牛乳铁素优势肽Lfcin B1-10的生物信息学分析.pdf

牛乳铁素（Bovine lactoferricin，Lfcin B）是牛乳铁蛋白经胰酶消化后释放出的 17 位至 41 位氨基酸残基构成的短肽，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗寄生虫等生物活性。为了深入开发和利用 Lfcin B，进一步去除 Lfcin B 的部分 C-末端氨基酸残基，形成了由 10 个氨基酸残基构成的短肽，称为 Lfcin B1-10。Lfcin B1-10较好地保留了 Lfcin B 的生物活性，但有关 Lfcin B1-10的理化性质、结构、跨膜区等是否改变尚不清楚。因此，利用生物信息学方法对 Lfcin B1-10的氨基酸的理化性质、二级结构、跨膜区、信号肽及酶切位点等特征进行预测分析。结果显示，Lfcin B1-10为阳离子型抗菌肽，理论等电点为 11.71，热稳定性较差；分子为亲水性寡肽，二级结构仅有无规则卷曲，无跨膜区和信号肽，可被机体内多种酶降解，具有良好安全性。研究不仅为深入认识其构效关系、抗菌机制提供依据，同时为 Lfcin B1-10的实际应用提供参考。关键词：牛乳铁素；Lfcin B1-10；生物信息学；理化性质；抗菌肽中图分类号：S859.79+7文献标识码：A文章编号：1002-2090（2023）04-0081-06Bioinformatics Analysis of Bovine Lactoferricin Lfcin B1-10Song Chengqi1，Yu Liquan2，Cui Yudong1，2（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）Abstract：A short peptide was composed of amino acid residues at positions 17 to 41 released from bovine lactoferrin（Lfcin B）digested by pancreatin.The short peptide had broad-spectrum antibacterial，antiviral，antitumor and antiparasitic activities.In order tofurther develop Lfcin B，a short peptide composed of 10 amino acid residues was obtained from C-terminal amino acid in Lfcin B.The short peptide was named Lfcin B1-10.Lfcin B1-10retained the biological activity of Lfcin B well，but it was not clear that whetherthe physicochemical properties，structure and transmembrane region of Lfcin B1-10had changed.Bioinformatics methods were used topredict the characteristics of amino acids in Lfcin B1-10，such as physicochemical properties，secondary structure，transmembraneregion，signal peptide and restriction site.The results showed that Lfcin B1-10was a cationic antibacterial peptide with a theoreticalisoelectric point of 11.71 and poor thermal stability.The molecule is a hydrophilic oligopeptide，and its secondary structure had onlyirregular curl，no transmembrane region and signal peptide.It could be degraded by various enzymes in the body，and it had goodsafety，which provided a basis for understanding