山楂叶总黄酮对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠体内抗氧化酶活性及相关基因表达的影响.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1314-1321山楂叶总黄酮对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠体内抗氧化酶活性及相关基因表达的影响陈薇伊,徐兴军*,刘佳人,张伟伟,杨齐齐哈尔大学生命科学与农林学院抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室寒区麻及制品教育部工程中心，齐齐哈尔16 10 0 6摘要：糖尿病严重危害人类健康,其发病机制与氧化应激有关。山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）作为药食兼用植物,其中的山楂叶总黄酮（total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL)具有良好的抗氧化性。为了研究山楂叶总黄酮对糖尿病小鼠的抗氧化作用,以8 4只4周龄SPF级雄性ICR小鼠作为实验研究对象,将其随机分为空白对照组、模型对照组、DMSO模型对照组、山楂叶总黄酮高、中、低浓度组、阳性对照组，组间体质量差异不显著。各模型组小鼠以150 mg/kg一次性腹腔注射1%的链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）,构建 STZ诱导的糖尿病小鼠模型,空白对照组注射等量的柠檬酸钠溶液。模型制备成功后,每天定时灌胃,灌胃2 8 d。试剂盒法检测小鼠血清和肝脏组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、总抗氧化能力（T-AOC）酶活性及丙二醛（MDA）含量，荧光定量PCR法测定抗氧化基因SOD-1、SO D-2、G PX-1、G PX-4表达量。结果表明：山楂叶黄酮能极显著提高糖尿病小鼠血清和肝脏中的SOD、T-A O C、G SH-PX 酶活性(P0.01）,极显著降低MDA含量（P0.01）;并显著上调了糖尿病小鼠肝脏中 SOD-1、SO D-2、G PX-1和 GPX-4基因的表达。山楂叶黄酮能改善 STZ诱导的糖尿病小鼠的氧化应激,提高其抗氧化能力。关键词：山楂叶黄酮;糖尿病；抗氧化；基因表达中图分类号：R285;R965.1D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.8.004Effect of total flavonoids from hawthorn leaf on antioxidant enzyme activityand related gene expression in streptozotocin-induced diabetic miceKey Laboratory of Resistance Genetic Engineering and Biodiversity Conservation in Cold Regions of Heilongjiang Province;Engineering Center of Ministry of Education of Linen and Linen Products in Cold Regions,Qiqihar 161006,ChinaAbstract:Diabetes is a serious hazard to human health,and its pathogenesis is related to oxidative stress.Hawthorn(Cratae-gus pinnatifida Bunge)is a fruit-bearing shrub as a medicinal substance,in which total flavonoids from hawthorn leaf(TF-HL)have favorable antioxidant properties.To explore the antioxidant effect of TFHL on diabetic mice,84 four-week-old SPFmale ICR mice were randomly divided into control group,model control group,DMSO model control group,model groups withhigh-,medium-and low-dose of TFHL and positive control group,there was no significant difference in body mass among allgroups.The mice in each model group were intraperitoneally injected with 1%streptozotocin(STZ)at 150 mg/kg to con-struct STZ-induced diabetic mice,and the control group were injected with the