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水处理微生物学实验指导书

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市政与环境工程学院
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目 录

实验一 显微镜、 测微尺的使用及生物相的观察

实验二 革兰氏染色技术

实验三 培养基的配制和灭菌

实验四 水中细菌总数的测定

实验一 显微镜、 测微尺的使用及生物相的观察

一、 实验目的与要求
（1） 了解普通光学显微镜的构造与功能, 学习与掌握显微镜观察微生物的方法。
（2） 观察细菌、 放线菌和蓝细菌的个体形态, 学会绘制微生物的形态结构图。
二、 显微镜的基本结构和功能
普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成, 而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜一般能将物体放大1500— 倍。
( 一) 显微镜的构造
普通光学显微镜的构造可分为两大部分: 一为机械装置, 一为光学系统, 这两部分很好的配合, 才能发挥显微镜的作用。

1、 显微镜的机械装置
显微镜的机械装置包括镜座、 镜筒、 物镜转换器、 载物台、 推动器、 粗动螺旋、 微动螺旋等部件。
( 1) 镜座  镜座是显微镜的基本支架, 它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒, 它是用来安装光学放大系统部件的基础。
( 2) 镜筒  镜筒上接接目镜, 下接转换器, 形成接目镜与接物镜( 装在转换器下) 间的暗室。
从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化, 不但放大倍率随之变化, 而且成像质量也受到影响。因此, 使用显微镜时, 不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm, 此数字标在物镜的外壳上。
( 3) 物镜转换器  物镜转换器上可安装3—4个接物镜, 一般是三个接物镜( 低倍、 高倍、 油镜) 。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器, 能够按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通, 与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。
( 4) 载物台  载物台中央有一孔, 为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器, 其作用为固定或移动标本的位置, 使得镜检对象恰好位于视野中心。
( 5) 推动器  是移动标本的机械装置, 它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的, 好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺, 构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分, 在第一次检查时, 可记下纵横标尺的数值, 以后按数值移动推动器, 就能够找到原来标本的位置。
( 6) 粗动螺旋  粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件, 老式显微镜粗螺旋向前扭, 镜头下降接近标本。新近出产的显微镜( 如Nikon显微镜) 镜检时, 右手向前扭载物台上升, 让标本接近物镜, 反之则下降, 标本脱离物镜。
( 7) 微动螺旋  用粗动螺旋只能够粗放的调节焦距, 要得到最清晰的物象, 需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米( 100微米) 。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。
2、 显微镜的光学系统
显微镜的光学系统由反光镜, 聚光器, 接物镜, 接目镜等组成, 光学系统使物体放大, 形成物体放大像 。
( 1) 反光镜  较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体, 在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成, 能够将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央, 照明标本。不用聚光器时用凹面镜, 凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时, 一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有光源, 并有电流调节螺旋, 可经过调节电流大小调节光照强度。
( 2) 聚光器  聚光器在载物台下面, 它是由聚光透镜、 虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器, 明视场聚光器有阿贝聚光器、 齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出众差和球差。齐明聚光器对色差、 球差和慧差的校正程度很高, 是明视场镜检中质量最好的聚光器, 但它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜( 4×) 大视场照明的需要。
聚光器安装在载物台下, 其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上, 以得到最强的照明, 使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低能够调节, 使焦点落在被检物体上, 以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处, 而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此, 要求使用的载玻片厚度应在0.8—1.2mm之间, 否则被检样品不在焦点上, 影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈, 它能够开大和缩小, 影响着成像的分辨力和反差, 若将虹彩光圈开放过大, 超过物镜的数值孔径时, 便产生光斑; 若收缩虹彩光圈过小, 分辨力下降, 反差增大。因此, 在观察时, 经过虹彩光圈的调节再把视场光阑( 带有视场光阑的显微镜) 开启到视场周缘的外切处, 使不在视场内的物体得不到任何光线的照明, 以避免散射光的干扰。
