生物菌肥对小麦田地土壤微生物群落的影响.pdf

113青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY土壤微生物是农田生态系统的重要组成部分，在维持生态系统结构和功能稳定性中发挥着重要作用1。在农业发展初期，为追求产量，不断增加化肥的施用量。过量化肥的使用造成耕地土壤酸化、土壤微生物群落失衡等问题2。但是随着中国农业高质量发展不断推动，有必要施用一种与化肥肥效相似或更好但对环境友好的替代肥料，实现对环境的保护3。微生物菌肥在植物生长代谢过程中可以产生多种生理活性物质4，具有活化有机质、减少环境污染等众多优势5，能够解决我国当前农业发展中遇到的很多重大问题，为有机农业生产的未来提供更多可能，符合我国向生态型农业发展的趋势。本研究通过施用生物菌肥和常规化肥对比分析，研究土壤微生物群落多样性变化的响应，探讨和评价在高原地区施用生物菌肥的可行性，为青海省农业绿色发展提供科学参考。1 材料与方法1.1 试验区概况田间试验地位于青海省西宁市大通县林家台村（370207N，1013511E），平均海拔 2556 m，年平均气温 3.3，年日照时数 2300h，全年无霜期 151.60d，年平均降水量 398.80mm，年平均气温4.30，属高原大陆性气候。土壤类型为栗钙土，种植前用五点法采样分析测得耕层土壤（020cm）基本性质：有机质 28.80gkg-1，全氮 1.00gkg-1，碱解氮 102.90mgkg-1，有效磷 57.70mgkg-1，速效钾 102.40mgkg-1，土壤 pH 值 8.40。基金项目:青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室项目(2020-ZJ-04);2022 年民生科技专项“生物菌肥对高原小麦种植的影响”。作者简介:密发凯(1998-),女,在读硕士,研究方向:生物化学与分子生物学。E-mail:。*通信作者:马永贵(1972-),男,博士,教授,研究方向:青藏高原药用动植物资源。E-mail:。生物菌肥对小麦田地土壤微生物群落的影响密发凯 赵志敏 马永贵*（1.青海师范大学生命科学学院，西宁 810008；2.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，西宁 810008）摘 要：采用大田试验，结合高通量测序等技术，研究生物菌肥对小麦田地土壤肥力及微生物群落结构的影响。结果表明：微生物菌肥提升了土壤有机质、全氮、全磷、碱解氮、速效磷含量，降低了土壤 pH 值。在 97%相似水平上，细菌文库聚类获得 3919 个 OTU，其中包含 37 个门、113 个纲、259 个目、393 个科、701 个属和1 454 个种；真菌文库聚类获得 1203 个 OTU，其中包含 13 个门、38 个纲、84 个目、180 个科、369 个属和551 个种。细菌中的优势菌门为放线菌、变形菌、绿弯菌、酸杆菌；真菌中的优势菌门为子囊菌门、被孢霉门、担子菌门。在一定程度上，微生物菌肥提高了细菌、真菌群落多样性，降低了细菌、真菌群落的丰富度。研究为改善青海地区土壤环境、促进青海省农业绿色发展提供一定的科学参考。关键词：生物菌肥；化肥；高通量测序；微生物群落结构；土壤肥力中图分类号：S154.3;S144 文献标识码：A 文章编号：1005-9393(2023)03-0113-08114青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY1.2 试验设计试验于 2021 年 4-9 月进行，采用随机区组设计，麦地设置 2 个处理，分别为小麦微生物菌肥处理组（M）和常规化肥组（B）。微生物菌肥处理组施用微生物菌肥 50 倍稀释液，对照组施用传统无机化肥尿素（含 N46%）、过磷酸钙（P2O512%），每个处理设置 3 个重复，共 9 个小区，每个小区面积 5m10m=50m2，保护行宽 1m，走道宽及小区排水渠宽 0.5m。微生物菌肥由华联农业发展（辽宁省）有限公司提供，登记证号为微生物肥（2020）准字（7774）号，有效菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），有效活菌数 2.0 亿/mL。供试小麦品种为当地广泛种植品种“互助红”。两种处理均于 2021 年 4 月 8 日播种后进行首次施肥，二次追肥时间为 6 月 11 日，其他田间管理措施与传统大田相同。1.3 土壤样品采集土壤样品采集于小麦收获后，在每个小区按照“S”形多点打土钻，打钻深度为 20cm，每个小区取 3 钻土壤，去除表面浮土、根系、石块等杂质后充分混匀作为一个区的耕层土壤样品，放入冰盒低温保存带回实验室。