环境工程微生物学实验指导(1.12修改)(1).doc

环境工程微生物学实验指导

西北师大地环学院环境科学与工程系
巨天珍教授

环境工程微生物学实验指导书

授课对象：环境科学专业 课程类型：必修

学时数： 36学时 学分数： 2

先修课程：环境工程，水污染控制工程。

基本要求：
1、 课前预习 了解清楚实验的目的、原理和试验内容，需测试项目的测试方法，实验中应注意的问题并于实验前提交预习报告。
2、 实验操作 实验前要熟悉实验设备，了解操作要点，实验中严格按操作要求认真操作，仔细观察实验现象，精心测定和详细记录实验数据。
3、 实验数据整理 通过实验取得大量数据后，必须对数据进行科学地分析整理，去伪存真，去粗存精，以得到正确、可靠的结果。（这一部分往往被忽视，应重视对实验结果的分析，引导学生查阅文献，进一步验证实验过程的可靠性，激发学生对未知规律探索的兴趣）
实验项目总表
实验项目名称
项目类别
项目类型
项目学时数
培养基的制备及灭菌
基础性
必做
2
微生物形态观察
（菌落特征的观察）
基础性
必做
4
细菌的简单染色
基础性
必做
4
革兰氏染色法
基础性
必做
4
土壤微生物的检测
综合性
必做
8
水质的细菌学检测
设计性
必做
4
空气微生物的检测
设计性
选做
4
植物基因组DNA的小量提取方法
综合性
必做
2
聚合酶链式反应（PCR）
综合性
必做
2
DNA琼脂糖凝胶电泳
综合性
必做
4
实时荧光定量PCR的使用
综合性
必做
2

目 录
实验须知 1
实验1 培养基的制备与灭菌 2
实验2 微生物的形态观察 4
实验3 细菌的简单染色 6
实验4 革兰氏染色法 9
实验5 土壤微生物的检测 11
实验6 水质的细菌学检测 16
＊实验7 空气微生物的检测 20
实验8 植物基因组DNA的小量提取方法 22
实验9 聚合酶链式反应（PCR） 24
实验10 DNA琼脂糖凝胶电泳 26
实验11 实时荧光定量PCR的使用 28
参考文献 29
附录1 常用玻璃器皿的洗涤与包扎 30
附录2 普通光学显微镜的使用 34
附录3 相差显微镜 38
附录4 菌种的保藏 40
附录5 培养基配方 42
附录6 几种主要染色液的配制 44
附录7 常用试剂、溶液的配制 45

46

实验须知

普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成事实求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。
在微生物学实验过程中，学生和老师会经常接触水电、病原微生物以及其他危险品。为了保证安全，规范操作，勤俭节约，特提出如下注意事项。
1.实验前的准备
（1）为了保证实验室的整洁和实验顺利进行，非必要的物品包括书包，请勿带入室内。
（2）准备好实验工作服和必要的实验用具、留头发者须将头发扎起，做好必要的清洁工作。
（3）实验前必须预习实验内并做好预习报告，了解实验目的、原理和方法，做到心中有数，思路清晰。
（4）按实验要求准备好培养基、菌种和必要的试剂。
2．实验过程中的注意事项
（1）实验室内严禁饮食和吸烟。实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。
（2）一切易燃品，如乙醇、乙醚、丙酮等，应远离火源，不可将酒精灯倾向另一酒精灯引火。电炉、煤气等用完后应立即关灭。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。
（3）实验小心仔细，操作严格谨慎，预防感染。用过的棉球、纱布等污物，放在固定容器中，统一处理，不得随意抛弃。如不慎将菌液洒到桌面或地面，应以5%石碳酸溶液或3%来苏尔溶液覆盖0.5小时才能擦去。如不慎将菌液吸入口中或皮肤破伤处或烫伤，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。
（4）实验进行培养的材料，应注明组别、名称及处理方法，放于教师的地点进行培养。
（5）认真、及时做好实验记录，不可潦草应付。对于连续观察的实验，则需记下每次观察的时间、现象和结果。
（6）实验室中各物均应摆放一定位置，工作完后放回原处或指定地点。
（7）使用显微镜等仪器时，要求细心操作，按操作规程工作、保养，避免不必要的损耗和意外。金属器皿用完消毒后，应立即擦干，防治生锈。
（8）使用药品、试剂、染色剂、镜油、擦镜纸、玻璃器皿等消耗品要力求节约。
3．实验结束后的注意事项
（1）实验完毕后，必须把所有仪器擦净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，对有菌液污染的地方进行必要的消毒，并用肥皂洗净自身的手。
（2）菌种或种毒不得带出实验室，若要索取，应严格按照规章办理，其他物品未经教师许可也不得带出实验室。
（3）离实验室前注意关闭火、煤气、门窗、灯等。最后一人离开实验室前，应检查一遍水、电、煤气，关好门窗。
（4）每次实验结果，应以实事求是的态度填写实验报告，及时交给指导教师进行批阅。

