葡萄糖共代谢作用下Achromobacter sp.对焦化废水中吡啶的生物降解特性.pdf

第 卷第 期煤 质 技 术 年 月 移动阅读冯晓娇，邓铭，迟海军，等 葡萄糖共代谢作用下 对焦化废水中吡啶的生物降解特性 煤质技术，（）：，（）：葡萄糖共代谢作用下 对焦化废水中吡啶的生物降解特性冯晓娇，邓 铭，迟海军，刘佳宁，金文杰（辽宁科技大学 化工学院，辽宁 鞍山）摘 要：焦化废水中的吡啶具有较强的毒性、致畸性和致癌性且难以被有效降解，因而采用菌株 与葡萄糖共代谢作用以探究高效降解废水中的吡啶具有重要意义。结合菌种的鉴定及 的测定，剖析其代谢产物与吡啶的代谢途径，并利用 模型对 生长动力学进行分析，研究生物强化处理焦化废水以及 对吡啶的降解特性，探究菌株 对工业废水中难降解物质吡啶的降解，得知最适该菌降解吡啶的条件为初始质量浓度 和接种量 （体积比）。在此基础上，添加 葡萄糖为共代谢底物，对吡啶降解率在 可达 。结合 分析，菌株通过吡啶环上 和 之间断裂生成中间产物 和戊二醛来降解吡啶。吡啶初始浓度为 ，菌株生长动力学符合 模 型，最 大 比 生 长 速 率（）为 ，底 物 抑 制 系 数（）为 。在葡萄糖共代谢作用下，与活性污泥耦合使焦化废水中的吡啶完全降解时间由 减少至，降解率由 提高至。菌株 可用于含有吡啶废水的高效处理，为其生物修复提供 种新途径。关键词：焦化废水；生物降解特性；吡啶；降解率；代谢途径；底物抑制系数；菌株生长动力学中图分类号：；文献标志码：文章编号：（）收稿日期：责任编辑：傅 丛 ：基金项目：辽宁科技大学研究生科技创新资助项目（）作者简介：冯晓娇（），女，满族，辽宁铁岭人，硕士研究生，主要研究方向为废水处理。：通讯作者：金文杰（），女，辽宁鞍山人，教授，主要研究方向为废水处理。：，（，）：，第 期冯晓娇等：葡萄糖共代谢作用下 对焦化废水中吡啶的生物降解特性 （），（），（）（），：；引 言吡啶为六元氮杂环有机化合物，广泛存在于焦化、染料、炼油等行业废水中，具有较强的毒性、致畸性和致癌性，对环境和人体造成极大危害，难以被有效降解，故而探究如何高效地降解废水中的吡啶具有重要意义。传统降解方法主要包括吸附、精馏、焚烧、氧化和沉淀等，操作复杂且二次污染严重，相比之下，生物处理方法操作简便、经济高效、处理量大且几乎无二次污染。近年来，诸多学者分离出多种吡啶降解菌，如 、等。但上述菌株直接降解吡啶时其耗时较长且效率偏低，对高浓度吡啶耐受能力较差，可通过加入共代谢底物来提供碳源和能源可缓解上述问题。目前，高浓度吡啶的高效降解尚未被广泛关注，对于吡啶的生物降解特性研究鲜有报道。邓秀琼等对焦化废水氮杂环化合物降解功能菌的分离、降解特性与代谢途径进行研究，内含 对吡啶的生物降解特性研究。笔者曾利用 株具有较高比生长速率的新型 以探索对吡啶和实际焦化废水的生物降解特性，分析 对吡啶降解的代谢途径和菌株生长动力学。焦化废水生化池出水通常含难降解有机物，包括氮杂环化合物、酚类物质和多环芳烃等，仅依赖活性污泥而不采取其他措施难以实现有效降解，因此，以下研究外加优势菌 与葡萄糖共代谢以促进焦化废水中残留难降解有机物的降解，以期为生物强化处理焦化废水提供 条可行路径。实验方法 材料和仪器实验所用化学药品均为市售分析纯。