在实验室将每份土壤分为两部分，一部分风干后研磨，过 200 目筛网用于土壤养分等指标的测定；另一部分置于-80 冰箱保存备用，用于土壤微生物相关指标的测定。1.4 测定项目及方法1.4.1 土壤指标测定pH 计（MettlerToledo；Switzerland）测 定 土壤 悬 液 的 pH 值；意 大 利 NCTechnologies 公 司CostechESC4024元素分析仪测定全氮、全磷、全钾；NY/T1848-2010：联合浸提-比色法测定碱解氮、有效磷、速效钾；GB9834-88：重铬酸钾容量法测定有机质。1.4.2 土壤微生物总 DNA 提取和高通量测序采用 E.Z.N.A.SoilDNAKit（OMEGA，美国）试剂盒提取土壤微生物总 DNA，采用 NanoDrop-NDl000 测定提取 DNA 浓度，并经 2琼脂糖凝胶电泳对 DNA 样品进行检测，检测合格后用于菌群文库构建。以各土壤样品微生物总 DNA 为模板，选取细菌 V3+V4 区（338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）6和真菌ITS1区（ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，ITS2R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC）7进行目的片段扩增，用于后续微生物种属鉴定。PCR 扩增产物的测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。1.5 数据处理及分析测序数据通过 FLASH 和 Trimmomatic 软件进行过滤优化和双端序列的连接，优质序列利用Usearch 软件基于 97%的相似水平进行分类操作单元（OperationalTaxonomicUnits，OTU）聚类，根据Silva 细菌数据库8和 Unite 真菌数据库利用 RDPClassifier 进行物种注释和分类9；基于 OTU 丰度信息，利用 R 语言工具进行主成分分析（PrincipalComponentAnalysis，PCA），稀释曲线、Venn 图和群落柱形图的制作。利用 Mothur 软件计算 Alpha多样性指数（Shannon、Simpson、Chao、ACE 等指数），并用 Excel 和 SPSS23.0 软件进行数据统计分析与作图。2 实验结果2.1 施用生物菌肥对土壤肥力的影响由表 1 可知，M 相比 B，pH 值下降，有机质含量上升 1.79%，全氮含量上升 2.44%，全磷含量上升 2.17%，全钾含量上升 2.26%，碱解氮含量上升 3.21%，速效磷含量上升 33.99%，速效钾含量降低 9.85%。成分pH 值有机质/gkg-1全氮/gkg-1全磷/gkg-1全钾/gkg-1碱解氮/mgkg-1速效磷/mgkg-1速效钾/mgkg-1M8.050.0230.201.572.100.072.820.0323.500.47105.409.1013.184.51119.5617.58B8.100.0329.671.502.050.472.760.0722.980.42102.123.8717.665.17132.301.60P0.4500.6930.8710.2340.2260.6110.3230.336表 1 施用生物菌肥对小麦根区土壤肥力的影响注：表中数值为“平均值 标准差”。115青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY2.2 施用生物菌肥对小麦根区土壤微生物的影响2.2.1 小麦根区土壤微生物文库测序结果评价本研究对 6 个小麦土壤样品进行了 IlluminaMiSeq 高通量测序，数据经过滤优化，细菌文库共得到 268969 条有效序列，序列长度分布在232505bp 之间，以 97%相似水平将序列聚类获得 3919 个 OTU，其中包含 37 个门、113 个纲、259 个目、393 个科、701 个属和 1454 个种；真菌文库共得到 344113 条有效序列，序列长度分布在 140526bp 之间，以 97%相似水平将序列聚类获得 1203 个 OTU，其中包含 13 个门、38 个纲、84 个目、180 个科、369 个属和 551 个种。细菌V3+V4 区、真菌 ITS1 区的有效序列数量和 OTU 数量如表 2 所示，统计结果显示处理组和化肥组中细菌文库及真菌文库的有效序列数量和 OTU 数量均差异不显著。表 2 小麦根际土壤细菌、真菌 OTU 序列读数注：表中数值为“平均值 标准差”。