( 3) 物镜  安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像, 物镜成像的质量, 对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径( numerical apeature简写为NA) , 每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上, 数值孔径越大, 物镜的性能越好。
物镜的种类很多, 可从不同角度来分类:
根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同, 可分为:
①干燥系物镜  以空气为介质, 如常见的40×以下的物镜, 数值孔径均小于1。
②油浸系物镜  常以香柏油为介质, 此物镜又叫油镜头, 其放大率为90×—100×, 数值孔值大于1。
根据物镜放大率的高低, 可分为:
①低倍物镜  指1×—6×, NA值为0.04—0.15;
②中倍物镜  指6×—25×, NA值为0.15— 0.40;
③高倍物镜  指25×—63×, NA值为0.35—0.95;
④油浸物镜  指90×—100×, NA值为1.25—1.40。
根据物镜像差校正的程度来分类可分为:
①消色差物镜  是最常见的物镜, 外壳上标有”Ach”字样, 该物镜能够除红光和青光形成的色差。镜检时一般与惠更斯目镜配合使用。
②复消色差物镜  物镜外壳上标有”Apo”字样, 除能校正红、 蓝、 绿三色光的色差外, 还能校正黄色光造成的相差, 一般与补偿目镜配合使用。
③特种物镜  在上述物镜基础上, 为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如: 带校正环物镜, 带视场光阑物镜, 相差物镜, 荧光物镜, 无应变物镜, 无罩物镜, 长工作距离物镜等。当前在研究中常见的物镜还有: 半复消色差物镜( FL) , 平场物镜(Plan), 平场复消色差物镜( Plan Apo) ,超平场物镜( Splan, 超平场复消色差物镜( Splan Apo) 等。
( 4) 目镜  目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次, 并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单, 普通光学显微镜的目镜一般由两块透镜组成, 上端的一块透镜称”接目镜”, 下端的透镜称”场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方, 装有由金属制的环状光阑或叫”视场光阑”, 物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处, 因此其上可安置目镜测微尺。
普通光学显微镜常见的目镜为惠更斯目镜( Huygens eyepiece) , 如要进行研究用时, 一般选用性能更好的目镜, 如补偿目镜( K) 、 平场目镜( P) 、 广视场目镜( WF) 。照相时选用照相目镜( NFK) 。
( 二) 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大是经过透镜来完成的, 单透镜成像具有像差, 影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜, 放大作用更好。
( 三) 显微镜的性能
显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高, 而且清晰, 物体放大后, 能否呈现清晰的细微结构, 首先取决于物镜的性能, 其次为目镜和聚光镜的性能。
1、 数值孔径 也叫做镜口率( 或开口率) , 简写为N.A, 在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径, 数值孔径是物镜和聚光器的主要参数, 也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系, 它与显微镜的分辨力成正比, 与焦深成反比, 与镜象亮度的平方根成正比。
数值孔径可用下式表示:
N.A=n.sin
α
2
式中:
n—物镜与标本之间的介质析射率
α—物镜的镜口角
所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。镜口角α总是小于180°。因为空气的折射率为1, 因此干燥物镜的数值孔径总是小于1, 一般为0.05—0.95; 油浸物镜如用香柏油( 折射率为1.515) 浸没, 则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率, 但实际上从透镜的制造技术看, 是不可能达到这一极限的。一般在实用范围内, 高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4。
几种物质的介质的折射率如下:
空气为1.0, 水为1.33, 玻璃为1.5, 甘油为1.47, 香柏油为1.52。
2、 分辨力
D可用下式表示:
D=λ/2N.A.
可见光的波长为0.4—0.7微米, 平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜, 则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到, 若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜, 则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个数值, 均能视见。由此可见, D值愈小, 分辨力愈高, 物象愈清楚。根据上式, 可经过: ( 1) 减低波长; ( 2) 增大折射率; ( 3) 加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。
3、 放大率:
显微镜放大物体, 首先经过物镜第一次放大造象, 目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此, 显微镜的放大率( V) 等于物镜放大率( V1) 和目镜放大率( V2) 的乘积, 即:
V=V1×V2
比较精确的计算方法, 可从下列公式求得
M=
△
×
D
F1
F2
F1=接物镜焦距, F2=接目镜焦距  △=光学筒长, D=明视距离( =250毫米)
△
=接物镜的放大倍数
D
=接目镜放大倍数
M=显微镜放大倍数
F1
F2
设△=160毫米   F1=4毫米  D=250毫米  F2=150毫米
则M=
△
×
D
=
160
×
250
=40×16.7=668倍
F1
F2
4
15

