食品中克罗诺杆菌分子分型方法研究进展.pdf
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1、现代食品XIANDAISHIPIN22/行业综述Industry Reviewdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.13.006食品中克罗诺杆菌分子分型方法研究进展Progress on Molecular Typing Methods of Cronobacter spp.in Food 周钦,王宇轩,顾佳丰,余红民,姜华,李远宏(徐州医科大学,江苏 徐州 221004)ZHOU Qin,WANG Yuxuan,GU Jiafeng,YU Hongmin,JIANG Hua,LI Yuanhong(Xuzhou Medical University,Xuzhou 2210
2、04,China)摘 要:克罗诺杆菌(Cronobacter spp.,CR)是一种可引起婴幼儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎等疾病的食源性致病菌,对人类健康构成严重威胁。分子分型技术在食源性疾病暴发识别和溯源调查、食源性致病菌的分类与鉴定等方面发挥着越来越重要的作用。本文对CR分子分型方法进行了综述,以期为有效控制食品中CR污染提供技术支持,为CR感染的防控提供理论依据。关键词:克罗诺杆菌;分子分型;基因分型Abstract:Cronobacter spp.is a foodborne pathogen that can cause diseases such as meningitis,
3、bacteremia and necrotizing enterocolitis in infants and young children,which poses a serious threat to human health.Molecular typing techniques are becoming increasingly important in the identification and traceability investigation of foodborne disease outbreaks,as well as in the classification and
4、 identification of foodborne pathogens.This article provides a comprehensive review of the molecular typing methods of Cronobacter spp.,aiming to offer technical support for the effective control of Cronobacter contamination in food and a theoretical basis for the prevention and control of Cronobact
5、er infection.Keywords:Cronobacter spp.;molecular typing;genotyping中图分类号:TS201.3克罗诺杆菌(Cronobacter spp.,CR)是一种重要的食源性条件致病菌,可引起婴幼儿脑膜炎、菌血症、坏死性结肠炎等疾病,严重威胁食品安全和人类健康。现有研究表明,婴儿配方奶粉是导致 CR 感染的重要渠道,但是该菌在谷类、肉类、果蔬类和香辛料等食品中也广泛存在。CR 包括 7 个种和 3 个亚种,属类不同分型的 CR 在生存能力、毒力与耐药性等方面存在较大差异1。分子分型技术是一种在食源性疾病暴发和溯源调查中被广泛应用的技术,通过
6、该技术可以在分子水平快速实现对致病菌的识别和鉴定,解析菌株的遗传演化规律与分子遗传特征,为预防和控制 CR 引起的感染提供理论依据。基于此,本文对 CR的分子分型方法进行简要综述。1 多重 PCR 法多重PCR法(Multiplex Polymerase Chain Reaction,mPCR)是在同一反应体系下,同时加入两对或两对以上引物进行 PCR 扩增,通过 PCR 扩增获得大小不基金项目:江苏省高校哲学社会科学基金项目(2019SJA0958);江苏省大学生创新创业训练计划项目(201810313037Y)。作者简介:周钦(1999),女,本科,研究方向为营养与食品卫生学。通信作者:李
7、远宏(1984),男,博士,副教授,研究方向为食源性致病微生物。E-mail:。现代食品XIANDAISHIPIN23/行业综述IndustryReview等的 DNA 片段,可以实现对多种病原菌的同时检测与分析。CARTER 等2基于 mPCR 技术建立了一种可同时区分 6 种 CR 的分子分型方法。该方法基于 cgcA基因设计特异性引物进行 mPCR 扩增,获得不同大小的 DNA 片段,并通过凝胶电泳将各扩增产物分离,以实现对不同种 CR 的鉴别。mPCR 分型是一种较早开发的用于 CR 种间区分的分子分型方法,这种技术具有准确度高、操作简单快捷、费用较低等多种优点。该方法能在种水平实现对
8、 CR 的鉴定,但是其分辨率较低,无法在基因水平检测到不同菌株的变异情况,因此限制了其在诊断、鉴别、溯源和监测等方面的广泛应用。2 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PFGE)是 20 世纪 80 年代中期发展起来的一种通过电泳分离大分子 DNA 的技术,其基本原理是利用稀有位点的限制性内切酶(如 XbaI、SpeI)切割细菌基因组 DNA,得到的大片段 DNA 在脉冲电场作用下进行分离,然后再依据 DNA 片段的大小、数量及相对位置关系将不同菌株划分为不同的基因型。PFGE 是被广泛认可的用于细菌分子分型的“黄金标准”方法,对金黄