实验1 培养基的制备与灭菌
目的要求
1．学生熟悉玻璃器皿洗涤和灭菌前的准备工作。
2．掌握培养基和无菌水的制备方法。
3．了解高压蒸汽灭菌的原理及应用范围。
4．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。
5．了解干热灭菌和紫外线灭菌。
6．区别消毒与灭菌。
一、实验原理
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
干热灭菌、高压蒸气灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。高压蒸气灭菌时，将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过持续加热，使水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不外逸，容器内气压上升，水的沸点随之提高，得到高于100℃的温度。这样，导致菌体蛋白质能故变性，从而达到灭菌的目的。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需要的温度高（160-170℃），时间长（1-2h）。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长200-300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌能力最强。紫外线穿透力不大，一般只适用于无菌室、接种箱及物体表面的灭菌。
消毒与灭菌的区别。消毒只要求清除致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病，灭菌不仅要求清除致病微生物，还要求将所有微生物全部清除，包括非致病微生物。
二、实验器材
高压蒸气灭菌锅、试管、培养皿等。
三、实验内容
1．培养基的制备
培养基是微生物的繁殖基地，通常根据微生物生长繁殖所需的各种营养物配制而成，培养基的制备过程如下：
（1）称量：一般可用1/100粗天平称量配置培养基所需要的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进行准确称量。
（2）溶化：将烧杯中先加少量水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水），体积约为所需体积的2/3，然后将称量好的药品依次加入该烧杯中。
（3）定容：待药品全部溶解后，加水至所需体积。
（4）调PH值：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如加入培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液进行调节。
2．平板的制作
将装在锥形瓶的已灭菌的培养基溶化后，待冷却至50℃左右倾入无菌的培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多，温度低于50℃时，培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应在火旁前进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一个缝，至瓶口正好伸入，倾入12ml左右的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平板中，冷凝后即成平板。
3．培养基的无菌检查
灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。把制好的平板置于37℃恒温箱中培养1-2天，确定无菌后方可使用。
4．无菌水的制备
在每个250ml的锥形瓶内装99ml的蒸馏水并塞上棉塞。再棉塞上包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，0.1MPa灭菌20min。
5．高压蒸气灭菌锅的使用
（1）将内层锅取出，再向外层锅加入适量的水，是水面与三角搁架相平为宜。
注意：切勿忘记加水或加水量太少，以防炸裂事故。
（2）放回内层锅，并装入待灭菌物品
注意：不要装的太挤，以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，务使漏气。
（4）加热，并同时打开排气阀。当蒸气猛烈向外冲时，一般认为冷空气已排除，关闭排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa,121℃,20min灭菌。
注意：灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内冷空气必须排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
（5）灭菌所需时间到后，关闭热源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
注意：压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
（6）将取出的灭菌培养基放入37℃培养箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
四、实验报告
1．结果
检查培养基灭菌是否彻底。
2．讨论
（1）高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降至“0”时才能打开排气阀，开盖取物？
（2）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？