4、 焦深:
在显微镜下观察一个标本时, 焦点对在某一象面时, 物象最清晰, 这象面为目的面。在视野内除目的面外, 还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象, 这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比: 即数值孔径和放大率愈大, 焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细, 否则容易使物象滑过而找不到。
三、 实验器材
1. 显微镜、 擦镜纸等
2. 标本片
3. 香柏油、 二甲苯
四、 显微镜的使用操作及注意事项
显微镜结构精密, 使用时必须细心, 要按下述操作步骤进行。
( 一) 观察前的准备
1、 显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时, 要用右手紧握镜臂, 左手托住镜座, 平稳地将显微镜搬运到实验桌上。
2、 将显微镜放在自己身体的左前方, 离桌子边缘约10cm左右, 右侧可放记录本或绘图纸。
3、 调节光照 不带光源的显微镜, 可利用灯光或自然光经过反光镜来调节光照, 但不能用直射阳光, 直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。
将10×物镜转入光孔, 将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置, 用左眼观察目镜中视野的亮度, 转动反光镜, 使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时, 用平面反光镜, 光线较弱时, 用凹面反光镜。自带光源的显微镜, 可经过调节电流旋钮来调节光照强弱。
4、 调节光轴中心 显微镜在观察时, 其光学系统中的光源、 聚光器、 物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜, 先将光阑缩小, 用10×物镜观察, 在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像, 如此像不在视场中央, 可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央, 然后缓慢地将视场光阑打开, 能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接, 说明光线已经合轴。
切忌用单手拎提; 且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察, 以减少眼睛疲劳, 也便于边观察边绘图或记录。
( 二) 低倍镜观察  镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大, 易于发现目标和确定检查的位置。
将标本片放置在载物台上, 用标本夹夹住, 移动推动器, 使被观察的标本处在物镜正下方, 转动粗调节旋钮, 使物镜调至接近标本处, 用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒( 或下降载物台) , 直至物像出现, 再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片, 找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。
在任何时候使用粗调节器聚焦物像时, 必须养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本, 然后用目镜观察, 慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯, 以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。
( 三) 高倍镜观察  在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜, 低倍、 高倍镜头是同焦的, 在正常情况下, 高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜, 在转换物镜时要从侧面观察, 避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察, 调节光照, 使亮度适中, 缓慢调节粗调节旋钮, 使载物台上升( 或镜筒下降) , 直至物像出现, 再用细调节旋钮调至物像清晰为止, 找到需观察的部位, 并移至视野中央进行观察。
在一般情况下, 当物像在一种物镜中已清晰聚焦后, 转动物镜转换器将其它物镜转到工作位置进行观察时, 物像将保持基本准焦的状态, 这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象, 能够保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、 工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦, 从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。
( 四) 油镜观察  油浸物镜的工作距离( 指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离) 很短, 一般在0.2mm以内, 再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有”弹簧装置”, 因此使用油浸物镜时要特别细心, 避免由于”调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。
使用油镜按下列步骤操作:
1、 先用粗调节旋钮将镜筒提升( 或将载物台下降) 约2cm, 并将高倍镜转出。
2、 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
3、 从侧面注视, 用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升, ( 或镜筒下降) , 使油浸物镜浸入香柏油中, 使镜头几乎与标本接触。
4、 从接目镜内观察, 放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈( 带视场光阑油镜开大视场光阑) , 上调聚光器, 使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降( 或镜筒上升) , 当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象, 必须再从侧面观察, 重复上述操作。
有时按上述操作还找不到目的物, 则可能是由于油镜头下降还未到位, 或因油镜上升太快。以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况, 应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛, 或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。
5、 观察完毕, 下降载物台, 将油镜头转出, 先用擦镜纸擦去镜头上的油, 再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液( 乙醚2份, 纯酒精3份) 或二甲苯, 擦去镜头上残留油迹, 最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可, ( 注意向一个方向擦拭) 。
6、 将各部分还原, 转动物镜转换器, 使物镜头不与载物台通光孔相对, 而是成八字形位置, 再将镜筒下降至最低, 降下聚光器, 反光镜与聚光器垂直, 用一个干净手帕将接目镜罩好, 以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分, 然后将显微镜放回柜内或镜箱中。
7、 有菌的玻片置消毒缸中, 清洗、 晾干后备用。
五、 微生物大小测定
微生物细胞的大小, 是微生物重要的形态特征之一, 也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、 只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺( 图20-1) 是一块圆形玻片, 在玻片中央把5mm长度刻成50等分, 或把10 mm长度刻成100等分。测量时, 将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、 物镜组合的放大倍数不相同, 目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样, 因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正, 以求出在一定放大倍数下, 目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺( 图20-2) 是中央部分刻有精确等分线的载玻片, 一般将lmm等分为100格, 每格长l0μm( 即0.0lmm) , 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时, 将镜台测微尺放在载物台上。

