生活水平的不断提高，工业废水和城市污水中氨氮化合物的含量急剧上升，废水中的氨氮排入水体，容易引起水中藻类及其他微生物的大量繁殖，形成富营养化污染，这不仅会使自来水厂处理厂运行困难，造成饮用水的异味，而且严重时会使水中溶解氧下降，鱼类大量死亡，甚至导致湖泊的干涸灭亡，因此废水的氮处理成为研究热点之一。
目前较为普遍的脱氮方式为活性污泥法，一般把经过驯化的活性污泥进行固定，而采用单一菌种用于水处理的例子不是很多，活性污泥固定的优点在于活性污泥中各个菌种是互生的关系，食物链较长，可以更为高效的处理污水，但相对于污水来说，成分较为简单的污水可以采用纯菌进行处理。固定化微生物技术目前已成为生物工程领域的重要分支，由于该技术所具有的细胞浓度高，反应速度快，便于连续化和自动化控制，易于管理等突出优点。
但由于活性污泥法脱氮的主体——硝化菌生长缓慢，为避免其流失，取得较好的脱氮效果，往往要求污泥在反应器中停留很长时间，即需要很大的爆气池，从而限制了活性污泥系统的处理能力。为了达到新的排放标准，必须对原有的爆气池进行扩建，但由于空间的限制，扩建活性污泥处理系统往往十分困难，甚至不可能。因此一种新的废水生物脱氮技术，势在必行。生物脱氮法主要有传统硝化反硝化，短程硝化反硝化，同时硝化反硝化，厌氧氨氧化。
反硝化菌广泛存在于水中，尤其是在沉积物中，菌落特征：圆形，白色，表面有光泽，边缘整齐，在显微镜下为棒形。为革兰氏阳性菌。它们能将环境中的硝酸盐变成氨和氮。如Pseudomonasazotgena和perfectomarinus等可能将硝酸盐还原成游离氮。因此，水中反硝化菌参与了氮的循环作用，控制着浮游植物的大量生长鉴定反硝化菌的方法有生化法和分子生物学法。
（一）生化法：
1．革兰氏染色法：革兰氏染色阳性细菌染色结果为深紫色，革兰氏染色阴性细菌染色结果为红色。按操作要求配制结晶紫混合液，碘液，脱色液，挑取反硝化菌种进行染色后观察。
2．鞭毛染色：镜检时反硝化菌体为深褐色，鞭毛为褐色。配制好甲乙液，备好玻片，取接种后16~24小时的菌种染色观察。
3．半固体琼脂穿刺法：根据有鞭毛的细菌可以在半固体培养基中游走却又不能任意游走的现象，观察细菌的生长状况，判定试验菌是否具有运动性。用直针穿刺接种试验菌于半固体培养基内适温培养。如生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性；如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示试验菌有运动性。

4．甲基红试验：接种试验菌于指定培养液中，每次两个重复，置室温培养2~6天。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应。（因甲基红变色范围是4.4红至6.0黄）
5．V-P测定：取培养液和40%氢氧化钠等量相混。加少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为试验菌阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。
6．反硝化：配制反硝化培养基，接种反硝化菌种，封管后与不含硝酸钾的培养基做对照。
培养1~7天，观察含有硝酸钾的培养基中有无生长和是否产生气泡，如产生气泡表示有反硝化作用产生氨气，是阳性反应，但如不含硝酸钾的对照培养基也产生气泡表示有反硝化作用产生气泡，则按阴性反应处理，不产则为阳性。
7．显色培养：设计培养基中含有唯一氮源硝酸钾和酸碱指示剂溴百里酚，此指示剂的变色点是7.6。当反硝化菌作用时，ph升高，使最初ph值为7.0的培养基达到变色点7.6，从而使培养基的颜色由绿色变成蓝色，指示硝酸盐浓度降低。
(二)分子生物学法
现代分子生物学技术的迅速发展及其在各学科领域的广泛应用，为融合子在分子水平上的鉴定提供了科学依据。分子生物学方法较普通鉴定法更加科学准确，也更加令人信服。反硝化的鉴定采用：PCR法和DNA探针法。