same amount of sodium citrate solution.Afterthe successful preparation of the model,the patients were given different concentrations of TFHL,or metformin hydrochlorideor DMSO or water daily for 28 days.Then,enzyme activities of speroxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-烨，邵淑丽文献标识码：A文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)8-1314-0 8CHEN Wei-yi,XU Xing-jun*,LIU Jia-ren,ZHANG Wei-wei,YANG Ye,SHAO Shu-liDepartment of Life Science and Agroforestry,Qiqihar University;收稿日期：2 0 2 2-12-30基金项目：黑龙江省省属本科高校基本科研业务费面上项目（13550 9133）*通信作者Tel:86-013836291877;E-mail:接受日期:2 0 2 3-0 6-13Vol.35PX),total antioxidant capacity(T-AOC)and malondialdehyde(MDA)content in serum and liver tissues of mice weremeasured by the reagent kit method;the expression of antioxidant genes SOD-1,SOD-2,GPX-1 and GPX-4 were detected byReal-time PCR.The results showed that TFHL significantly increased the activities of SOD,T-AOC and GSH-PX in the serumand liver of diabetic mice(P0.01),and reduced the content of MDA(P 0.05）随机选12只为空白对照组（control group,Con）,其余 7 2 只均为模型组。各模型组小鼠一次性按150 mg/kg腹腔注射浓度为1%的链脲佐菌素,构建STZ诱导的糖尿病小鼠模型,空白对照组注射等量的配置链脲佐菌素溶液所使用的溶剂一柠檬酸钠。注射前禁食12h,注射后可自由饮食、饮水,注射7 2 h后测定小鼠空腹血糖浓度。小鼠空腹血糖11.1 mmol/L,并表现出明显的多饮、多食、多尿症状,造模成功。1.3动动物分组与给药方法选取造模成功的小鼠7 2 只,随机分为12 0 mg/（k g d）的山楂叶黄酮高浓度组（high dose of totalflavonoids from hawthorn leaf,TFHL-H),60 mg/(kg:d)的山楂叶黄酮中浓度组（medium dose of total fla-vonoids from hawthorn leaf,TFHL-M)、30 mg/(k g :d）的山楂叶黄酮低浓度组（low dose of total fla-vonoids from hawthorn leaf,TFHL-L）、阳性对照组（p o s i t i v e c o n t r o l g r o u p,Po s）、模型组（model controlgroup,Mod)和 DMSO 模型对照组(DMSO model con-trol group,DMSO）,每组数量为12 只,空白组和模型1316组灌胃蒸馏水,阳性对照组灌胃30 0 mg/（k g d)的盐酸二甲双胍。各组小鼠自然光照,饮食、饮水,于室温下每天定时灌胃4周。1.4小鼠血糖及口服糖耐量的测定利用血糖仪(GA-3 型)测定小鼠空腹血糖(fast-ing blood glucose,FBG)浓度,采用剪尾取血法,将得到的血液滴到载玻片上并用血糖仪进行测量，操作前后均进行消毒。测定小鼠空腹血糖(O min)后,小鼠按2 g/kg灌胃葡萄糖,进行尾尖采血,以血糖仪检测糖灌胃后15、30、6 0、12 0 min 的血糖值为口服糖耐量(oral glucose tolerance test,OGTT)。1.5抗氧化酶活性测定最后一次灌胃后,小鼠禁食2 4 h,并通过断颈法表1弓引物信息Table 1 Primer information基因引物序列(5 3)GenePrimer sequence(5-3)F:5-CTTCCACCATGCCATGCCAGAG-3SOD-1R:5-AGCAACCGACCAACAAGCAAGG-3F:5-TGAGGAGAGCAGCGGTCGTG-3SOD-2R:5-TCGGTGGCGTTGAGATTGTTCAC-3F:5-TGCGGAATGCCTTGCCAACAC-3GPX-1R:5-AGCCAGTAATCACCAAGCCAATGC-3F:5-AGAAGAAGGTGTCTGGAGGTGAGG-3GPX-4R:5-AACCACGCAGCCAACCATGTC-3F:5-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3GAPDH天然产物研究与开发处死小鼠。