图 20-1目镜测微尺

由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置, 都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野, 即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大, 因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小, 因此用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺, 即可求出目镜测微尺每格所代表的长度, 然后移去镜台测微尺, 换上待测标本片, 用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。

六、 实验报告
1、 结果
分别绘出你在低倍镜、 高倍镜和油镜下观察到的标本片的形态, 包括在三种情况下视野中的变化, 同时注明物镜放大倍数和总放大率。
2、 思考题
(1)用油镜观察时应注意哪些问题?在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用?
(2)试列表比较低倍镜、 高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作?
(3)什么是物镜的同焦现象?它在显微镜观察中有什么意义?
(4)影响显微镜分辨率的因素有哪些?
(5)根据你的实验体会, 谈谈应如何根据所观察微生物的大小, 选择不同的物镜进行有效的观察。

实验二 革兰氏染色技术
一、 实验目的
学习微生物染色的基本技术, 掌握微生物的革兰氏染色方法。
二、 实验原理
革兰氏染色是细菌学中极为重要的鉴别染色法。其原理主要是因为细菌细胞壁结构的差异, 导致对结晶紫—碘复合物的渗透性不同, 产生革兰氏反应呈现出阴性或阳性。由此经过革兰氏染色可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌( G＋) 和革兰氏阴性菌( G－) 两个类。
若菌体被结晶紫初染时, 染上的紫色不被酒精脱色者为G＋菌; 若被酒精脱色, 而复染上红色者为G－菌。经过该染色法也能够观察细菌个体形状、 排列、 芽孢有无及其形状、 大小和着色位置等。
三、 实验内容
1.染色剂
⑴赫克尔氏结晶紫液
甲液: 结晶紫 2g 乙液: 草酸铵 0.8g
乙醇( 95%) 20ml 蒸馏水 80ml
将甲、 乙两液混合, 静置48小时后使用。该染液较稳定, 在不透气的棕色瓶中可储存数月。
⑵卢哥氏碘液
碘片: 1.0g 碘化钾: 2.0 g 蒸馏水: 300ml
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中, 再放入碘片, 待碘片全溶后, 加水至300 ml。此液稳定, 在不透气的棕色瓶中可存数月。
⑶脱色液: 95%的乙醇。
⑷复染液: 即0.5%番红水溶液。
番红(safranine, 又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL
取2.5%番红( 又称沙黄) 的酒精溶液20 ml, 蒸馏水80 ml。
2.操作步骤
⑴涂片。取适宜的细菌涂片, 涂片时要使菌体薄而均匀, 否则菌体群集会呈现假阳性。
⑵干燥和固定。自然风干或微热促其干燥, 然后在火焰上经过1～2次, 以固定涂片。
⑶初染。滴加结晶紫液, 覆盖约1分钟。用水冲净结晶紫液。
⑷媒染。滴加碘液冲去残水, 并覆盖约1分钟。用水冲去碘液, 将载玻片上水甩净或用滤纸吸干。
⑸脱色。将载玻片倾斜, 并衬以白背景, 流滴95%乙醇约20～30秒, 立即用水冲净乙醇。
⑹复染。用番红液1～2分钟, 使已脱色的细胞重新着色, 便于鉴别观察。水洗、 待干, 镜检。
⑺镜检。用油镜观察单独分散的菌体, 菌体呈蓝紫者为G＋, 红色者为G-。
四、 结论