牛肉膏蛋白胨培养基（）：牛肉膏 ，蛋白胨 ，无菌去离子水 ，；营养琼脂培养基（）：营养琼脂 ，无菌去离子水 ；吡 啶 无 机 盐 培 养 基（）：、无水 、微量元素储备液（、无 菌 去 离 子 水 ）、无菌去离子水 。试验仪器主要包括美国 型紫外可见分光光度仪、美国 型 分析仪、型 仪、美国 型气相色谱质谱仪（）。种子液制备 为笔者课题组分离纯化所得，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（）。将该菌株于 中复壮得到新鲜 ，转移至 锥形瓶中，在无菌操作下加入 ，在 、水浴振荡器中振荡培养至对数生长期末期。将菌悬液以 离心 ，用无菌水冲洗沉淀 次，目的在于消除对培养基中残留的细菌代谢物干扰，再用 调生物量至 （菌数：煤 质 技 术 年第 卷个），用于吡啶、焦化废水的生物降解和细菌生长动力学实验。菌株生长用式（）计算世代时间（）。（）式中，为指数生长阶段开始时的细菌数，个；为指数生长阶段结束后的细菌数，个；为菌株生长时间，。菌种鉴定将菌株接种于含 的平板上，按照 常见细菌系统鉴定手册进行生化指标的检测，并采用 基因测序进一步鉴定。对吡啶的降解特性以菌株接种量为、和，吡啶质量浓度为、，于 、条件下摇床振荡培养 ，从而确定 降解吡啶的最适浓度和菌株接种量，为与葡萄糖共代谢研究提供最佳初始条件。为探究基质对菌株共代谢性能的影响，在菌株接种量为、吡啶初始质量浓度为 的条件下，以葡萄糖（、）为共代谢基质，以不含葡萄糖的 为对照，于、条件下摇床振荡培养 ，计算吡啶和 降解率。使用紫外可见分光光度仪在 波长下检测菌株生长情况（每隔 ），波长下测定吡啶浓度（每隔 ），分析仪测定吡啶降解液的总有机碳含量（每隔 ），以上均设置 组平行试样取平均值。代谢产物分析采用乙酸乙酯提取吡啶降解中间体，使用 进行检测分析，将保留时间和离子光谱与真实标准、库数据匹配从而完成鉴定。色谱条件：色谱柱（），进样口温度 。程序升温：初始柱温 ，保持 ，以 升温至 保持 ，再以 升温至，保持 ；载气为高纯氦气（纯度 ）；分流比 ；流速 。进样方式：分流进样。质谱条件：电离方式为电子电离（，）源；电子能量 ；传输线温度；采集模式为全扫描；离子源温度 ；四级杆温度 ；溶剂延迟 。为了快速检测在吡啶降解过程中氮的转化情况，利用 试剂检测硝态氮，采用二苯胺试剂检 测 亚 硝 态 氮，采 用 萘 氏 试 剂 检 测 氨氮。检测采用 仪，通过上述方法分析吡啶的代谢途径。动力学模型通过测定不同吡啶质量浓度（）细菌的生长速率随基质浓度的变化（式（），构建菌株生长动力学模型，分析 模型中的动力学参数（式（），按式（）计算最大比生长速率（）对应的最大抑制底物浓度（）。（）（）（）式中，为菌株生长时间，；为 时的菌株浓度，；为比生长速率，；为底物质量浓度，；为饱和系数，；为生长抑制系数，。强化焦化废水降解焦化废水取自鞍钢化工厂焦化废水处理车间的好氧池，其 浓度为 ，浓度为 ，。将 葡萄糖、种子液和活性污泥（）加入装有 焦化废水（已过滤）的 锥形瓶中，在 的水浴器中曝气，测定焦化废水中吡啶浓度和 浓度。为了对比 在葡萄糖共代谢作用下的生物强化效果，设置 个对照组，即菌株单独降解焦化废水、活性污泥单独降解焦化废水、菌株与活性污泥耦合降解焦化废水。结果与讨论 菌种的鉴定试验菌株由上海生物工程技术有限公司进行扩增并测序，获得 的 基因序列，并利用 中的 将测序结果进行同源性比对。