石菖蒲抑菌物质的提取工艺及协同抑菌活性研究.pdf
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1、第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.4Aug.2023石菖蒲抑菌物质的提取工艺及协同抑菌活性研究贺富胤1,石浩1,李凤华2,王仁才1*(1.湖南农业大学园艺学院,长沙 410128;2.河南农业大学园艺学院,郑州 450002)摘要:【目的】为了减少猕猴桃溃疡病植物源抗菌药剂的原材料的生产成本,使中药材的利用率最大化,并开发适合针对猕猴桃溃疡病菌的植物源复配抑菌剂。【方法】通过测量不同提取条件下的石菖蒲提取物对猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径,得到石菖蒲的较佳提取工艺,并用
2、响应面分析法筛选出石菖蒲、黄芩、丁香、广藿香、大蒜和牡丹6种中药材组成的最佳复配物。【结果】石菖蒲提取物的较佳工艺条件为:乙醇浓度81.171%、提取温度54.730、料液比1 25、提取温度50、超声功率700 W,此条件下的抑菌圈直径可达27.81 mm,复配抑菌剂的最佳配方工艺为:黄芩 石菖蒲 大蒜 广藿香 牡丹 丁香=182.310 306.104 521.432 453.106 153.199 362.565,在此条件下,1.0 g/mL的复配物实际试验测得的抑制圈直径可达33.860 mm。【结论】确定了石菖蒲提取物对猕猴桃溃疡病菌产生抑菌作用的较佳提取工艺,且同条件下,复配物有更
3、强的抑菌作用。关键词:猕猴桃溃疡病;石菖蒲提取物;提取工艺;复配物;抑菌中图分类号:S567.9;S482.2+92 文献标志码:A 文章编号:1000-2650(2023)04-0640-10Study on Extraction Technology and Synergistic Antibacterial Activity of Antifungal Substances from Acorus tatarinowiiHE Fuyin1,SHI Hao1,LI Fenghua2,WANG Rencai1*(1.The Hunan Agricultural University,Coll
4、ege of Horticulture,Changsha 410128,China;2.Henan Agricultural University,College of Horticulture,Zhengzhou 450002,China)Abstract:【Objective】In order to reduce the production cost of plant-derived antibacterial agents for kiwifruit ulcer disease,maximize the utilization rate of Chinese medicinal mat
5、erials,and develop plant-derived compound antibacterial agents suitable for kiwifruit ulcer disease.【Method】By measuring the diameters of the inhibition zone of Acorus tatarinowii extract under different extraction conditions against Pseudomonas syringae,the better extraction technology of Acorus ta
6、tarinowii was obtained.The optimal compound of Acorus tatarinowii,Scutellaria baicalensis,Syzygium aromaticum,Pogostemon cablin,Allium sativum and paeonia suffruticosa was screened by response surface analysis(RSM).【Result】The better technological conditions of Acorus tatarinowii extract were as fol
7、lows:ethanol concentration of 81.171%,extraction temperature of 54.730,solid-liquid ratio of 125,extraction temperature of 50,ultrasonic power of 700 W.Under these conditions,the diameter of the inhibition zone could reach 27.81 mm.The optimum formula of compound antibacterial agent was:Scutellaria