实验是否成功, 结果如何? 不成功原因是什么?
五、 问题
1.革兰氏染色的基本原理是什么?
2.大肠杆菌和枯草芽孢杆菌经革兰氏染色后各有什么结果?
3.结晶紫染色时间不够或染色时间过久会对结果有何影响?
4.革兰氏染色在微生物学中有何实践意义?

实验三 培养基的配制和灭菌

一、 实验目的与要求:
（1） 熟悉玻璃器皿的洗涤包装和灭菌前的准备工作。
（2） 学习微生物培养基和无菌水的制备, 了解培养基配方中各成分的作用、 制备流程及各环节的操作技术与应用。
（3） 学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、 操作关键技术和灭菌技术。
二、 实验原理
培养基的制备原理
培养基是按照微生物生长发育的需要, 用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的, 在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中, 就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中, 微生物种类繁多, 由于微生物具有不同的营养类型, 对营养物质的要求也各不相同, 加之实验和研究上的目的不同, 因此培养基在组成原料上也各有差异。可是, 不同种类和不同组成的培养基中, 均应含有满足微生物生长发育的水分、 碳源、 氮源、 无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。另外, 培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。
根据制备培养基对所选用的营养物质的来源, 可将培养基分为天然培养基、 半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的, 可将培养基分为选择培养基、 加富培养基及鉴别培养基等。
培养基的类型和种类是多种多样的, 必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制, 本实验分别配制常见培养细菌、 放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、 高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。
固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的, 常见的凝固剂有琼脂、 明胶和硅酸钠, 其中以琼脂最为常见, 其主要成份为多糖类物质, 性质较稳定, 一般微生物不能分解, 故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化, 融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态。
高压蒸气灭菌原理
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内, 经过加热, 使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽, 然后关闭排气阀, 继续加热, 此时由于蒸汽不能溢出, 而增加了灭菌器内的压力, 从而使沸点增高, 得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下, 湿热的杀菌效力比干热大, 其原因有三: 一是湿热中细菌菌体吸收水分, 蛋白质较易凝固, 因蛋白质含水量增加, 所需凝固温度降低(表Ⅴ-2), 二是湿热的穿透力比干热大(表Ⅴ-3); 三是湿热的蒸汽有潜热存在, 每1克水在100℃时, 由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热, 能迅速提高被灭菌物体的温度, 从而增加灭菌效力