比对结果表明，与该菌株的序列同源性达到以 上 的 菌 种 均 为 无 色 杆 菌（），菌株与 的亲缘关系最近，序列同源性达到，同时结合菌株的形态学特征和生化特征（表），确认菌株为无色杆菌属（）。试验菌株的系统发育树如图 所示。第 期冯晓娇等：葡萄糖共代谢作用下 对焦化废水中吡啶的生物降解特性表 的生化特征 项目生化特性项目生化特性初始生长 值（）糖或醇类发酵试验接触酶试验氧化酶试验葡萄糖氧化发酵试验油脂水解试验淀粉水解试验甲基红试验（）硝酸盐还原试验乙酰甲基醇试验（）明胶液化试验产吲哚试验产硫化氢试验柠檬酸盐试验 注：“”表示反应为阳性反应；“”表示反应为阴性反应。菌株 呈杆状，大小尺寸为 ，菌落呈圆形、淡黄色，略微凸起，边缘光滑而整齐，革兰氏染色结果为阴性。图 试验菌株 的系统发育树 结合表 生化试验结果可知，菌株在 正常生长，时生长最佳，在 生长世代时间为 （式（），表明此试验菌株繁殖较快。对吡啶的降解特性 降解吡啶的最适吡啶初始质量浓度和菌株接种量如图 （）、（）所示，与葡萄糖共代谢降解吡啶结果如图 （）、（）所示。图 不同条件下 对吡啶的去除特性 图 （）表明，吡啶质量浓度为 时，吡啶降解率和最终菌株浓度（）最大，说明在对应接种量前提下 降解吡啶的最适质量浓度为 ，底物浓度是影响酶促反应速率进而影响菌株生长和底物降解的重要原因之一。图 （）表明，吡啶质量浓度为 时，降解吡啶的最适接种量为，吡啶 降 解 率 达 最 大 值 且 菌 株 浓度（）最大。图 （）表明，加入葡萄糖比不加葡萄糖的效果明显变好；当葡萄糖质量浓度为 时，吡啶降解率达到最大，显著提高了 的降解率；同时，使菌株浓度（）显著增加，说明葡萄糖可以促进菌株生长，提高其繁殖能力。图（）表明，当葡萄糖质量浓度为 时，降解率达到最大，显著提高了 的降解率，说明中间有机物产物明显减少。目前已分离出多株吡啶降解菌，在 后对吡啶（）的降解率仅为；蜡样芽孢杆菌（）和粪产碱杆菌（）在 对吡啶（）的降 解 率 分 别 为 和 ；在 后降解了 的吡啶（）。根据上述结果说明，、蜡样芽孢杆菌（）、粪产碱杆菌（）、对吡啶的降解时间较长，且对吡啶的耐受浓度较低。与上述煤 质 技 术 年第 卷菌株 对 比 发 现，对 吡 啶 浓度（）耐受能力较强，在葡萄糖共代谢作用下 能 在 极 短 时 间（）内 高 效 降 解 吡啶（）和降解液中 （）。吡啶的代谢途径采用 测定 降解吡啶中间产物的质谱图如图 所示，其主要代谢产物见表。由 检测 降解吡啶中间体的分析结果表明，葡萄糖不会改变吡啶的代谢途径，因在 吡啶、戊二醛、戊二酸等 个主要成分中无论是否加入葡萄糖则产物的种类均一致。当加入葡萄糖作为共代谢底物时，吡啶的残留量显著减少，说明葡萄糖的加入可有效促进吡啶的降解。图 吡啶降解产物质谱 表 检测 降解吡啶的中间体 序号代谢产物化学式代谢产物的含量 加葡萄糖不加葡萄糖吡啶 戊二醛 戊二酸 其他 总计 在吡啶生物降解过程中测定氮转化和，结果见 表。葡 萄 糖 加 入 后，未 检 测 出 氨 态 氮（）、亚硝态氮（）和硝态氮（），说明吡啶中氮的转化途径可能是由环上 和 之间开环形成的，然后释放至吡啶降解液中，且未发生硝化反应。在降解过程中 值变化不大，溶液 基 本 为 中 性，表 明 在 降 解 过 程 中 并 未 产酸（和）。