the structure-activity relationship and antibacterial mechanism of Lfcin B1-10，butalso provided a reference for the practical application of Lfcin B1-10援Key words：bovine lactoferricin；Lfcin B1-10；bioinformatics；antimicrobial peptides乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）又称乳铁转运蛋白（Lactotransferrin，LTF），是一种分子量约为 80 kDa 的铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族1。LF 广泛分布于人和哺乳动物乳汁、其他多种组织及其分泌液中，但乳汁中含量较高2，其中牛初乳中乳铁蛋白含量最高。血液中 LF 主要由多形核细胞分泌，骨髓、唾液腺及子宫内膜等也能分泌少量乳铁蛋白3。LF 不仅对维持体内细胞铁水平发挥关键作用，同时还对多种病黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷表 1用于生物信息学分析的工具Table 1Software for bioinformatic analysis分析内容氨基酸组成理化性质二级结构跨膜区信号肽酶切位点预测工具PepinfoProtParamSOPMATMHMM-2.0SignalP-6.0PeptideCutter网址https:/www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepinfo/https:/web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparamhttps:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.htmlhttps:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalPhttps:/web.expasy.org/peptide_cutter/毒、细菌、真菌和寄生虫表现出强大的抗微生物活性，而且还具有抗炎和抗癌活性，也具有多种酶功能，是先天防御系统的关键组成成分4。牛乳铁素（Bovine Lactoferricin，Lfcin B）是牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin，LFB）在酸性条件下经胃蛋白酶水解后，从 N 端释放产生的一种由 25 个氨基酸残基组成的抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）5-6。Lfcin B 由牛乳铁蛋白（LFB）的第 17耀41 位氨基酸残基组成，序列为 FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVR原RAF，其中包括 5 个色氨酸（Trp）、3 个赖氨酸（Lys）和多个芳香族氨基酸残基。序列中的 2 个半胱氨酸（Cys）通过形成分子内二硫键使 Lfcin B 形成不完全的环状结构7。Lfcin B 除不能结合铁离子外，其他功能则与 LFB 基本一致，同样具有抗微生物、抗肿瘤、免疫调节以及抗氧化等多重生物学功能，它的抗菌活性甚至是 LFB 的 400 多倍8。Lfcin B 具有广谱抗菌作用（包括 G+菌、G-菌和真菌），如金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）以及白色念珠菌（Canidia Albicans）等，但对肠道细菌的抑制作用具有选择性，而对肠道中的益生菌（如双歧杆菌、荧光假单胞菌以及乳酸菌等）的抑制效果较差或无抑制作用8；甚至，Lfcin B 在一定浓度范围内能够剂量依赖性地促进益生菌嗜酸乳杆菌的生长繁殖9。对于 Lfcin B 的抗菌机制，国内外研究学者普遍认为是 Lfcin B 与细胞膜相互作用有关。原核细胞膜含有大量带负电的磷脂酰甘油，使细胞膜带有净负电荷，故带正电荷的 Lfcin B 可与细胞膜表面的负电荷基团通过静电吸引相结合。