实验2 微生物的形态观察
目的要求
1、观察细菌、真菌、放线菌的菌落特征。
2、学习环境中的微生物的检查方法，并加深对微生物分布广泛性的认识。
一、基本原理
微生物经稀释分离或划线分离接种在固体培养基上，在适宜的培养条件下，单个菌体经生长繁殖，在固体表面形成的菌落具有一定的特征。
细菌菌落特征：大多数表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地和颜色均匀、多样，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性等直接相关，细菌菌落特征是辨认、鉴定菌种的重要依据之一。
放线菌的菌落特征：放线菌的菌落在培养基上着生牢固，与基质结合紧密。放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，纤细的菌丝分为在培养基内部的基内菌丝和伸出培养基表面的气生菌丝。气生菌丝上部分还有孢子丝，呈螺旋状、波浪状，或分枝状等，其着生形式也有所不同，菌丝呈各种颜色。孢子丝长出孢子，由于大量孢子的存在，菌落表面呈现干粉状。
真菌的菌落特征：菌落形态较大，质地较疏松，颜色各异。
二、实验器材
1．菌种
大肠杆菌、青色链霉菌、酵母菌等。
2．其他用具
培养皿、盖玻片、载玻片、镜台测微尺等。
三、实验内容
1．细菌形态观察
注意观察菌落的形状，高度、大小、颜色，是否湿润，光泽、透明度、边缘状况等等。（图4-1）细菌、真菌、放线菌的菌落特征。认识菌落。

A、菌落的形态及边缘：（1）圆形，边缘整齐；（2）不规则状；（3）边缘波浪状；（4）边缘锯齿状；
（5）同心圆状；（6）边缘缺刻状；（7）丝状；（8）褶皱凸面

B、菌落的表面形态：（1）扁平、扩展；（2）低凸面；（3）高凸面；（4）台状；（5）脐状；（6）凸脐状；
（7）乳头状；（8）褶皱凸面
图4-1 细菌的菌落特征

2．真菌形态观察
（1）生长速度：培养一定天数后测量菌落直径，分生长极慢、慢、中等、快四级。
（2）菌落的颜色：分别记载菌落表面和底部菌丝的颜色和菌落背面的颜色极其变化。
（3）菌落的表面：平滑或有皱纹，致密或疏松，有无同心环或辐射状沟纹等。
（4）菌落的结构：菌落外观似毡状、簇生或束状、羊毛状、绳索状、粉粒状、明胶状或皮革状等。
（5）菌落的边缘：全缘、锯齿状、树枝状、纤毛状等。
（6）菌落的高度：菌落扁平、丘状隆起、陷没、菌种中性能部分凸起或凹陷。
（7）培养基颜色的变化：颜色的变化包括菌丝覆盖部分及扩散到菌落以外的部分。
（8）渗出物：有的真菌菌落表面渗出滴液，记载有无滴液渗出，数量多少及颜色。
（9）气味：无味、霉味、土味、芳香味等。
四、实验报告
1．结果

细菌
放线菌
真菌
菌落特征

2．讨论
细菌、真菌菌落特征如何区别？

实验3 细菌的简单染色
目的要求
1、掌握细菌的涂片与染色技术。
2、初步认识细菌的形态特征。
3、学习无菌操作技术、巩固显微镜特别是油镜的使用技术。
一、基本原理
细菌的形态结构是分类的重要依据。细菌的基本形态主要可以分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类。细菌个体微小，且较透明，通过对细菌染色，使细菌与背景形成明显的对比，以便于显微镜观察。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为3种类型，即简单染色、革兰氏染色和特殊染色。
细菌的简单染色法是利用单一染料使细菌着色的染色方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，如石炭酸复红、结晶或美蓝等，这是因为在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更容易识别。
二、实验器材
1．菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
2．染色剂
草酸铵结晶紫染液。
3．仪器及其他用具
显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油）、擦镜纸、滤纸等。
三、实验内容
整个细菌标本制作及染色过程（图5-1）