因此，推测 作为细菌生长的氮源，可能被菌株快速消耗。未加入葡萄糖时，检测到氨态氮（）和硝态氮（），推断吡啶开环后游离的 进入吡啶降解液中，而 并未被细菌完全利用，致使滞留于溶液中。在溶液中，的存在则说明 对 具有很强的氧化能力，使液相中的 显著降低，当 过低时不利于菌株生长，因此，吡啶的生物降解受到限制。根据现有文献，吡啶降解主要包括 种代谢途径：分别为吡啶环上 和 之间断裂生成中间产物 和戊二醛，或 和 之间断裂生成中间 产 物 琥 珀 酸 半 醛。此次研究结果表明，可能通过吡啶环上 和 之间断裂生成中间产物戊二醛的代谢途径来降解吡啶，与吡啶降解菌 、的研究一致。表 生物降解过程中氮的转化和 值的变化 项目加葡萄糖 不加葡萄糖 注：“”表示物质存在；“”表示物质不存在。第 期冯晓娇等：葡萄糖共代谢作用下 对焦化废水中吡啶的生物降解特性 综上所述，提出 降解吡啶可能存在的代谢途径，如图 所示。其中，吡啶、戊二醛可能是吡啶环上 和 之间断裂生成的中间产物，戊二酸由戊二醛氧化生成。图 对吡啶的生物降解途径 生长动力学分析细菌生长动力学 模型拟合曲线如图 所示。的比生长速率（）随吡啶浓度增加而增加，但当吡啶质量浓度超过一定值时，减少，说明吡啶质量浓度过高会对菌株生长产生抑制作用。相关系数（）较高则说明 在含吡啶溶液中的生长动力学可以很好地用 模型描述。部分吡啶降解菌的动力学参数见表。图 降解吡啶的 模型拟合曲线 表 吡啶生物降解细菌的动力学参数 菌株名称（）模型 （）（）文献 此次研究（加葡萄糖）此次研究（不加葡萄糖）由表 中的动力学参数分析比较可知，的 最 大 比 生 长 速 率（）为 ，饱和系数（）为 ，底物抑制系数（）为 ，在最大比生长速率下吡啶的最适质量浓度（）为 。葡萄糖加入后，葡萄糖的加入使 提高，有助于提高吡啶的降解速率；的增加，可提高 对高浓度吡啶的耐受能力。由表 与其他细菌对比可知，的 均大于其他菌株，说明此次试验菌株的生长速率快；的 也均大于其他菌株，说明吡啶对试验菌株的生长抑制作用最弱，在较高的吡啶浓度下，试验菌株能够保持良好的生长趋势，对于吡啶的生物降解具有显著优势。与上述菌株相比，试验菌株 的降解速率较高，说明该试验菌株属于吡啶降解活性较强的菌种。强化焦化废水降解 生物强化降解焦化废水如图 所示，其中组合 为焦化废水 ，组合 为 焦化废水活性污泥，组合 为焦化废水活性污泥 ，组合 为 焦化废水活性污泥葡萄糖 。由于焦化废水取自鞍钢 工艺中的好氧池，经 段处理后，池吡啶质量浓度在 范围。煤 质 技 术 年第 卷图 对焦化废水中吡啶和其他有机物的降解 图 （）表明，和活性污泥分别单独降解焦化废水时，内吡啶的降解率分别为 和 ，说明试验菌株在焦化废水中可以适应有机物的环境并实现焦化废水中吡啶的降解。当 和活性污泥耦合降解焦化废水时，吡啶浓度迅速下降，内实现完全降解（），说明 菌株可以与污泥中微生物菌群共存，且降解效果明显，相比于 者单独作用，吡啶降解率分别提 高 了 和 。图 （）表明，葡萄糖的加入使焦化废水中的吡啶在 内被完全降解（），说明葡萄糖可以消除有机物对 和活性污泥中微生物菌群的抑制作用，缩短吡啶的降解时间，提高吡啶的降解效率。图 （）表明，当 和活性污泥分别单独降解焦化废水时，对有机物降解率分别为 和 ，降解率高于吡啶，说明 菌株或活性污泥在降解焦化废水中吡啶的同时，对其他难降解有机物也具有降解能力。