将血液离心以制备血清。肝脏在低温条件下解剖,用预先冷却的生理盐水清洗,并在-8 0 下保存在冰箱中供日后使用。用试剂盒法测定T-AOC、SO D、G SH-PX 酶活性和MDA含量。1.6抗氧化酶相关基因表达测定根据小鼠SOD-1（NM _0 11434.2）、SO D-2（NM013671.3）、G PX-1（NM _0 0 8 16 0.6）、G PX-4（NM _008162.4)和 GAPDH(NM_001289726.1)的基因序列设计引物,序列如表1所示。从小鼠肝脏样本中提取总RNA，使用Prime ScriptTMRT试剂盒将总RNA反转录到cDNA中，使用逆转录合成的cDNA作为模板,内部参照GAPDH,并使用2-Ci该方法计算基因的相对表达。R:5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3Vol.35产物大小Product size(bp)2693442612471231.7数据处理采用SPSS21.0软件包对试验数据进行数据分析,Graphpad Prism7.0作图。试验结果数据均以平均值标准差（s)表示。2结果与分析2.1L山楂叶黄酮对 STZ诱导的糖尿病小鼠血糖及口服糖耐量的影响由表2 可知,试验期间,空白对照组小鼠血糖呈表2 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠空腹血糖值的影响(xs,n=12)Table 2Effect of different concentrations of TFHL on fasting blood glucose in diabetic mice(x s,n=12)组别GroupConDMSOMod动态平衡,DMSO对照组和水模型对照组小鼠血糖浓度持续上升，各黄酮试验组和阳性对照组总体呈下降趋势。试验结束后,各黄酮试验组组小鼠血糖显著低于DMSO模型对照组（P0.05）,低酮组极显著低于DMSO模型对照组和水模型对照组(P0.05）。山楂叶黄酮可以降低糖尿病小鼠血糖浓度。空腹血糖值Fasting blood glucose(mmol/L)1W5.23 0.73*5.30 0.36*14.57 0.9015.87 0.916.77 1.0415.80 0.742W5.27 0.20*17.07 0.4516.83 1.163W5.73 0.24*18.57 0.6917.20 1.374W5.43 0.44*19.43 0.5618.03 0.64Vol.35续表 2(Continued Tab.2)组别GroupPosTFHL-HTFHL-MTFHL-L注：与Mod组相比，*P0.05，*P 0.0 1。下同。Note:Compared with Mod,*P0.05,*P0.05）；水模型对照组与高酮组、中酮组、低酮组相比组间差异均极显著（P0.05）;水模型对照组T-AOC、SO D 及GSH-PX酶活性极显著低于各黄酮实验组(P0.01）;水模型对照组MDA含量极显著高于各黄酮实验组(P0.01）。山楂叶黄酮可提高糖尿病小鼠血清中T-AOC、G SH-PX 以及 SOD酶活性,降低MDA含量。3W9.07 2.53*10.87 1.75*12.57 1.51*10.23 0.49*10.80 1.20*27.40 0.4626.37 0.4817.87 1.68*19.57 0.39*21.30 0.66*17.90 1.04*4W9.50 1.78*14.57 1.30*15.03 1.01*11.40 0.47*120 min6.33 0.90*23.83 1.2423.57 0.4414.87 2.68*21.27 0.50*15.40 0.45*16.07 0.91*1318Table 4Effect of different concentrations of TFHL on SOD,T-AOC,GSH-PX and MDA in serum of diabetic mice(x s,n=12)组别GroupConDMSOModPosTFHL-HTFHL-MTFHL-L天然产物研究与开发表4不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠血清中SOD、T-A O C、CSH-PX 和MDA的影响(xs,n=12)SODMDA(U/mL)(U/mL)7.37 0.42*0.94 0.014.52 0.170.93 0.014.53 0.220.93 0.0113.18 0.95*0.98 0.01*7.57 0.59*1.09 0.01*7.68 0.34*1.07 0.01*6.23 0.20*1.00 0.01*Vol.35T-AOCGSH-PX(U/mL)25.01 0.47*3.57 0.173.93 0.1710.90 0.17*9.65 0.54*9.11 0.54*8.58 0.31*(nmol/mL)0.65 0.01*6.61 0.016.63 0.011.42 0.01*2.59 0.01*3.19 0.02*3.20 0.01*2.4山楂叶黄酮对 STZ诱导的糖尿病小鼠肝脏中SOD、T-A O C、G SH-PX 