研究表明，Lfcin B 氨基酸序列中的第 4耀9 位氨基酸残基（RRWQWR）是Lfcin B 发挥抗菌作用的活性中心10-11，其中，3 个精氨酸（Arg）残基侧链与细胞膜成分通过正负电荷吸引，而 Trp 的芳香环结构与磷脂头部的甘油相互作用，通过疏水作用附着于外膜表面，利用疏水结构使Lfcin B 通过跨膜进入细胞，或者将多个 Lfcin B 聚集到细胞膜上形成跨膜的离子通道，破坏了膜的完整性，使细胞膜通透性增强，导致细胞膜裂解，胞内容物外泄，最终死亡8。LfcinB 抗真菌的机制有两种，一种是对真菌的直接杀灭作用，Lfcin B 可与真菌细胞质膜发生相互作用，并影响其细胞质；另一种是通过提高宿主防御反应而实现的。来源于 Lfcin B N 端区域的十肽（FKCRRWQWRM）可通过提高蛋白酪氨酸激酶（Protein-Tyr Kinase，PTK）活性和激活 NADPH氧化酶复合体来诱导活性氧簇分子产生而提高多形核白细胞（polymorphocuclear leukocytes，PMNs）吞噬活性和对念珠菌属的杀菌作用12。Ueta 等12将 Lfcin B 氨基酸序列的第 11耀25 位氨基酸残基去除，得到第 1耀10 位氨基酸残基构成的寡肽，命名为 Lfcin B1-10，其序列为 FKCRRWQWRM，并证明具有良好的抗菌和激活嗜中性粒细胞活性。但作为一种来源于 Lfcin B 的新型小分子抗菌肽，对Lfcin B1-10的理化性质、二级结构以及跨膜区等尚不清楚，进而影响了对 Lfcin B1-10的构效关系及抗菌机制的认识。因此，研究利用在线生物信息学工具对Lfcin B1-10的氨基酸组成、理化性质、二级结构、跨膜区、信号肽及酶切位点等特征进行了分析，同时与Lfcin B 进行比较、预测，为 Lfcin B1-10的深入研究及其构效关系、抗菌作用机制和实际应用提供参考。1材料与方法1.1 材料以牛乳铁素 Lfcin B1-10为研究对象，氨基酸序列为 FKCRRWQWRM；以牛乳铁素（Lfcin B）作为参照，其氨基酸序列为 FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVR原RAF。1.2 方法利用在线生物信息学分析工具对牛乳铁素 LfcinB1-10及牛乳铁素（Lfcin B）的氨基酸组成、理化性质、二级结构、跨膜区、信号肽及酶切位点等特征进行分82第 4 期析，所用分析工具如表 1 所示。2结果与分析2.1 氨基酸组成Lfcin B1-10含有 10 个氨基酸残基，由 7 种基本氨基酸组成；Lfcin B 含有 25 个氨基酸残基，由 15 种基本氨基酸组成。Lfcin B1-10与 Lfcin B 所含氨基酸残基数目和占比如表 2 所示。结果显示，Lfcin B1-10包含 1 个极微残基（C）、1个小侧链残基（C）、3 个芳香族残基（F+W）、5 个非极性（疏水性）残基（F+C+W+M）、5 个极性（亲水性）残基（K+R+Q）以及 4 个带正电荷（碱性）残基（K+R，占残基总数的 40%），不含脂肪族残基和带负电荷（酸性）残基；Lfcin B 则包含 7 个极微残基（C+G+A+S+T）、9 个小侧链残基（C+G+A+P+S+T+V）、3 个脂肪族残基（L+I+V）、4 个芳香族残基（F+W）、14 个非极性（疏水性）残基（F+C+W+M+L+G+A+P+I+V）、11 个极性（亲水性）残基（K+R+Q+S+T）以及 8 个带正电荷（碱性）残基（K+R，占残基总数的 32%），同样也不含带负电荷（酸性）残基。以上结果可以看出，Lfcin B1-10的热稳定性要低于 Lfcin B（前者无脂肪族残基，而后者含有 3 个），更易于降解，这提示其在相对高温的环境中（如机体内）的抗菌作用可能弱于 Lfcin B。因 Lfcin B1-10的极性与非极性残基数相等（各占残基总数的 50%），而Lfcin B 的极性残基数少于非极性（分别占残基总数的 44%和 56%），故推测其疏水性弱于 Lfcin B。AMPs的抗菌活性与其所含正电荷数密切相关，一般认为正电荷数越高则抗菌活性越强，而 Lfcin B1-10的正电荷残基数仅为 Lfcin B 的 1/2，且二者均无负电荷残基，这表明 Lfcin B1-10的抗菌活性可能弱于 Lfcin B。