成分细菌 V3+V4 区真菌 ITS1 区有效序列数量/条OUT/个有效序列数量/条OUT/个M427959653.62542234.058654108620.259814.2B468612737.9275054.6560506171.261743.7P0.5210.2600.7360.521小麦根区土壤细菌和真菌多样性稀释曲线（图1）显示，随着测序数量的不断增大，各样品 OTU数目的增加趋势趋于平缓，基本达到饱和，说明测序数据量合理。图 1 小麦根区土壤样品细菌（a）、真菌（b）稀释曲线2.2.2 小麦根区土壤微生物 Alpha 多样性指数分析本研究在 97%相似水平上计算各土壤样品测序的覆盖率（表 3），细菌文库测序覆盖率在 98%以上，真菌文库测序覆盖率在 99%以上，说明本研究取样合理且处理组和化肥组间微生物文库测序覆盖率差异不显著，测序数据能够真实地反映土壤样品中的微生物群落。Shannon（香农指数）、Simpson（辛普森指数）指数作为用来估算样本中微生物多样性的指数，常用于反映群落 alpha 多样性。Shannon 指数越116青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY大，说明群落多样性越高。Simpson 指数值越大，说明群落多样性越低10。如表 3 所示，M 的小麦农田根区土壤中,细菌的 Shannon 指数相比 B 下降 0.47%，真菌的 Shannon 指数上升 2.91%；细菌和真菌的 Simpson 指数相比 B 分别下降 10.53%和 17.35%，说明施用微生物菌肥后小麦根区土壤细菌和真菌的多样性在一定程度上有所提高。ACE 指数、Chao 指数是生态学中估计物种总数的常用指数之一，表征微生物-多样性的指标，其值越高表示微生物多样性越高11，物种丰富度也越高12。与 B 相比，M 的细菌 Chao指数下降 5.97%，真菌 Chao 指数下降 1.65%；M 的细菌 ACE 指数下降 5.97%，真菌 ACE 指数相比下降 2.58%，表明施用微生物菌肥可以在一定程度上降低小麦根区细菌和真菌群落的物种总数。2.2.3 小麦根区土壤微生物 OTUs 分布对两个处理组中所共有的 OTU 进行 Venn 图分析，M 与 B 之间共有的细菌 OTU 为 3030 个（图2a），特有的 OTU 数分别为 362 个和 527 个，说明微生物菌肥会降低小麦根区土壤的特有细菌物种。M 和 B 共有的真菌 OTU 为 701 个（图 2b），特有的 OTU 数分别为 227 个和 275 个，说明微生物菌肥会降低根区土壤特有真菌物种。微生物处理多样性指数丰富度文库覆盖率/%Shannon 指数Simpson 指数ACE 指数Chao 指数细菌M6.47570.03850.00510.00013104.6229.363107.9242.550.98440.0037B6.50620.90240.00570.00153301.0130.593305.1115.220.98590.0015P0.6190.5610.2670.2720.561真菌M4.27350.16540.03810.0059653.15.51655.96.020.99840.0005B4.15240.37400.04610.0203670.451.15666.950.500.99850.0004P0.6350.5500.5920.7260.934表 3 小麦根区土壤细菌、真菌群落丰富度和多样性指数注：表中数值为“平均值 标准差”。图 2 小麦根区土壤样品细菌（a）、真菌（b）OTU 分布的 Venn 图2.2.4 小麦根区土壤细菌群落组成和结构分析在门的分类水平共得到 9 个类群（图 3a），分别为放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、粘菌门（Myxococcota）、嗜甲烷菌门（Methylomirabil）。M 相比 B 提高了变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、粘菌门、嗜甲烷菌门的相对丰度，分别提升 0.09%、0.93%、0.90%、0.16%、0.12%、0.02%、0.12%，芽单胞菌门两个处理间的差异达到显著水平（P 0.05）。两个处理的放117青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY图 3 在门（a）、纲（b）水平上小麦根区土壤细菌的相对丰度图 4 在门（a）、纲（b）水平上小麦根区土壤真菌的相对丰度线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门为优势菌门，其丰度之和占比达到 80%以上。