研究内容拟解决的主要问题
一、研究内容
1、反硝化菌种的分离培养
2、反硝化菌种鉴定。
3、反硝化DNA的检测。
4、反硝化菌DNA进行PCR扩增。
5、亚硝化菌种DNA的PCR扩增产物进行测序。
二、拟要解决的问题
1、反硝化菌种分离培养方法。
2、反硝化菌种DNA的提取与检测方法。
3、反硝化菌DNA的电泳分离及检测。
4、反硝化菌种PCR扩增技术。
（2）反硝化提DNA的提取。

研究方法技术路线
研究方法：
一、灵芝原生质体的制备与分离
将灵芝菌种在PDA培养基中活化。活化的灵芝菌种在3%黄豆粉培养基于27℃、120rpm恒温摇床上培养4d。过滤收集菌丝球，无菌水冲洗2次→稳渗剂甘露醇冲洗2次→菌丝体转入0.2%巯基乙醇中→摇床30min，温度28℃→过滤收集菌丝体，甘露醇冲洗→菌丝球1500rpm离心10min，弃上清液取沉淀→1g菌丝体以1：10比例加入复合酶液（蜗牛酶：纤维素酶：溶壁酶=1%：1%：1%）。31℃酶解2.5h→过滤，滤液离心500rpm，5min2次，上清液3000rpm离心10min，沉淀即为原生质体→稳渗剂冲洗2次，稀释后用血球计数板计数。
二、原生质体融合
将原生质体用稳渗剂将浓度调至107mol/ml，置于无菌带塞的离心管内，以2000-4000rmp离心→沉淀加入1ml 50mmol/LCaCl2配制的30%PEG，28℃30min→加入数毫升稳渗剂甘露醇，离心5000rmp弃上清液反复2次，用 0.16 mol /L甘露醇离心洗涤 2次→调原生质体浓度为107 mol /ml，取0.1ml涂于高渗的融合再生培养基及低渗再生培养基中，24℃下培养4d。
三、生化检测
1、融合子酯酶同功酶检测
（1）酶液提取。
将菌种接入斜面培养基，在25℃下培养7天。取不同菌株的菌丝各1g，加入2ml 0.1M TBE（Tris-H3BO4-EDTA）浸提液，在4℃下冷却24h，然后研磨成匀浆，4000rpm离心20min，取上清液置于冰箱保存备用。
（2）电泳及染色。
用垂直板凝胶电泳法。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为40%，点样量75ul，电泳槽缓冲液为Tris-甘氨酸（pH8.3），稳定电压300V，电泳3h，用醋酸-a-萘酯和坚牢兰于25-30℃下染色20min，清水漂洗数次，绘图，然后用薄层扫描仪在550nm波长下对电泳图谱进行扫描。
2、融合子DNA检测
（1）DNA的提取（CT AB法）。
用灭菌的解剖刀将菌丝体从培养基上刮取0.5g菌丝体，放入事先冷却的无菌研钵中，加液氮充分研成粉末，转入1.5mL eppendorf离心管中。
1)加 65℃ 预热 CTAB高盐提取液和50μL1%β-巯基乙醇，充分混匀后65℃恒温30～60min，期间颠倒混匀几次。
2) 12 000 r/min离心 2min去沉淀，取上清液700μL，转入1.5mL eppendorf离心管中，冷却后加入 500μL的饱和酚，轻微倒转离心管数次后静置3～4min，加入300μL的氯仿/异戊醇（24∶1），缓慢倒转离心管使溶液成为乳状并静置3～4min。
3) 12 000 r/min离心10min，将上清液再转入另一个离心管中，去蛋白沉淀。移取700μL上清液，加入300μL的饱和酚，轻微混匀静置后再加入500μL的氯仿/异戊醇（24∶1），在12 000 r/min离心10min。
4）移取750μL的上清液转入另外一个离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），12 000 r/ min离心 10min。
5)移取 500 μL的上清液，加入1000μL的-20℃ 预冷的无水乙醇，于-20℃ 放置几分钟至1h（视量多少而定），用无菌移液枪的枪头或者是离心方法取出 DNA沉淀，75%乙醇冲洗 3～4次，吸取多余的乙醇，放置在 40℃的电热鼓风干燥箱中烘干 6～8h或过夜或在旋转真空抽干机中干燥5～10min，直到

其中的DNA彻底烘干，然后加适量保存缓冲液 (TE)，4℃ 保存待用。
（2）DNA琼脂糖凝胶电泳。
1%的琼脂糖凝胶，0.5 ×TBE为电泳缓冲液，上样3μL 80V电压下电泳1h检测DNA样品纯度。
技术路线：
取1ml反硝化菌液于1.5ml离心管