8、baicalensisScutellaria baicalensisAllium sativumPogostemon cablinPaeonia suffruticosaSyzygium aromaticum=182.310306.104521.432453.106153.199362.565.Under these conditions,the diameter of inhibition ring measured by the 1.0 g/mL compound could reach 33.860 mm in the actual test.【Conclusion】The optima
9、l extraction process of Acorus tatarinowii extract against kiwifruit ulcer disease was determined,and the compound had stronger antibacterial effect under the same conditions.doi:10.16036/j.issn.1000-2650.202104061收稿日期:2021-12-26基金项目:湖南省科技厅重点研发计划项目(2017NK2071、2018NK2013)。作者简介:贺富胤,硕士研究生,E-mail:。*责任作者
10、:王仁才,教授,主要从事果树栽培生理与技术和果实采后处理与综合利用等研究,E-mail:。第 4 期贺富胤,等:石菖蒲抑菌物质的提取工艺及协同抑菌活性研究Keywords:kiwi canker disease;Acorus tatarinowii extract;extraction process;distribution of content;bacteriostatic猕猴桃溃疡病是猕猴桃生长发育过程中最常见,也是危害最大的病害。较多研究和文献表明丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae,Psa)1-3是引起猕猴桃溃疡病的病原菌
11、。石菖蒲(Acorus tatarinowii),属天南星科、菖蒲属禾草状多年生草本植物,主要含有糖类、醌类、黄酮类、苯丙素类、生物碱类、三萜皂苷类、氨基酸类、挥发油类和有机酸类等多种化学成分4,具有醒神益智、抑菌抗炎、保护心肌细胞、化湿开胃、开窍豁痰、抗氧化和抗抑郁等功效5-6。李娟、邓业成等7-8研究表明,石菖蒲提取物对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、巨大芽孢杆菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌等多种细菌具有很强的抑制作用,笔者在药剂筛选试验中发现其对丁香假单胞杆菌的抑菌圈直径达到22.2 mm,有不错的抑菌效果,因此以石菖蒲为目标药材,以抑菌圈直径为衡量指标,通过对石菖蒲抑菌活性物质的提取工艺
12、研究,以取得有效抑菌物质提取的较好条件,并研究其抑菌稳定性,确定最佳的抑菌环境,确保石菖蒲提取物对丁香假单胞杆菌的最大抑菌率。因为植物源抑菌剂具有环保绿色有机等特点。目前国内对单一的植物源抑菌药剂研究较多,由于复配缺少科学性,因此国内对植物源性复配抑菌剂的研究较少。有研究表明9-10,复配药剂比单一药剂的抑菌活性成分更高,活性物质活跃度更高,成本也更低,因此植物源性复配抑菌剂已成为现在研究的一个热点方向。已有相关报道11-13,果树生产实际中利用到植物源复配物,但有关对猕猴桃溃疡病的复配抑菌剂的研究较少。为研发适用于猕猴桃溃疡病中药植物源抗菌药剂的复配抑菌剂,在对原有的80种中草药对丁香假单胞
13、杆菌的抑菌筛选试验及相关文献的报道中选出6种具有较好抑菌效果的中草药进行复配试验。通过响应面分析法14分析检测多种复配抑菌剂对丁香假单胞杆菌的抑菌效果,得到抑菌效果最好的复配抑菌剂,开发适合针对猕猴桃溃疡病菌的植物源复配抑菌剂。1材料和方法1.1试验材料1.1.1供试植物与菌种石菖蒲、黄芩、丁香、广藿香、大蒜以及牡丹购置于中药药店;丁香假单胞杆菌,于湖南农业大学实验室自行分离纯化鉴定所得。1.1.2试剂与仪器设备试验试剂:蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、丙酮(分析纯)、琼脂粉、氯化钠、氯仿、正丁醇、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氢氧化钠和石油醚,以上均购于北京奥博星生物技术有限责任公司生产。仪器设备:D