图5-1 细菌标本制作及染色过程

1．涂片
取洁净的载玻片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位加一滴蒸馏水（或生理盐水）于载玻片中央，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合（无菌操作），烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成均匀薄层。制片是染色的关键。
注意：载玻片要洁净无油迹，滴水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚，以避免造成菌体重叠。
2．干燥
涂片后，室温自然干燥。
3．固定
将已干燥的涂片标本向上，在微火上通过3-4次进行固定。固定的作用为：（1）杀死细菌;（2）将菌体的蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载玻片上，染色时不被水或染液冲掉；（3）增加菌体对染料的结合力，使涂片容易着色。
注意：热固定温度不宜过高，以玻片不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4．染色
在涂片处滴加草酸铵结晶紫溶液1-2滴，使其布满涂菌部分，染色1min.。
5．冲洗
斜置载玻片，倾去染液。用自来水轻轻冲去染液，直至从玻片流下的水无色为止。
注意：不要直接冲洗涂面，应使水从玻片的一端流下。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
6．吸干
自然干燥，也可用吸水纸轻轻吸去载片上的水分，干燥后镜检。见图4-1
7．镜检
先用低倍镜和高倍镜观察，然后用油镜观察。
注意：必须待涂片完全干燥后才能用油镜观察。

四、实验报告
1．结果
细菌名称
大肠杆菌
枯草芽孢杆菌
金黄色葡萄球菌
细菌形态图

2．讨论
（1）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果温度过高、时间过久，又会怎么样呢？
（2）为什么必须待涂片完全干燥后才能用油镜观察？

实验4 革兰氏染色法
目的要求
1．掌握革兰氏染色法及其原理。
2．了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
一、基本原理
革兰氏染色原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此染色法，可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏染色过程所用的四种不同溶液的作用：1、碱性染料：草酸铵结晶紫液。2、媒染剂：碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力，加强染料与细胞的结合。3、脱色剂：乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色。4、复染液：蕃红溶液，目的是经脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色的菌进行比较。
革兰氏染色有着重要的理论与实践意义，其染色原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构不同。用结晶紫初染，所有细菌都被染成了蓝紫色。碘作为媒染剂，可与结晶紫在细胞内形成分子较大的复合物。当用乙醇脱色时，由于革兰氏阳性菌细胞壁具有比较厚的肽聚糖层，类脂质含量低，细胞壁脱水使肽聚糖层得网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，复染后仍保留初染剂的蓝紫色。而革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高。类脂被乙醇溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使结晶紫与碘的复合物被洗脱出来，复染后，细胞被染上复染剂的红色。
二、实验器材
1．菌种
大肠杆菌营养琼脂斜面培养物、枯草杆菌营养琼脂斜面培养物
2．染色剂
革兰染色液
3．其他用具
显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、香柏油、擦镜纸、蒸馏水等
三、实验步骤
1．涂片
取大肠杆菌、枯草杆菌制成涂片，干燥，固定。
2．染色
用草酸结晶紫染液染色min，用水冲洗。
3．煤染
滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟，用水冲去碘液。
4．脱色
斜置载片于一烧杯上，滴加95%乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止(约0.5min)。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。
注意：脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌，而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。
5．复染
蕃红染液复染1分钟，水洗。
6．吸干并镜检
四、实验报告
1．结果

大肠杆菌
枯草杆菌
颜色

性质

2．讨论
（1）在乙醇脱色之后和复染之前这一阶段，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
（2）你认为革兰染色中，哪一步可以省去而不影响最终结果？
（3）你的染得结果是否正确？如果不正确，请说明原因.

实验5 土壤微生物的检测
目的要求
1．学习和掌握细菌、放线菌和真菌的稀释分离、划线分离等技术。
2．学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3．学习和掌握平板菌落计数的基本原理和技术方法。
一、基本原理
在自然界中，微生物几乎都是混杂地生活在一起，为了使我们能够从混杂的微生物群体中获得我们所需要的菌株，必须掌握有效的分离技术。由于土壤中含有丰富的微生物所需要的养料，酸碱度也接近中性，空气含量也能满足其需要，所以土壤是微生物天然的培养基，土壤中微生物的数量和种类都是极其丰富的。因此土壤是发掘微生物资源的重要基地，也可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的工程称为微生物的分离和纯化。常用的方法有涂布平板分离法和平板划线分离法等，其基本原理都是：
（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。（2）把样品中的细胞一个一个地单独分散开来，让每一个单独分开的细胞增殖，各形成一个单独的菌落。然后采用适当的方法，把某一个我们感兴趣的单菌落选取出来，以得到纯种的微生物。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。微生物的分离与纯化一般需要使用固体培养基。
一个微生物细胞可以形成一个菌落。将微生物样品经适量的稀释使其接种到平板成为一个一个的单细胞，由灭个单细胞繁殖而形成的菌落的数量就反映了样品中微生物的数量。由于微生物样品往往不易完全分散，有可能一个单菌落来自样品中的2-3或更多细胞，因此平板菌落计数的结构往往偏低。
平板菌落计数法虽然操作较繁，速度慢，对成团的细胞不能准确计数，营养和培养条件对结果又明显的影响。但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，还可用于菌种纯化，菌种等方面，所以仍然被广泛应用。
每克含菌样品中微生物的活细胞数=同一稀释度的3个平板菌落平均数×稀释倍数÷含菌样品克数