表 2Lfcin B1-10和 Lfcin B 的氨基酸组成Table 2Amino acid composition of Lfcin B1-10and Lfcin B氨基酸丙氨酸 Ala（A）精氨酸 Arg（R）半胱氨酸 Cys（C）谷氨酰胺 Gln（Q）甘氨酸（G）异亮氨酸 Ile（I）亮氨酸 Leu（L）赖氨酸 Lys（K）甲硫氨酸 Met（M）苯丙氨酸 Phe（F）脯氨酸 Pro（P）丝氨酸 Ser（S）苏氨酸 Thr（T）色氨酸 Trp（W）缬氨酸 Val（V）数量/个-311-111-2-占比/%-30.010.010.0-10.010.010.0-20.0-数量/个252111131211121占比/%8.020.08.04.04.04.04.012.04.08.04.04.04.08.04.0Lfcin B1-10Lfcin B2.2 理化性质经 ProtParam 分析，Lfcin B1-10及 Lfcin B 的分子式、相对分子质量、等电点、带电荷氨基酸数目、半衰期、稳定性、脂溶性及亲水性等理化性质如表 3 所示。结果显示，Lfcin B1-10的理论等电点与 Lfcin B 基本相同，且均大于 11，这可能是它们只含碱性氨基酸，而不含酸性氨基酸的原因。Lfcin B1-10与 Lfcin B均可被紫外分光光度计（280 nm）检测。Lfcin B1-10的不稳定指数达到了 108.53，Lfcin B 的不稳定指数则为 77.92，表明二者均属于不稳定多肽，且相较于Lfcin B，Lfcin B1-10则更不稳定；同时，Lfcin B1-10的脂肪族指数为 0.00，Lfcin B 的脂肪族指数为 50.80，表明二者热稳定性均较差，且 Lfcin B1-10次于 Lfcin B，这与氨基酸组成分析的结果一致，预示其在实际应用中有一定局限性；亲水性平均系数反映多肽的亲水性强弱，其值范围在-2耀2 之间，负值越大表示亲水注：“-”表示无。宋成祺等：牛乳铁素优势肽 Lfcin B1-10的生物信息学分析83黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷性越强，正值越大表示疏水性越强，Lfcin B1-10和Lfcin B 的亲水性平均系数分别为-1.550 和-0.576。虽然 Lfcin B1-10的疏水性残基数与亲水性残基数相等，且 Lfcin B 的疏水性残基数还大于亲水性残基数，但分析结果却表明 Lfcin B1-10和 Lfcin B 均为亲水性多肽，且 Lfcin B1-10的亲水性强于 Lfcin B，推测这可能与氨基酸残基的排列顺序有关。同时，这也应证了氨基酸组成分析的结果。以上结果表明，Lfcin B1-10和 Lfcin B 均为不稳定的、亲水性的阳离子型（Lfcin B1-10的净电荷数为+4，Lfcin B 的净电荷数为+8）小分子抗菌肽。表 3Lfcin B1-10及 Lfcin B 的理化性质Table 3Physicochemical properties of Lfcin B1-10and Lfcin B内容分子式相对分子质量/Da理论等电点正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）数/个负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）数/个紫外线检测（280 nm）哺乳动物网织红细胞中半衰期/h（体外）酵母中半衰期/min（体内）大肠杆菌中半衰期/min（体内）不稳定指数脂肪族指数亲水性平均系数Lfcin B1-10C68H101N23O12S21 496.8211.7140+1.132108.530.00-1.550Lfcin BC141H226N46O29S33 125.8211.8480+1.13277.9250.80-0.576“+”表示可用紫外线进行定量检测。2.3 二级结构如图 1 所示，经 SOPMA 分析（运行参数：视窗宽度为 17，相似度阈值为 8，构象状态数目为 4），LfcinB1-10的二级结构仅有无规则卷曲（10 个氨基酸残基均参与），表明无规则卷曲可能是 Lfcin B1-10发挥抗菌作用的结构基础；Lfcin B 的二级结构较 Lfcin B1-10复杂，主要为 琢 螺旋。其中，琢 螺旋占 44.00%（11 个氨基酸残基参与），延伸链占 16.00%（4 个氨基酸残基参与），茁 转角占 20.00%（5 个氨基酸残基参与），无规则卷曲占 20.00%（5 个氨基酸残基参与），推测琢 螺旋可能是其发挥抗菌作用的重要结构基础。2.4 跨膜区跨膜区（transmembrane domain，TMD）是跨膜蛋白的疏水性氨基酸（跨越膜两侧）区域，通常为 琢 螺旋结构。