表Ⅴ-2 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
卵自蛋白含水量(%)
30分钟内凝固所需温度(℃)
50
25
18
6
0
56
74-80
80-90
145
160-170
表Ⅴ-3 干热与湿热穿透力及灭菌效果比较
温 度 (℃)
时间(小时)
透过布层的温度(℃)
灭 菌
20层
40层
100层
干热 130-140
4
86
72
70.5
不完全
湿热 105.3
3
10l
10l
10l
完 全
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时, 灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要, 因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压, 因此, 当水蒸汽中含有空气时, 在同一压力下, 含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时, 压力与温度的关系见表Ⅴ-4。一般培养基用1.05kg/cm2, 121.3℃ 15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2), 112.6℃灭菌15分钟, 但为了保证效果, 可将其它成分先行121.3℃, 20分钟灭菌, 然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2, 121.3℃灭菌20分钟即可, 而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟。
表Ⅴ-4灭菌锅内留有不同分量空气时, 压力与温度的关系
压 力 数
全部空气排出时的温度 (℃)
2/3空气排出时的温度
(℃)
l/2空气排出时的温度 (℃)
1/3空气排出时的温度 (℃)
空气全不排出时的温度 (℃)
千克
(公斤/ 厘米2)
(kg/cm2)
磅/英寸2
(1b/in2)
0.35
0.70
1.05
1.40
1.75
2.10
5
10
15
20
25
30
108.8
115.6
121.3
126.2
130.0
134.6
100
109
115
121
126
130
94
105
112
118
124
128
90
100
109
115
121
126
72
90
100
109
115
121

蒸汽压力所用单位为kg/cm2(千克/厘米2), 它与1b/in2(磅/英寸2)和温度的换算关系见表Ⅴ-5。
表Ⅴ-5 蒸汽压力与蒸汽温度换算关系
蒸汽压力

大气压
压 力 表 读 数
蒸汽温度
kg/cm2
1b/in2
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.50
3.00
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.50
2.00
0.00
3.75
7.50
11.25
15.00
22.50
30.00
100.0
107.0
112.0
115.0
121.0
128.0
134.5

三、 实验器材
1、   药品 琼脂, 10％HCL,10% NaOH, 牛肉膏蛋白胨培养基的配方药品;
2、   材料 具刻度1000毫升塘瓷盅或小铝锅, 电子称, 10×200mm试管, 量筒, 小烧杯, 玻璃棒, 骨匙, pH试纸, 分装漏斗, 试管盒, 纱布, 棉花, 报纸, 麻绳, 标签, 培养皿。
3、 设备 高压蒸汽灭菌锅、 烘箱、 冰箱、 电炉等

四、 实验步骤
1、 称取药品放在大烧杯中, 加入蒸馏水用玻璃棒搅拌并加热溶化, 等药品溶解后用pH试纸调节p H至7.4-7.6, 如有沉淀应过滤后分装, 每支试管约加入9ml。每组分装30支, 加上棉塞, 包上牛皮纸, 准备灭菌。
装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5, 装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中, 应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、 以免弄湿棉塞, 造成污染。
2、 无菌水准备
在试管或瓶内先盛以适量的蒸馏水〔或生理盐水O．85％NaCl), 盖好棉塞, 包上牛皮纸使其灭菌后, 其水量恰为9ml。 每组准备10支与牛肉膏蛋白胨培养基可放在同一试管架上, 以一大张牛皮纸包扎写上姓名。准备灭菌。
3、 高压灭菌
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤:
( 1) 首先将内层灭菌桶取出, 再向外层锅内加入适量的水, 使水面与三角搁架相平为宜。
( 2) 放回灭菌桶, 并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤, 以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触, 以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
( 3) 加盖, 并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相正确两个螺栓, 使螺栓松紧一致, 勿使漏气。
( 4) 用电炉或煤气加热, 并同时打开排气阀, 使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后, 关上排气阀, 让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时, 控制热源, 维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2, 121.3℃, 20分钟灭菌。
( 5) 灭菌所需时间到后, 切断电源或关闭煤气, 让灭菌锅内温度自然下降, 当压力表的压力降至0时, 打开排气阀, 旋松螺栓, 打开盖子, 取出灭菌物品。如果压力未降到0时, 打开排气阀, 就会因锅内压力突然下降, 使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口, 造成棉塞沾染培养基而发生污染。
( 6) 将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时, 经检查若无杂菌生长, 即可待用。
五、 思考题
棉塞的作用?