二、实验器材
1．土样
选定采土地点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境和日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，尽量减少其中的菌相的变化。
2．培养基
牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成1号培养基。
3．溶液和其他试剂
盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。
4．仪器及其他用具
无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、试管等。
三、实验内容
1．涂布平板分离法
（1）倒平板
将牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成1号培养基加热溶化。待45-50℃时，高氏合成1号培养基加入10%酚数滴，马丁氏培养基中加入链霉素溶液，混匀后分别倒平板。每种培养皿倒三皿，每皿倒10-15ml，水平放置，凝固待用。
（2）制备土壤悬液
称入土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，再震摇约30min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀释度的土壤溶液。（图7-1）

图7-1 不同稀释度的土壤溶液
（3）涂布平板
接种之前应大概估计到每克土壤中含有的菌数，也就是要选择适合的稀释的浓度(最好是通过预备试验确定)。要求每皿有细菌30-300个菌落，放线菌每40-400个菌落，真菌每皿20-60个菌落为宜。各菌类的稀释度可参照下表：
类别
培养基
测定时间
（天）
稀释度
接种方法及接种量
细菌
牛肉膏蛋白胨培养基
3天
10-5、10-6、10-7
0.1ml涂抹法
放线菌
改良高氏一号培养基
5-7天
10-2、10-3、10-4
0.1ml涂抹法
真菌
虎红琼脂培养基
3-5天
10-2、10-3、10-4
0.1ml涂抹法
固氮菌
阿须贝氏培养基
5-7天
10-2、10-3、10-4
0.1ml涂抹法
解P菌
有机P培养基
5-7天
10-4、10-5
0.1ml涂抹法
解K菌
解K菌培养基
5-7天
10-3、10-4
0.1ml涂抹法
纤维素分解菌
赫其逊氏（Hutchinson）培养基
两周左右
10-1、10-2
0.1ml涂抹法

平板涂布方法：将0.1ml菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置（0.1ml的菌液要全滴在培养基上，若移液管尖端有剩余的，需将移液管在培养基表面上轻轻地按一下便可）。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一条直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。

图7-2 平板涂布

1.从包装纸套种取出无菌移液管；2.安装橡皮头，勿使触摸移液管；3.火焰旁取出土壤悬液；4.灼烧试管口及移液管口；5.在火焰旁对试管中土壤悬液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从最小稀释度开始，将稀释液加入到无菌培养皿中；8.将溶化冷却至45°-50°C培养基到入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤

（4）培养
牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养1-2天，马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3-5天，高氏合成培养基平板倒置于28℃温室中培养5-7天。
（5）挑菌落
将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
2．平板划线分离法（操作如图7-3）
（1）倒平板
制备方法与上述所作相同，但划线用的平板培养基宜硬一些并稍厚。
（2）划线
将欲分离纯化的菌种通过无菌操作方式用接种环划线接种在培养皿内琼脂培养基平板上，称之为划线。在靠近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，将欲分离纯化的菌种在平板上划线。常用的划线方法有两种
A、分区划线法：（四分区划线法）
取菌、接种、培养方法与连续划线法相同。分区划线分离时平板分四个区，其中第四区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60-70度，右手把接种环上多余菌烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区做第二次平行划线。同样依次在3、4区划线，划线完毕，灼烧接种环，关上盖皿。
B、连续划线法：
在无菌操台中，用接种环直接取平板上带分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌体。将接种后再次通过少打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻的划线，划线时平板面应与接种环面成30-40度，以手腕的力量在平板上轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，.划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷凉后放置在接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养，培养后在划线平板上观察划线处长出的菌落形态，涂布镜检为纯种后再接种到斜面。
注意：用接种环边缘划线，划线要细，不可划破培养基。