在纲的分类水平上共得到 17 个类群（图 3b），M 相比 B 提高了放线菌纲、-变形菌纲、绿弯菌纲、酸微菌纲、芽单胞菌纲、拟杆菌纲、KD4-96、厌氧绳菌纲、Gitt-GS-136 的相对丰度，分别提高了 0.92%、0.63%、0.39%、0.32%、0.87%、0.12%、0.43%、0.38%、0.20%。其中放线菌纲、-变形菌纲、嗜热油菌纲、绿弯菌纲、邻里菌纲、-变形菌纲为优势菌纲，其丰度之和占比达到 60%以上。2.2.5 小麦根区土壤真菌群落组成和结构分析在 门 的 分 类 水 平 上 共 得 到 4 个 类 群（图4a），分别是子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、未分 类 的 k 真 菌（unclassified_k_Fungi）。M 相 比 B提高了子囊菌门和未分类的 k 真菌相对丰度，分别提升 1.72%和 1.11%。其中子囊菌门、被孢霉门、担子菌门为优势菌门，其丰度之和占比达到90%以上。在纲的分类水平上共得到 11 个类群（图4b），分别是粪壳菌纲（Sordariomycetes）、被孢霉纲（Mortierellomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、银耳纲（Tremellomycetes）、伞囊菌纲（Eurotiomycetes）、盘菌纲（Pezizomycetes）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、酵母菌纲（Saccharomycetes）、未分类的 p 子囊菌（unclassified_p_Ascomycota）、未分类的 k 真菌（unclassified_k_Fungi）、伞 菌 纲（Agaricomycetes）。M 相比 B 提高了粪壳菌纲（Sordariomycetes）、盘菌纲（Pezizomycetes）、未分类的 k 真菌（unclassified_k_Fungi）的相对丰度，分别比化肥组提高了 16.74%、0.69%和 1.11%，粪壳菌纲两处理间的差异达到显著水平（P 0.05）。其中粪壳菌纲、被孢霉纲、座囊菌纲为优势菌纲，其丰度之和占比达到 60%以上。118青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY2.2.6 小麦根区土壤微生物 Beta 多样性指数分析在 OTU 水平对各样本进行 PCA 分析，如图（5a）所示，在土壤细菌群落中主成分 1（PC1）的贡献率为 59.99，主成分 2（PC2）的贡献率为20.26，两处理组各样本在坐标轴上距离较近，细菌群落组成相似度较高，无显著差异。组内各样本之间围成的椭圆面积大小在坐标空间中基本一致，说明施用微生物菌肥组的组内各样本之间细菌群落组成相似度与化肥组无显著差异。而真菌群落组成（图 5b）中主成分 1（PC1）的贡献率为 38.82，主成分 2（PC2）的贡献率为 30.95，两处理组各样本在坐标轴上距离较近，真菌群落组成相似度较高，无显著差异。组内各样本之间围成的椭圆面积大小在坐标空间中施用微生物菌肥组小于化肥组，所以施用微生物菌肥组的组内各样本之间真菌群落组成相似度高于化肥组。3 讨论与结论土壤 pH 值对维持土壤微生物活性、有机质分解和土壤养分吸收具有重要意义13，过酸或过碱均会影响作物生长，甚至产生有毒物质14。本研究中微生物菌肥对土壤 pH 值有降低作用，原因可能是有机质分解过程产生的腐殖质有弱酸性，对土壤 pH 值起到缓冲作用15,16；或者是放线菌门、芽单孢菌门、变形菌门、厚壁菌门、子囊菌门17等好氧或兼性微生物相对丰度有所提升，降解有机质，产生大量腐殖质，降低了土壤酸碱度18。施用微生物菌肥的土壤有机质相比化肥也有所提升，可能是因为微生物菌肥中本身就含有大量有机质，用来确保微生物活性。本研究发现子囊菌门和担子菌门是黑老虎根际和根部内生真菌的优势类群，或者是子囊菌门分解土壤中动植物腐烂的遗骸和有机质，释放有机物供植物吸收利用19。微生物菌肥提高了土壤中全磷和速效磷的含量，可能是因为微生物菌肥中具有溶磷作用的拟杆菌门等微生物的增加，使得土壤中磷含量升高20。而且，土壤中有机质的增加也能提高有效磷的含量，这与前人在温室大棚施加微生物菌肥的结果一致21。微生物菌肥提升了土壤中全氮和碱解氮的含量，这与前人研究在施用微生物菌肥后能够在一定程度上提高碱解氮含量的结果一致22。