9、色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌、致病性大肠杆菌 O157、副溶血弧菌和 CR 等食源性致病菌具有很强的鉴定能力。MULLANE 等3对 30 株 CR 分离株进行 PFGE 分析,通过 XbaI 酶切后,利用随机引物扩增出37条长度为400 3 500 bp 的 DNA 片段,聚类分析后 16 株分离株鉴定为丙二酸 盐 克 罗 诺 杆 菌(C.malonaticus),14 株 分 离 株鉴定为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)。LI 等4利用 PFGE 方法对 20082018 年温州市食品和粪便样本中分离的 CR 进行分型,将 90 株 CR 划分为 75 个克隆群,其中
10、86 株鉴定为 C.sakazakii,4 株鉴定为 C.malonaticus。PFGE 分型技术具有重复性好、分辨率高以及易于标准化等诸多优点,而且结果稳定可靠,不受表型性状干扰。但是,该方法也存在一些缺陷,如仪器试剂昂贵、过程烦琐、耗时长、对操作人员的素质要求高等,从而限制了该技术的推广普及。3 随机多态性扩增 DNA随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymo-rphic DNA,RAPD)分型技术采用随机引物对基因组DNA 进行 PCR 扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR 扩增产物,进而分析片段多态性。DRUDY 等5分析 51 株 CR 分离株和 6 株
11、 CR 标准菌株的 RAPD图谱,发现这些菌株产生了 3 11 个大小为 350 2 600 bp 的扩增产物,聚类分析发现大部分菌株被划至 3 个簇群。杨海荣等6利用 RAPD 技术对 38 株 CR进行了分子分型分析,利用随机引物扩增出 3 7 条长度为 400 3 500 bp 的 DNA 片段,并将这些菌株划分为 8 个基因型,证实了 RAPD 技术可用于 CR 种间鉴别和分子溯源分析。RAPD 分型方法工作原理简单、成本低、耗时短、易于操作,且不需要全基因组序列信息来确定特定的靶标,但是不足之处在于可重复性差,技术路线尚未实现标准化,无法区分等位基因,可能会出现假阳性或假阴性结果,因
12、此对实验结果的解释具有较大的主观性。4 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)是一种用于 DNA 多态性的检测方法,由荷兰科学家 Zabean 和 Vos 于 1992 年首次提出。该方法首先利用限制性内切酶切割基因组DNA,得到带有不同酶切末端的限制性酶切片段,然后在酶切片段上加上双链接头,作为 PCR 扩增时引物的结合区,再通过选择性引物进行 PCR 扩增,最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增片段的多态性。IVERSEN 等7建立了一种可区分 CR 的 AFLP 方法,采用限制性内切酶 EcoR I
13、和 Taq I 对 51 株 CR 基因组DNA 进行了酶切,然后将酶切后的基因组 DNA 与人工接头在 T4 连接酶的作用下连接,以连接了接头的DNA 为模板进行 PCR 扩增,扩增结束后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。AFLP 图谱分析结果显示,以相似度70%为基准,51 株 CR 菌株被划分为 4 个生物群。另一项研究中,TURCOVSKY 等8利用 AFLP 技术对98 株 CR 进行了分析,以相似度 70%为基准,可以将这些菌株划分为 6 个生物群,而以相似度 90%为基准,可以将这些菌株划分为 46 个生物群。目前,CR的 AFLP 分型技术尚未实现标准化,其具体的操作流程还有待于进一步规
14、范。AFLP 在细菌分子分型中表现出较好的重复性,其分辨能力优于 RAPD,但不及PFGE,并且只能检测到 CR 种间基因组差异,对于CR 种内不同亚型的基因组差异则无法完全鉴定。5 PCR-限制性片段长度多态性PCR-限制性片段长度多态性(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)是一种将PCR技术、RFLP 与凝胶电泳技术联用的基因多态性分析技术,其原理是先将待测的靶 DNA 片段进行 PCR 扩增,然后通过限制性内切酶对 PCR 产物进行酶切,获得不同现代食品XIANDAISHIPIN24/行业综述Industry Rev
15、iew长度的 DNA 片段,经琼脂糖凝胶电泳分析靶 DNA 片段的分子量大小而分型。STRYDOM 等9基于 rpoB基因序列建立了一种可以区分 5 种 CR 的 PCR-RFLP分子分型方法。首先,通过设计特异性引物进行 PCR扩增,获得长度为 660 bp 的 rpoB 基因片段,然后利用限制性内切酶 Csp6I 和 HinP1I 单独或联合消化 PCR扩增产物,最后依据琼脂糖凝胶电泳图谱的差异将不同种 CR 区分开来。VLACH 等10建立了一种新的PCR-RFLP 分型方法,该方法使用一对新设计的引物对 rpoB 基因序列(1 635 bp)进行 PCR 扩增,再采用3 种限制性核酸内
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