10000r，离心1min
弃上清,10000r,离心3min

弃上清,10000r,离心3min

弃上清，加1ml 0.9%Nacl

10000r，离心3min

弃上清,加450ulTE缓冲液, 重
悬浮,加50ul20%SDS，混匀

75℃水浴5min，
到菌液裂解变清

加500ul 3:1酚:氯仿，轻轻混匀

10000r，离心5min

吸取上清于新1.5ul离心管，补足体积500ul 3:1酚:氯仿，轻轻混匀

10000r，离心5min

重复提取，直到看不见中间的蛋白质层

吸取上清于新1.5ul离心管，补体积到500ul加500ul氯仿，轻轻混匀

10000r，离心5min

吸取上清于新1.5ul离心管，加1/10 3mol/LNaAc,加等体积异丙醇, 上下颠倒

10000r,离心5min

10000r,离心5min

吸出上清，加1ml 70℅乙醇清洗沉淀

去上清，室温干燥

加50ul无菌水溶解沉淀，4℃保存

(2) 反硝化菌DNA电泳
琼脂糖凝胶电泳法:
糖胶1.5%,点样量5ul，电泳槽缓冲液为1×TAE缓冲液（pH8.0），稳定电压80V，电泳1h，检测DNA样品纯度，然后用薄层扫描仪在550nm波长下对电泳图谱进行扫描。

2.

16SrDNA的PCR扩增和测序
在硝酸盐无机盐培养基平板上培养48小时，挑取单菌落eppendorf管中，加入100ml重蒸水，旋涡混匀后，沸水浴2min，12000r/min5min，上清液直接作为DNA摸板用于PCR扩增。用于16SrDNA的PCR反应的引物为一对通用引物正向引物BSF8/20：5’—AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG—3’（Escherichracoli的16SrDNA对应位置为8—27）；反向引物为BSR1541/20：5’–AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA–3’ （Escherichracoli的16SrDNA对应位置为1541—1522），PCR反应体系（50ul）为10×Taq聚合酶缓冲液5ul，氯化镁（25mmol）4ul，DNTP（5mmol）3ul，引物BSF8/20和BSR1541/20各1ul，模板DNA2ul，Taq酶（100094℃1min，U/L）0.5ul，重蒸水33.5ul。PCR程序如下：94℃预变性2min，55℃1min，72℃1min；第二步循环30次，72℃10min；4℃放置。PCR产物用QIAgene公司的DNA纯化试剂盒纯化。测序由上海申友生物有限责任公司完成，测序用引物为引物BSF8/20。

研究的总体安排和进度计划
一、总体安排
第一学期：实验初期准备
完成开题报告
第二学期：实验
完成论文

二、进度计划

2010-2011学年度第二学期
第1-2周：进行课题资料搜集、整理，对实验可行性进行分析，完成开题报告。购买相关试剂并在食品化学实验室培养灵芝菌种。
第3-6周：制备灵芝原生质体，并进行原生质体融合。
第7-12周：灵芝原生质体融合子的生化检测。
第13-14周：进行数据整理，完成毕业论文写作。

主要参考
文献
[1] 曹国民，赵庆祥，龚剑丽，张彤.固定化微生物在好氧条件下同时硝化和反硝化[J].环境工程，2000.10，第18卷第5期.
[2] 吕乐，闫海，杜静，毛丽娜，周稳.厌氧氨氧化反应器中微生物菌种的筛选及活性研究[J].医学动物防制，2009.2，第25卷第2期.
[3] 金赞芳，李文腾，潘志彦，陈英旭，等.一株反硝化的分离鉴定和系统发育分析[J].环境科学与技术，2006,7（7）：37-38.
[4] SynC.K.C，SwarupS.A scalable protocol for the isolation of large-sized genomic DNA within an hour from several bacteria.Anal Biochem，2000，278：82-91.
[5] 王琳，李季.集约化蔬菜种植区地下水中反硝化细菌的分离鉴定[J].生态环境，2008，17（5）：2078-2081.

指导教师
意 见

指导教师签名：
年 月 日
教研室意见
学院意见

教研室主任签名：
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教学院长签名：
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