微生物菌肥降低了全钾和速效钾的含量，原因可能是微生物菌肥中的解钾菌株受耕作方式或者本身含量不足的影响，导致对土壤中的钾元素利用率不高导致的，而且菌肥发挥肥效的本质是通过其本身含有的微生物复杂的生命活动以及与植物之间的相互作用来促进土壤肥力提升，而不是像化肥直接向土壤释放各种养分，所以并未得到显著提升。图 5 小麦根区土壤细菌（a）、真菌（b）群落 PCA 分析119青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGYAlpha 多样性结果表明，微生物菌肥组对比化肥组，小麦根区土壤细菌群落四个多样性指数无显著差异（P 0.05），这表明相对化肥，微生物菌肥未能显著增加土壤细菌群落的丰富度和多样性，这与王超等的研究结果一致23。但微生物菌肥处理后，小麦土壤中细菌、真菌群落的 Simpson指数下降，真菌的 Shannon 指数上升，说明微生物菌肥一定程度上能提高土壤细菌、真菌群落的多样性。结合 Venn 图结果表明生物菌肥会略微降低真菌的物种数量，从而导致物种丰富度的降低，这可能因为以菌丝生长方式繁殖的真菌能够利用广泛分布的菌丝从化肥中快速获得大量且均衡的养分供自身代谢24，所以在施用化肥的土壤环境中微生物数量更多25,26。细菌群落组成和分析结构表明：放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobectria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）4 个菌门相对丰度均大于 10%，是细菌的绝对优势门，丰度之和达到 80%以上，这与 Jangid 等27对农田作物土壤细菌的研究结果基本一致。粪壳菌纲真菌能够与植物产生协同作用，增强植物抗病虫的能力28。本试验通过大田实验与高通量测序技术结合，以土壤肥力、土壤微生物群落为研究内容。虽初步验证了微生物菌肥替代化肥的可行性，但在有些方面还存在问题。本试验仅为一个植物生长周期，施用微生物菌肥后的效果并没有特别明显，无法揭示长时间施用微生物菌肥对土壤环境带来的影响。土壤作为一个复杂的循环系统，只靠土壤微生物和土壤肥力指标去解释施用微生物菌肥的影响略显片面，后续可结合土壤酶活、团粒结构等指标，进一步揭示施用微生物菌肥对土壤环境的影响。参考文献:1马垒,郭志彬,王道中,等.长期三水平磷肥施用梯度对砂姜黑土细菌群落结构和酶活性的影响J.土壤学报,2019,56(6):1459-1470.2高莹,孙喜军,景鹏娟,等.西安市化肥施用面源污染环境风险评价研究J.陕西农业科学,2021,67(10):66-74.3李浩,白玉瑞.当前农产品安全问题及解决途径探讨J.决策探索(下半月),2008(2):72.4杜春燕.有机肥替代化肥对果实产量、品质及土壤肥力的影响D.西北农林科技大学,2019.5王君杰,李俊,乔治军.生物菌肥对谷子长势指标及产量的影响J.新疆农业科学,2021,58(6):1042-1047.6XUN,TANGC,WANGHY,etal.Effectofbiocharadditionstosoilonnitrogenleaching,microb-ialbiomassandbacterialcommunitystructureJ.EuropeanJournalofSoilBiology,2016,74:1-8.7BOKULICHNA,MILLSDA.Improvedselectionofinternaltranscribedspacer-specificprimersenablesquantitative,ultra-high-throughputprofilingoffungalcommunitiesJ.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2013,79(8):2519-2526.8QUASTC,PRUESSEE,YILMAZP,etal.TheSILVAribosomalRNAgenedatabaseproject:improveddataprocessingandweb-basedtoolsJ.NucleicAcidsResearch,2013,41(D1):D590-D596.9WANGQ,GARRITYGM,TIEDJEJM,etal.NaiveBayesianclassifierforrapidassignmentofrRNAsequencesintothenewbacterialtaxonomyJ.