14、K-98-IIA电热恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;0.5号麦氏比浊管,北京哲成科技有限公司;TGL-21M高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;AUW220D电子天平,日本 SHIMADZU 公司;GZ-400-GII 恒温光照培养箱,韶关市广智科技设备有限公司;SW-CJ-1F超净工作台,三克仪器有限公司;pH试纸,拓赫机电科技(上海)有限公司;LANYI-XH2L超声循环提取机,上海兰仪实业有限公司;ZW1105051705紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;LDZM-80L-III立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安科技有限公司;DHG-9146A干燥箱,上海申安科技有限公
15、司;SB-3200D超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;SAF-680T酶标仪,上海巴玖实业有限公司。1.2试验方法1.2.1菌液的制备按照平板菌落计数法中的试验过程制备猕猴桃溃疡病病原菌悬浮液。在无菌条件下,用接种环将分离纯化后的病原菌取至装有0.9%氯化钠溶液待测管中,混合摇匀后直至浓度与5109 CFU/mL的细菌比浊管标准管浓度相似,再通过10倍递减稀释和一定比例稀释成1107 CFU/mL菌悬液,储藏备用。从得到的菌液样品中取1 mL菌液至牛肉膏蛋白胨培养基中,在25 的恒温培养箱中培养48 h后,取出计数,根据菌落的数目换算验证菌液的浓度。1.2.2石菖蒲提取的单因素实验测
16、验石菖蒲提取液制备过程中对丁香假单胞杆菌抑菌效果有影响的相关因素:提取溶剂于其浓度、料液比、超声提取的温度、功率和时间。称取制备好的石菖蒲样品粉末 10 g 于100 mL锥形瓶中,加丙酮溶解后封口,放入28,150 r/min的恒温振荡器上混合振荡12 h,振荡后配置料液比为1 20,将其放入40,超声功率为700 W的超声仪中,工作2.0 h后取出,对得到提取液抽641四川农业大学学报第 41 卷 滤,浓缩,丙酮定容,制成 1.0 g/mL 的活性物质提取物。分别以丙酮、水、乙酸乙酯、乙醇、石油醚和氯仿做溶剂,其余条件与一致,通过牛津杯法测定,得到不同提取溶剂下的石菖蒲提取物对丁香假单胞杆
17、菌的抑菌圈直径,选出抑菌效果较好提取溶剂。分别用浓度为40%、60%、70%、80%、90%和100%的较佳提取溶剂乙醇作溶剂,其余条件与一致,通过牛津杯法测定,得到不同浓度乙醇溶剂下的石菖蒲提取物对丁香假单胞杆菌的抑菌圈直径,筛选出乙醇溶剂的较佳浓度。将筛选出的抑菌效果较佳浓度的乙醇与石菖蒲粉末配制成料液比分别为1 15、1 20、1 25、1 30、1 35和1 40的混合溶液,其余条件与一致,通过牛津杯法测定,得到不同料液比情况下的石菖蒲提取物对丁香假单胞杆菌的抑菌圈直径,筛选出合适的料液比。将筛选出的抑菌效果较佳浓度的乙醇作为提取溶剂,在10、20、30、40、50和60 的条件下进行
18、操作,其余条件与一致,通过牛津杯法测定,得到不同提取温度下石菖蒲提取液的抑菌圈直径,筛选出较佳的提取温度。将筛选出的抑菌效果较佳浓度的乙醇作为提取溶剂,在1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和4.0 h条件下进行操作,其余条件与一致,通过牛津杯法测定,得到不同提取时间下石菖蒲提取液的抑菌圈直径,筛选出较佳的提取时间。将筛选出的抑菌效果较佳浓度的乙醇作为提取溶剂,在超声功率为300、400、500、700和1 000 W的条件下进行操作,其余条件与一致,通过牛津杯法测定,得到不同超声功率下石菖蒲提取液的抑菌圈直径,筛选出较佳的提取功率。1.2.3响应曲面实验在上述试验的基础上,进行Box-Be
19、hnken实验(表1),将料液比、提取温度、溶剂浓度作为的3因素3水平,抑菌圈直径(Y)作为衡量指标,以得出石菖蒲提取物的较佳提取工艺条件。1.2.4石菖蒲提取物的稳定性石菖蒲乙醇提取物作药剂。将其放在功率15 W的紫外灯下照射1、5、10、15、20和30 h,并控制空间温度为25 左右,药剂距灯源40 cm处,以防止因为灯光照射放热使得空间温度升高而影响石菖蒲提取物活性,将另一组放置同条件的白炽灯下,相同处理,作为对照,通过牛津杯法测定抑菌圈直径。将6组石菖蒲提取物分别放置于-20、4 以及25 条件下处理24 h,70、80 和100 水浴条件下处理5 h,通过牛津杯法测定抑菌圈直径。将