实验四 水中细菌总数的测定

一、 实验目的
1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2.了解水源水的平板菌落计数的原理。

二、 实验原理
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多, 它们对营养和其它生长条件的要求差别很大, 不可能找到一种培养基在一种条件下, 使水中所有的细菌均能生长繁殖, 因此, 以一定的培养基平板上生长出来的菌落, 计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。当前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
三、 试剂与器材
1.试剂 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基, 灭菌水
牛肉膏 3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml( 配置1/4量)
2.器材 灭菌三角瓶, 灭菌的带玻璃塞瓶, 灭菌培养皿, 灭菌吸管, 灭菌试管等。
四、 实验内容
细菌总数是指1ml或1g检样中所含细菌菌落的总数, 所用的方法是稀释平板计数法, 由于计算的是平板上形成的菌落数, 它反应的是检样中的活菌的数量。
用肉眼观察, 计平板上的细菌菌落数, 必要时可用放大镜和菌落计数器计数, 以防遗漏。若同一稀释中一个培养皿有较大片状菌落生长时, 则不宜采用, 而应以无片状菌落生长的培养皿作为该稀释度的菌落计数。若片状菌落数只是分布在培养皿的一侧区域, 而另一半区域中的菌落分布均匀, 则可计算半个培养皿的菌落数乘以2来代表全皿的数值。对于相互间距离很近, 对虽紧密接触但特征不同的菌落, 也应全部计数。各种不同情况的计算方法如下:
1.首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算, 当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时, 则以该平均菌落数乘以其稀释倍数报告之。
2.若有两个稀释度, 其平均菌落均在30～300之间, 则按两者之菌落总数之比值来决定, 若其比值小于2应报告两者之平均数, 若大于2则报告其中较小的菌落数。
3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300, 则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30, 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间, 则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
6.菌落计数的报告。菌落数在100以内时按实有数报告, 大于100时, 采用两位有效数字, 在两位有效数字后面的位数, 以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数, 可用10的指数来表示。在报告菌落数为”无法计数”时, 应注明水样的稀释倍数。
( 一) 培养基的配制
按实验三中培养基的配制方法配制培养基。
( 二) 水样的采集与保藏
先将自来水水龙头用酒精灯灼烧3分钟, 再放水5分钟后, 在酒精灯旁打开已灭菌的水样瓶瓶盖, 接取水样, 盖上瓶盖迅速送回实验室。
( 三) 细菌总数的测定
按照无菌操作规则, 用无菌移液管吸取1ml, 充分混匀的水样注入无菌培养皿中, 倾注约15ml已融化并冷却至45℃左右的营养琼脂培养基, 平放于桌上迅速旋摇培养皿, 使水样与培养基充分混匀, 冷却后成平板。每个水样倒入3个平板。另取一个无菌培养皿倒入培养基冷凝成平板作空白对照。将以上所有平板倒置于37℃恒温内培养24小时, 记菌落数。3个平板上长的菌落总数的平均值即为1ml水样中的细菌总数。
五、 关键步骤及注意事项
注意全过程防止染菌
六、 思考题
1、 从自来水的细菌总数结果来看, 是否合乎饮用水的标准?
2. 测定水中细菌菌落总数有什么实际意义?
3. 中国饮用水水质标准是什么? , 讨论你这次的检验结果。

水处理微生物学实验报告

班 级
姓 名
学 号

市政与环境工程学院
年 月

显微镜的使用及生物相的观察实验报告
报告人姓名
专业、 班级

一、 实验的目的要求:

二、 实验原理

三、 主要仪器规格及试剂用量

四、 实验步骤及方法