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2007,73(16):5261-5267.10SimpsonEH.MeasurementofDiversityJ.JournalofCardiothoracicandVascularAnesthesia,1997,11(6):812-812.11CHAOA.NonparametricestimationofthenumberofclassesinapopulationJ.ScandinavianJournalofStatistics,1984,11:265-270.12朱金山,张慧,马连杰,等.不同沼灌年限稻田土壤微生物群落分析J.环境科学,2018,39(5):2400-2411.13雷国平,代路,宋戈.黑龙江省典型黑土区土壤生态环境质量评价J.农业工程学报,2009,25(7):243-248.14张建嶺,赵永锋,陈哲.施用复合微生物肥对农田土壤水分、pH值的影响J.北京农业,2014(27):216.15宁川川,王建武,蔡昆争.有机肥对土壤肥力和土壤环境质量的影响研究进展J.生态环境学报,2016,25(1):175-181.16马祥,贾志锋,张永超,等.生物有机肥对青海高寒牧区燕麦产量和土壤肥力的影响J.草地学报,2019,27(6):1759-120青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI 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of Biofertilizer on Soil Microbial Communities in Wheat FieldsMiFakai,ZhaoZhimin,MaYonggui（1.AcademyofLifeScience,QinghaiNormalUniversity,Xining810008,China;2.KeyLab.ofMedicinalAnimalandPlantResourcesontheQinghai-TibetPlateau,Xining810008,China）Abstract:Usingthefieldexperiment,andcombinedwithhigh-throughputsequencingtechnology,thispaperexploredtheeffectsoftheapplicationofbiologicalbacterialfertilizeronsoilfertilityandmicrobialcommunitystructureofwheatfields.Theresultsshowedthatthemicrobialfertilizerincreasedthecontentsofsoilorganicmatter,totalnitrogen,totalphosphorus,alkali-hydrolyzednitrogenandavailablephosphorus,andreducedsoilpH.Atthesimilaritylevelof97%,3919OTUswereobtainedfrombacteriallibrarycluster,including37phyla,113classes,259orders,393families,701generaand1454species.Atotalof1203OTUswereobtainedfromthefungallibrarycluster,including13phyla,38classes,84orders,180families,369genera,and551species.Proteobacteria,ChloroflexiandAcidobacteriotawerethedominantstrainsinbacteria.ThedominantphylaoffungiareAscomycota,Mortierellomycota,andBasidiomycota.Toacertainextent,microbialfertilizerincreasedthediversityofbacterialandfungalcommunities,butdecreasedtherichnessofbacterialandfungalcommunities.ThisstudyprovidesascientificbasisforimprovingsoilenvironmentandpromotingagriculturalgreendevelopmentinQinghaiProvince.Keywords:Biologicalbacterialfertilizer;Chemicalfertilizer;High-throughputsequencing;Microbialcommunitystructure;Soilfertility