当 与活性污泥耦合降解焦化废水时，对有机物降解率为 ，相比于两者单独作用，有机物降解率分别提高了 和 ，说明活性污泥与菌株联合作用对有机物的降解能力得到提升。葡萄糖的加入，后有机物降解率为 ，相比于不加葡萄糖，降解率提高了 ，说明 可以适应含有机物的焦化废水，葡萄糖提高了试验菌株对焦化废水中其他有机物的降解能力，使有机物降解率增大。目前已发现多种菌株可降解焦化废水中的难降解有机物，在 内可降解 焦化原水中的 酚类物质；菌株 在 后对焦化废水中有机物降解率为 ，与活性污泥耦合后降解率达到 ，将葡萄糖和加入改良污泥降解焦化废水的最大降解率达到 ；菌株、和 最终对焦化废水的降解率分别达到 、和 ；菌株与活性污泥耦合后降解率分别达到 、和 。由此可见，上述菌株对焦化废水中有机物的降解率不高，且耗时长。此次研究采用的 在 内可以完全降解焦化废水中的吡啶，在葡萄糖作用下，内对有机物降解率可达到，说明 能够快速降解焦化废水中的吡啶和其他有机物质，具备较强的生物强化处理焦化废水的能力。已有研究中 对焦化废水的生物修复符合一级反应动力学，和 对实际废水的降解均符合一级反应动力学，菌株 降解焦化废水符合二 级 动 力 学 方 程（），降解速率快，因此 可以实现高效快速降解焦化废水。结 论（）采用菌株 降解吡啶，菌株初始质量浓度为 ，葡萄糖为共代谢基质，内吡啶降解率可达到 ，同时菌株浓度显著增加，说明葡萄糖可以促进菌株生长，提高其繁殖能力。通过 分析，推断 对吡啶的生物降解可能符合吡啶环上 和 之间断裂生成中间产物 和戊二醛途径。采用 模型描述 的生长动力学，结果表明，与不加葡萄糖相比，在葡萄糖作用下，最大比生长速率（）由 升 高 至 、底 物 抑 制 系 数（）由 升 高 至 、底 物 浓度（）由 升高至 ，即、第 期冯晓娇等：葡萄糖共代谢作用下 对焦化废水中吡啶的生物降解特性、等动力学参数均有所增加，且 和 均高于其他研究报道。（）研究设置 个对照组对比分析 在葡萄糖共代谢作用下对实际焦化废水的生物强化效果，结果表明，当 和活性污泥耦合降解焦化废水时，对有机物降解率为 ，加入葡萄糖后在同样时间内使降解率提高至 。（）葡萄糖共代谢可提高吡啶降解率、降低吡啶对 生长的抑制作用。提升菌株浓度有利于菌株对于氮的吸收利用，并维持吡啶降解液中稳定的 值，证实 在葡萄糖共代谢作用下对于吡啶的降解优势，可为含吡啶实际焦化废水的生物处理工艺的工程应用和操作提供新途径。参考文献（）：，（）：梁希伦，傅梦凯，刘锐 吡啶废水常用处理方法研究进展 广东化工，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：邓秀琼 焦化废水氮杂环化合物降解功能菌的分离、降解特性与代谢途径研究 广州：华南理工大学，：，：，：，：徐伟超，吴翠平，张玉秀，等 喹啉降解菌 的好氧降解特性及其在焦化废水中的生物强 化 作 用 环 境 科 学，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：煤 质 技 术 年第 卷 ，（）：，（）：雷萍，聂麦茜，张志杰，等 一株多环芳烃降解菌在焦化废水降解中的应用研究 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