20、6组石菖蒲提取液的pH分别调至4、5、6、7、9和12,平衡24 h后,通过牛津杯法测定抑菌圈直径。将石菖蒲提取物置于4 和25 下贮存,用牛津杯法,在放置10、30、50、70、90和120 d后取出测定其抑菌圈直径。1.2.5植物提取液的制备将风干后的中草药用50 的烘箱烘干至恒重,再用粉碎机粉碎后过100目筛,得到各中草药粉末样品。取各中草药粉末样品 10 g 分别加入到100 mL三角瓶中,再加入50 mL丙酮溶液,用保鲜膜封口后放在28,150 r/min的恒温振荡器上混合振荡12 h。混合振荡后将其放入条件为40,超声功率为700 W的超声仪中作用30 min,对得到各中草药提取液
21、进行抽滤、浓缩,配成质量浓度为1.0 g/mL的活性物质提取物。把配置好的活性提取物在无菌条件下倒入已灭菌的试管,得到各中草药提取母液,放置于4 冰箱中,保存备用。1.2.6提取物对细菌生长抑制率的影响对中药提取液依次进行稀释,即(二倍稀释法)。将中药提取液倒入小试管中,用丙醇稀释,稀释倍数为1、2、4、8、16、32、64、128、256、512和1 024倍,如此递减稀释成最终浓度为 1 000、500、250、表1Box-Behnken响应曲面设计实验因素水平和编码Table 1Response surface experimental design test factor levels
22、 and code of Box-Behnken编码Code10-1料液比AMaterial liquid ratio/(gmL-1)1 201 301 40提取温度BExtraction temperature/405060乙醇浓度CEthanol concentration/%708090642第 4 期贺富胤,等:石菖蒲抑菌物质的提取工艺及协同抑菌活性研究125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.90、1.95和0.98 mg/mL的溶液,编号备用。把制备好的菌液倒入96微孔板中,每个孔倒入 100 L,再向其加入制备好的100 L中药提取液,充分混合后置于25 微孔板振荡
23、器中培养12 h,使用酶标仪测定600 nm波长处的吸光度值,再根据公式计算15其抑菌率。再利用SPSS软件对抑菌率半抑制浓度IC50进行计算。抑菌率=ODR-ODODR-ODB 100%式中:ODR表示菌液对照孔的吸光值,微孔内装有无菌的 LB 液体培养基和植物提取液的混合液;ODB表示空白对照孔的吸光值,微孔内仅装有无菌的lb液体培养基;OD表示样品测定口孔的吸光值。1.2.7中药材复配比响应曲面实验设计为了找出中药提取液中对丁香假单胞杆菌抑菌效果最好的各个因素的最佳组合,用较少的时间和试验数量来得到多因素水平的最佳组合,设计了响应曲面实验(表2),选择了6个因素的3个水平,分别为0.5倍
24、IC50,1.0倍IC50,2.0倍IC50,以抑菌圈直径(Y)为参考指标,进行Box-Behnken实验设计,找到提取物最佳抑菌配方比。1.2.8最佳复配物抑菌试验通过所得最佳复配物,将其浓度稀释成最终浓度为1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 g/mL,再进行抑菌试验,试验方法同上。1.2.9数据处理试验数据的处理分别采用SPSS 18.0、WPS office 2019、Design Expert 10.0等软件进行统计分析及图形制作。其中a=0.01表示极显著性水平,P0.05 为有统计学差异,P0.01 为有显著统计学差异,P0.001为有极其显著的统计学差异。2结果与分析2.1各
25、提取单因素对石菖蒲提取物抑菌效果的影响通过对石菖蒲提取的单因素实验分析(表3),当以乙醇作为提取溶剂时,抑菌圈直径最大,并且比丙酮和氯仿便宜,也相对环保一些。当用浓度为20%60%和95%100%乙醇做溶剂时,石菖蒲提取物的抑菌效果非常低,其抑菌圈直径均低于20 mm。而当乙醇体积分数在70%90%时,有明显的抑菌效果。料液比在1 30时,当提取温度为50 时,提取物的抑菌效果较好。提取物的抑菌效果与提取时间和超声功率有密切关系,其抑菌效果随两者的增加而变大,但当提取时间2 h后和超声功率大于700 W后,抑菌圈直径的大小并没有明显提升,有效成分的溶出量无明显变化。2.2提取工艺响应面回归模型
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- 石菖蒲 物质 提取 工艺 协同 活性 研究
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