图7-3 平板划线分离法
（3）培养
同涂布平板分离法
（4）挑菌落
同涂布平板分离法
3．平板菌落计数
（1）先数出每个培养皿的菌落数，然后求出同一稀释浓度各皿的菌数。若有片状菌落在平板上生长超过一半时，则应弃去不算，若片状菌落不到一半，而另菌落生长较匀，可以计数另一半的菌落数，再乘以二即代表该平板的菌落数。
（2）若所有稀释浓度平板上菌落数均小于30，应以最小稀释浓度平板上菌数乘以稀释倍数为准。
（3）若所有平板上菌落数均不在30-300之间，其中有的小于30，有的大于300，应选最接近30-300之间的数为准。
四、实验报告
1．结果
（1）将微生物三大类菌的分离方法及培养条件填入下表。
微生物三大类菌的分离方法及培养条件
分离对象
样品来源
分离方法
稀释度
培养基
培养温度
培养时间
细菌
放线菌
霉菌
土壤
土壤
土壤

（2）将你所分离的微生物平板菌落计数结果填入表中。
平均每克样品所含微生物数
皿
每皿长出菌落数
每克样品所含菌数
10（-）
10（-）
10（-）
10（-）
10（-）
10（-）
第1皿

第2皿

第3皿

均 值

2．讨论
（1）划线分离时为什么每次将接种环上多余的菌体烧掉？划线时为何不能重叠？
（2）分离某类微生物时培养皿中出现其他类微生物，请说明原因？应该如何进一步分离和纯化？经过一次分离的菌种是否皆为纯种？若不纯，应采用哪种分离方法？