和MDA的影响由表5可知,小鼠肝脏中,DMSO模型对照组和水模型对照组SOD酶活性显著低于各黄酮实验组（P 0.0 5）,而MDA含量极显著高于各黄酮实验组表5不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠肝脏中SOD、T-A O C、G SH-PX 和MDA的影响(xs,n=12)Table 5Effect of different concentrations of TFHL on SOD,T-AOC,GSH-PX and MDA in the liver of diabetic mice(x s,n=12)组别GroupConDMSOModPosTFHL-HTFHL-MTFHL-L（P 0.0 1）;各黄酮实验组T-AOC 和GSH-PX酶活性极显著高于DMSO模型对照组和水模型对照组（P 0.0 1）。山楂叶黄酮可提高糖尿病小鼠肝脏中T-AOC、G SH-PX 以及 SOD酶活性,降低MDA含量。SODT-AOC(U/mg.prot)(U/mg.prot)4.17 0.08*0.44 0.012.35 0.110.45 0.012.40 0.140.45 0.016.23 0.02*0.53 0.01*3.24 0.11*0.73 0.01*3.18 0.14*0.71 0.01*2.96 0.05*0.58 0.01*GSH-PX(U/mg.prot)36.09 0.47*10.54 0.3610.36 0.1831.98 0.47*24.83 0.47*24.30 0.18*21.62 0.47*MDA(nmol/mg.prot)0.13 0.01*1.27 0.061.28 0.060.31 0.04*0.52 0.01*0.66 0.02*0.64 0.01*2.5山楂叶黄酮对STZ诱导的糖尿病小鼠体内抗氧化基因相对表达量的影响结果由图2、3可知,小鼠肝脏中各黄酮实验组SOD-1、SO D-2、G PX-1、G PX-4 基因的表达量均极显著高于DMSO模型对照组和水模型对照组（P0.05）。糖尿病小鼠经山楂叶黄酮灌胃4周后,肝脏中 SOD-1、SO D-2、G PX-1及GPX-4 四种抗氧化基因的表达量均有极显著提升。AconTFHL-LTFHL-TFHL图2 不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠SOD-1基因(A)和SOD-2基因(B)表达的影响(xs,n=12)Fig.2Effect of different concentrations of TFHL on SOD-1 gene(A)and SOD-2(B)gene expression in diabetic mice(x s,n=12)Vol.35陈薇伊等：山楂叶总黄酮对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠体内抗氧化酶活性及相关基因表达的影响A1.5图1.00.50.01319B1.51图1.00.50.0ConPosTFHLTFHL-MTFHL-LconPosTFHLexpression in diabetic mice(x s,n=12)图3不同浓度山楂叶黄酮对糖尿病小鼠GPX-1基因(A)和GPX-4基因(B)表达的影响(xS,n=12)Fig.3Effect of different concentrations of TFHL on GPX-1 gene（A)a n d G PX-4 g e n e (B)3讨论及结论血糖是身体细胞、组织、器官重要的能量来源 13。口服糖耐量试验能够对机体胰岛细胞功能、糖代谢状况进行评估 14。Huang 等 15 研究表明,鱼腥草总黄酮能降低 1 型糖尿病小鼠的血糖。上述研究表明黄酮类化合物对糖尿病的治疗有积极作用。本试验结果显示,山楂叶黄酮可降低糖尿病小鼠血糖浓度并改善葡萄糖峰值时间,与上述研究结果相一致。胰岛素是体内唯一降糖激素 16 ,通过其含量可判断糖尿病病变程度。本试验结果显示,山楂叶黄酮可增加小鼠体内胰岛素含量,降低糖尿病小鼠血糖浓度,这与Zeng 等 17 研究桑叶黄酮可显著降低糖尿病小鼠血糖水平,改善其糖代谢的结果相一致。在本试验结果中,低剂量山楂叶黄酮降低血糖的效果最好,这可能是由于低剂量山楂叶黄酮会首先作用于胰腺，促进胰岛素的分泌进而使血糖降低，而高剂量山楂叶黄酮会首先作用于肝脏，修复肝脏的损伤，使相应的基因表达增强。这与Zhang、Lu 9i 等的研究结果一致。目前研究显示,糖尿病发病机制复杂,其重要的发病机制为活性氧自由基积累使机体抗氧化能力下降 2 0.2 1。Liu等 2 研究表明,准噶尔山楂叶中三种黄酮成分均有清除自由基的功能;根据本次实验，由各组数据显示,发现山楂叶黄酮能显著提高血清和肝脏中抗氧化酶活性,并使 MDA含量降低,可能有以下几个方面的原因，一是由于半琨式自由基其性质较稳定,而在体内的自由基能与山楂叶黄酮中的酚羟基发生反应,生成稳定的半琨式自由基,从而终止了自由基链式反应，链式反应终止使机体抗氧化能力提高。二是MDA的含量可以因为脂质过氧化反应而增加，机体过量的自由基会导致此反应产生。山楂叶黄酮可以抑制脂质过氧化，血清和肝脏中MDA含量不会因此增加,机体抗氧化能力也就随之增强。三是山楂叶黄酮中黄酮种类较多,当B环存在邻羟基时,2,3位双键对B环失去电子后自旋产生稳定的自由基,4 位羰基能和邻羟基生成氢键,使得自由基中间体更加平稳。