Lfcin B1-10及 Lfcin B 均来源于 LFB，而 LFB并非跨膜蛋白，理论上不存在跨膜区，但 Lfcin B1-10及 Lfcin B 的杀菌作用又与使病原菌细胞膜裂解现象密切相关，为了探究其杀菌机制是否与跨膜作用有关，使用分析工具 TMHMM-2.0 对 Lfcin B1-10、LfcinB 及 LFB 的跨膜区存在与否进行预测分析，结果显示，LFB 全序列均不存在跨膜区，这表明 Lfcin B1-10及 Lfcin B 的杀菌机制与跨膜作用无关，推测 LfcinB1-10和 Lfcin B 在与病原菌作用过程中，首先通过静电相互作用吸附、聚集在病原菌表面，然后其疏水氨基酸通过疏水作用插入磷脂双分子层中，最终导致病原菌细胞膜通透性增加，直至裂解死亡。2.5 信号肽信号肽（signal peptides，SPs）是一种引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的 N-末c：无规则卷曲；e：延伸链；h：琢 螺旋；t：茁 转角图 1Lfcin B1-10及 Lfcin B 的二级结构预测Fig.1Secondary structure prediction of Lfcin B1-10and Lfcin B84第 4 期端的疏水性氨基酸序列（有时不一定在 N 端）。经SignalP-6.0 预测分析的结果显示，LFB 的第 1耀22 位氨基酸中可能存在信号肽，而 Lfcin B1-10与 Lfcin B的氨基酸序列中均不含信号肽。有研究认为，AMPs 的无规则卷曲结构除了作用于病原菌胞膜，改变胞膜的通透性外，还有助于在病原菌胞膜上形成孔洞，然后进入病原菌细胞，与胞内核苷酸或酶作用，干扰其正常代谢，最终抑制或杀死病原菌，这也与研究学者普遍认同的 Lfcin B 的抗菌机制类似。但研究结果表明，Lfcin B1-10和 Lfcin B 均无信号肽，这表明其自身并不能实现跨膜转移，理论上无法进入病原菌胞内，故其杀菌机制可能并非与穿膜作用有关。2.6 酶切位点如表 4 所示，经 Peptide Culter 分析，Lfcin B1-10和 Lfcin B 可同被 11 种蛋白酶剪切。对于 Lfcin B1-10，Arg-C 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（高特异性）、糜蛋白酶（低特异性）、梭菌蛋白酶、蛋白酶 K 和胰蛋白酶均有多个剪切位点（逸3），胃蛋白酶（pH2）有 2 个剪切位点，LysC、LysN、胃蛋白酶（pH 1.3）和嗜热菌蛋白酶仅有 1 个剪切位点；对于Lfcin B，胃蛋白酶（pH 1.3）有 2 个剪切位点，而除胃蛋白酶（pH 1.3）外，其余 10 种酶均有多个剪切位点（逸3）。同时，Lfcin B1-10序列中仅第 3 和第 7 位氨基酸残基为非酶切位点。而 Lfcin B 序列中也仅第 3、7、14 和 16 位氨基酸残基为非酶切位点。同时，Lfcin B的酶切位点包含了 Lfcin B1-10的所有位点。此外，二者均存在同一位点可被多种酶剪切的特点。稳定性是衡量 AMPs 能否投入实际生产应用的重要指标，而以上结果表明，Lfcin B1-10和 Lfcin B 在机体内均易降解，预示它们在机体内的环境稳定性较差，这也与 ProtParam 分析的理化性质结果一致。这虽不利于 Lfcin B1-10和 Lfcin B 的生物表达与开发应用，但通过蛋白酶的酶解作用有助于 Lfcin B1-10和Lfcin B 被降解转化为易被机体吸收利用的小分子氨基酸类物质。因此，Lfcin B1-10和 Lfcin B 不仅具有良好的生物安全性，同时还有一定的营养价值。表 4Lfcin B1-10和 Lfcin B 的酶切位点分析Table 4Enzyme digestion site analysis of Lfcin B1-10and Lfcin B酶名称Arg-C 蛋白酶胰凝乳蛋白酶（高特异性）糜蛋白酶（低特异性）梭菌蛋白酶LysCLysN胃蛋白酶（pH 1.3）胃蛋白酶（pH 2）蛋白酶 K嗜热菌蛋白酶胰蛋白酶剪切位点数/个33431112314剪切位点/位*4，5，91，6，81，6，8，104，5，92111，81，6，892，4，5，9剪切位点数/个546533231068剪切位点/位*4，5，9，22，231，6，8，251，6，8，10，13，254，5，9，22，232，11，121，10，111，121，8，121，6，8，13，15，18，19，21，24，259，12，17，20，23，242，4，5，9，11，12，22，23Lfcin B1-10Lfcin B*：此处为氨基酸残基序号。3讨论1992 年，Bellamy 等6，13首次发现 LFB 的抗菌结构域的一级结构对应于其氨基酸序列 N-末端的第17耀41 位残基，他们从 LFB 的胃蛋白酶体外酶解物中分离得到这段序列，并将其命名为 Lfcin B。