实验6 水质的细菌学检测
目的要求
1．了解水质的细菌学检测方法和原理。
2．了解水质评价的微生物学卫生标准。
一、基本原理
水质的细菌学检测是给水和水质分析工作中的一项重要指标。目前水质卫生标准中规定的细菌学指标主要有两个：每毫升水的细菌总数和每升水的总大肠菌群数。一般来说，细菌数越多，水的有机质含量越大。因此，水中的细菌总数可以用来说明水质被有机物污染的程度。我国规定每升生活饮用水细菌总数不能超过100个。水中的细菌总数的测定一般采用平板菌落计数法，即用平板培养基收集不同来源的样品，由于培养基含有细菌生长所需要的营养成分，样品中的微生物就会在培养基上繁殖，形成一个个可见的菌落。
水是致病菌传播的重要渠道，然而，水中的致病菌检测是非常困难的工作。大肠菌群是人和动物体内的正常菌群，在水中的数量与致病菌呈正相关，而且大肠菌群的数量比较多，比较容易检测，所以，通常用大肠菌群的数量反映水的细菌学卫生标准。我国规定每升生活饮水中大肠杆菌数不能超过3个。大肠菌群是一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌，能在乳糖培养基产酸产气（很多其他的细菌无此现象）。可以在乳糖培养基中倒置一支德汉氏小套管收集产生的气体，还可以在培养基内加溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。以此来鉴别水中的大肠菌群，再结合一定的技术手段，借助专门的统计表，就能得到水中的大肠菌群数量
为了准确，大肠菌群的检测一般分为三步：初发酵试验，平板分离，复发酵试验。
（1）初发酵试验
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h内小套管中有气泡生成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性结果。但也有产酸不产气和48h后才产气的现象，这就需要做平板分离和复发酵试验，才能确定是否属大肠菌群。
（2）平板分离
经24h培养后，将产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，在于37℃培养箱内培养18-24h，将符合下列菌落特征（深紫黑色，有金属光泽；紫黑色、不带或略带金属光泽，淡紫红色、中心颜色较深）的一部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。
（3）复发酵试验
经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖胆盐发酵管中，每管可接种来自于同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。根据初步发酵的大肠菌群存在的发酵管数，查阅专门的统计表，得到大肠菌群数量。
二、实验器材
1．培养基
牛肉膏蛋白胨培养基、乳糖胆盐培养液（成分表9-1）、伊红美兰琼脂（成分表9-2）
2．染色剂
革兰氏染色液
3．其他用具
无菌的带玻璃瓶塞，无菌培养皿，灭菌吸管，无菌试管，乳糖胆盐发酵管等
三、实验内容
1．样品收集
（1）自来水收集
自来水采集时先将水龙头用火焰烧灼3min，放水5min，以无菌三角烧瓶接取水样。
（2）湖水采集
将灭菌的带玻璃塞瓶的瓶口向下浸入池水、河水或湖水中、距水面10-15cm的深层，然后翻转过来，除去玻璃塞。盛满水后，将瓶塞塞好，再从水中取出。立即进行检查。
2．细菌总数测定
（1）将水样在灭菌试管内进行稀释，得到10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30-300个之间的稀释度最为合适。若三个稀释度的菌落均多到无法计数，需继续稀释；若少到无法计数，则需要减小稀释倍数，甚至不稀释。
（2）在最后三个稀释度的试管中，用灭菌吸管各取1ml稀释样品，加入到空的灭菌培养皿中，立即放在桌上摇匀。
（3）将牛肉膏蛋白胨培养基倒平板。
（4）凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。
（5）平板菌落计数。
3．大肠菌群的测定
（1）初发酵试验
A、五管发酵法
将水样充分混匀后，将人工湖湖水按1:10稀释后再接种；然后，每个稀释后的样品用5个（100、10、1、0.1、0.01）不同的水样量接种。
若接种量为100ml，则试管内应装有三倍乳糖胆盐发酵液50ml；若接种量为10ml，则试管内应装有三倍乳糖胆盐发酵液5ml；若接种量为1ml、0.1 ml、0.01 ml，则接种于单倍乳糖胆盐发酵液10ml中。如下表：
接种量100ml水样+50ml三倍浓度乳糖胆盐培养液 （用250ml三角瓶盛装）
接种量10ml水样+5ml三倍浓度乳糖胆盐培养液 （用试管盛装）
接种量1ml水样+10ml单倍浓度乳糖胆盐培养液 （用试管盛装）
接种量0.1ml水样+10ml单倍浓度乳糖胆盐培养液 （用试管盛装）
接种量0.01ml水样+10ml单倍浓度乳糖胆盐培养液 （用试管盛装）
在接种前，先分装不同浓度的乳糖胆盐培养液，并于分装容器中倒置德汉氏小管，三角瓶中倒置小试管，将乳糖胆盐培养液于灭菌锅中121.6℃，0.1MPa个大气压下持续灭菌20分钟，在高温高压下，乳糖胆盐培养液被压满德汉氏小管，管内的气体被挤净。接种时亦须在无菌条件下进行。由于水体的差异相当大, 有的用原水样10ml接种还检测不到大肠杆菌的存在,有的要稀释到10-4-10-5/ml之后接种仍有阳性反应。所以, 用五管法检测大肠菌群一定要选择好稀释的级别, 否则会比单管发酵法更难得到精确的结果。
证实后，再根据发酵试验的阳性管数查表（表9-3），得出大肠菌群的近似值。
B、多管发酵法
取2个装有50ml三倍乳糖蛋白胨培养基的大发酵管，在无菌操作的条件下各加入100毫升水样，混匀。另取10只装有5毫升三倍乳糖蛋白胨发酵管，用无菌移液管各加入10毫升水样，混匀后37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。
（2）平板分离
经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管进行平板分离。分别用接种环取发酵液划线接种于伊红美蓝培养基平板上，于37℃培养18-24小时。将出现以下三种菌落特征的一部分，进行涂片、革兰氏染色、镜检。A、具有金属光泽、深紫色菌落；B、紫黑色、微或无金属光泽的菌落；C、淡黑色、中心紫色的菌落。
（3）复发酵试验
经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑选此菌落的一部分，重新接种于乳糖蛋白胨发酵管中，经37度培养24小时，结果产酸产气，即证实有大肠菌群存在。
证实后，再根据发酵试验的阳性管数查表（表9-4），得出大肠菌群的近似值。
表9-1 乳糖胆盐培养液成分 表9-2 伊红美蓝培养基成分
序号
培养基成分
含量

序号
培养基成分
含量
1
蛋白胨
10g

1
蛋白胨
10g
2
乳糖
5g

2