此外,在细胞中存在Fenton 反应(Fe2+H,O,Fe3+OH+OH),牡荆素可与Fe2+发生络合反应,络合位点在4-羰基-5-羟基之间,络合Fe2+可有效减少OH的生成,形成络合物沉淀，减少自由基，提高机体抗氧化能力。山楂叶黄酮可提高1型糖尿病小鼠肝脏和血清中抗氧化酶的活性,降低MDA含量,使机体抗氧化能力得到增强。抗氧化基因的表达与抗氧化酶的抗氧化作用密切相关。当机体氧化程度超出氧化物清除能力，氧化和抗氧化系统稳定性被破坏,造成氧化损伤 2 3。低水平氧化应激状态下机体的抗氧化蛋白在抗氧化反应元件（antioxidant-response element,ARE)或亲电反应元件(electrophilic response element,EpRE）的顺式作用元件介导下被激活 2 4。ARE可从转录水平上调控抗氧化酶对机体氧化应激状态下的反应 2 5。正常生理情况下,核因子E2相关因子2（nuclear factorerythroid-2 related factor 2,Nrf2）与Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（epoxy chloropropane kelch samplerelated protein-1,Keapl）相结合于胞浆中,活性被抑制,在泛素蛋白酶作用下降解,以保持在生理状态下Nrf2的低转录活性 2 6 ,当细胞处于氧化应激状态下时,原本相结合的Nrf2与Keapl 解偶联,活化了的Nrf2进人细胞核后与小Maf蛋白形成二聚体,进而识别并结合ARE元件,启动下游基因转录，机体抗氧化酶的转录活性因此被提高,故而平衡机体氧化损伤 2 7 。在本试验中,糖尿病小鼠经山楂叶黄酮灌胃41320W后,肝脏中SOD-1、SO D-2、G PX-1及GPX-4四种抗氧化基因的表达量均有极显著提升,其原因可能有两方面，一方面可能由于糖尿病小鼠体内氧化应激较为严重,使得机体抗氧化系统无法平衡自由基进攻,从而造成细胞的严重氧化损伤并且机体内源性抗氧化系统无法消除自由基,山楂叶黄酮不但可消除体内自由基,亦可与金属离子发生络合作用,减少自由基和金属离子对细胞的氧化损伤,促进Nrf2 的核内转位,增加 Nrf2 的表达,进而增加糖尿病小鼠肝脏中 SOD-1、SO D-2、G PX-1及 GPX-4基因的表达量。另一方面可能由于糖尿病小鼠体内抗氧化酶活性降低,导致体内自由基增加,造成细胞氧化损伤，引起线粒体系统供能不足以及DNA、R NA 转录受阻,使患病小鼠肝脏中抗氧化基因的表达量极显著降低。由于山楂叶黄酮均有清除体内自由基的作用,灌胃后,小鼠细胞中DNA、R NA 转录得到改善，使糖尿病小鼠肝脏中 SOD-1、SO D-2、G PX-1及 GPX-4基因的表达量得到提高。Deng等 2 8 研究表明,皮素可激活乙醇孵育的人原代肝细胞中 Nrf2的核转位表达。Ganesan29、Zh a n g,30 1等的研究表明,牡荆素通过激活细胞调节调亡的关键蛋白，包括NF-kB和 Nrf2,从而改善胰岛素分泌。均与本试验结果相一致。结果表明，山楂叶黄酮可使MDA含量极显著降低,并极显著提高 STZ诱导的糖尿病小鼠血清和肝脏中T-AOC、SO D 以及 GSH-PX 酶活性。山楂叶黄酮可显著上调 STZ诱导的糖尿病小鼠肝脏中SOD-1、SO D-2、G PX-1、G PX-4基因的表达量。综上所述,山楂叶黄酮可改善糖尿病氧化损伤,具有良好的抗氧化作用,在对于糖尿病的治疗与相关药物研发上具有良好的发展前景。参考文献1Yao WL,Yan Y,Qu DQ,et al.Research progress on the rela-tionship between triacylglycerol/high-density lipoprotein cho-lesterol ratio and complications of diabetes J.Chin GenPract（中国全科医学）2 0 2 1,2 4:2 2 32-2 2 37.2Guan ZA.Modern Diabetes(现代糖尿病学)M.Tianjin:Tianjin Science and Technology Press,2000.3Fan LF.Nursing progress of diabetes J.Chin J Nurs(中华护理杂志）,1997,32:6 13-6 17.4Qian RL.New diagnostic criteria and classification of diabe-tesJ.Chin JDiabetes（中国糖尿病杂志）,2 0 0 0,8:5-6.5Guo XH.Diabetes patients should pay attention to weight天然产物研究与开发changeJ.Diabetes New World(糖尿病新世界）),2 0 10,7:20.6Huang XJ.Correlation between body fat content and vascularcomplications in type 1 diabetes patients J.Nurs Pract Res（护理实践与研究）,2 0 2 0,17:2 7-2 9.7Gao 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