而Lfcin B1-10则是通过顺序去除 Lfcin B 氨基酸序列的C-末端残基来设计的，其保留了 Lfcin B 中具有抗菌活性的最小基序 RRWQWR，即 Lfcin B 氨基酸序列中发挥抗菌作用的优势片段14-16。Lfcin B1-10的生物学功能与其结构有关，通过对 Lfcin B1-10的生物信息学分析，可以为进一步探究其构效关系与抗菌机制提供参考。有研究表明，疏水性氨基酸有助于 AMPs 选择性靶向病原菌胞膜，从而抑制或杀灭病原菌17。国内外对 Lfcin B 抗菌活性作用机制的普遍观点认为，Lfcin宋成祺等：牛乳铁素优势肽 Lfcin B1-10的生物信息学分析85黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷B 靠其本身所带有的正电荷与 G+菌细胞膜上的磷壁酸或 G-菌细胞膜上的脂多糖产生静电相互吸引，使Lfcin B 附着于膜的表面，然后靠其疏水氨基酸造成细胞膜结构的改变，并进一步引发形成离子通道，或直接插入细胞膜使膜裂解，导致胞内容物外泻，使细菌死亡18。故 Lfcin B1-10和 Lfcin B 的疏水性残基可能在一定程度上增强了它们的抗菌活性。一般来说，阳离子型 AMPs 的抗菌活性较强，且通常带有 2耀9 个正电荷氨基酸残基（主要为赖氨酸、精氨酸和组氨酸等）。研究结果显示，Lfcin B1-10和Lfcin B 的氨基酸序列中分别含有 4 和 8 个正电荷残基（K+R），无负电荷氨基酸，净电荷数分别为+4 和+8，说明二者均为强阳离子型 AMPs，这可能是它们发挥抗菌作用的重要基础19。同时，Lfcin B1-10的净正电荷数仅为 Lfcin B 的 1/2，推测 Lfcin B 的抗菌作用可能强于 Lfcin B1-10。但有研究表明，Lfcin B 拥有最强抗菌活性时所需的最低净正电荷为+420，故理论上 Lfcin B1-10本身即可发挥与 Lfcin B 达到最强抗菌活性时同等的抗菌作用。研究表明，Lfcin B 并不会使病原菌细胞膜裂解，但能够穿透细菌细胞质膜，由于细胞质内含有大量多聚阴离子，这些多聚阴离子可作为 Lfcin B的作用位点，从而使细胞质内脂质体融合21。也有研究发现核苷酸可能是 Lfcin B 在细胞内的潜在靶点之，Lfcin B 可以穿透核膜22。一般认为，蛋白若形成跨膜通道需要包含至少 18 个氨基酸残基23。但本研究对 Lfcin B1-10和 Lfcin B 的跨膜区及信号肽的预测分析结果显示，无论是仅含有 10 个氨基酸残基的 Lfcin B1-10还是含有 25 个氨基酸残基的 Lfcin B，均不存在跨膜区和信号肽，表明 Lfcin B1-10和 Lfcin B的抗菌作用机制似乎与跨膜作用及穿膜作用均无关，其具体的抗菌作用机制较为复杂，有待进一步研究。通过对 Lfcin B1-10和 Lfcin B 的酶切位点分析发现，两种多肽可被多种蛋白酶酶解，在机体内稳定性较差。4结论利用生物信息学方法对牛乳铁素 Lfcin B1-10和Lfcin B 进行了比较分析。研究发现二者均为不稳定的强阳离子型亲水性抗菌肽，均没有跨膜区和信号肽，均可被机体内多种酶降解，生物安全性较高。与Lfcin B 相比，Lfcin B1-10保留了 Lfcin B 的最大抗菌活性，二级结构仅含有无规卷曲，较为简单。为进一步研究牛乳铁素 Lfcin B1-10的构效关系、抗菌机制提供了理论参考，也为发现和临床开发牛乳铁素衍生抗菌肽提供了有价值的实际应用信息。参考文献：1 Iglesias-Figueroa B，Valdiviezo-Godina N，Siqueiros-Ce-nd佼n T，et al.High-Level expression of recombinant bovinelactoferrin in pichia pastoris with antimicrobial activity J.Int J Mol Sci，2016，17（6）：902.2 Masson P L，Heremans J F，Dive C H.An iron-binding pr-otein common to many external secretions J.Clinica Chi-mica Acta，1966，14（6）：735-739.3 张釜诚.乳铁蛋白的分离制备研究 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