奶牛乳房炎主要致病菌PCR检测分析.pdf

近年，越来越多的PCR检测技术广泛应用于奶牛乳房炎主要致病菌的诊断，如悉尼尼根等1构建了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及支原体等致病菌的多重PCR鉴定方法；许信刚等2建立链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及大肠杆菌4种致病菌的多重PCR鉴定方法。但大多数PCR检测方法的建立都是基于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等致病菌，一些奶牛乳房炎新发现的致病菌的PCR检测方法较少，不能更全面地反应乳房炎奶牛乳腺中的病原感染情况。近年研究表明，集约化牧场乳房炎主要以隐性乳房炎为主，乳房炎的致病菌主要是凝固酶阴性葡萄球菌、芽孢杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌等环境性病原菌，该类环境性病原菌快速检测技术的开发与应用，将为奶牛乳房炎的防控提供提供重要参考。收稿日期：2023-06-05基金项目：宁夏回族自治区重点研发计划项目重大项目（2021BEF01001）；宁夏回族自治区重点研发计划项目重点项目（2021BEF02028）；国家自然科学基金（31960348，31560713）作者简介：高鹰（1998-），女，硕士，从事奶牛乳房炎相关研究。*通信作者简介：余永涛（1980-），男，教授，硕士生导师，研究方向：动物临床疾病诊疗技术。高鹰，苑双杰，余永涛奶牛乳房炎主要致病菌PCR检测分析J现代畜牧科技，2023，99（8）：32-35doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.007GAO Ying，YUAN Shuangjie，YU YongtaoPCR Detection of the Main Pathogens of Mastitis in CowsJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：32-35奶牛乳房炎主要致病菌PCR检测分析高鹰，苑双杰，余永涛*（宁夏大学动物科技学院，宁夏 银川 750021）摘要：本研究应用特异性引物，扩增出大肠杆菌16SrRNA基因、表皮葡萄球菌rdr基因、绿脓杆菌eta基因、金黄色葡萄球菌16S rRNA基因、肺炎克雷伯氏菌khe基因、溶血葡萄球菌sodA基因、乳房链球菌cpn60基因、松鼠葡萄球菌gap基因、蜡样芽胞杆菌hblA基因、奇异变形杆菌ure基因、无乳链球菌16S rRNA基因、产色葡萄球菌sodA基因等基因的特异性片段，制备含有各病原菌特异性基因片段的阳性对照质粒，应用PCR检测方法对乳房炎样品进行病原菌检测。检测结果结果表明，大肠杆菌的检出率最高（76.19%），其次为凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌（26.19%）、乳房链球菌（45.24%）、铜绿假单胞菌（40.48%）、金黄色葡萄球菌（11.90%）、肺炎克雷伯氏菌（16.67%）、蜡样芽胞杆菌（4.76%）、奇异变形杆菌（4.76%），其中凝固酶阴性葡萄球菌中产色葡萄球菌的检出率最高（57.14%）。关键词：奶牛乳房炎；致病菌；PCR检测中图分类号：S858.23文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.007PCR Detection of the Main Pathogens of Mastitis in CowsGAO Ying，YUAN Shuangjie，YU Yongtao*（School of Animal Science and Technology，Ningxia University，Yinchuan Ningxia 750021，China）Abstract：In this study，specific primers were usedWe amplified 16SrRNA gene of Escherichia coli，rdr gene of Staphylococcus epidermidis，eta gene of P.aerosa，16S rRNA gene of Staphylococcus aureus，khe gene of Klebsiella pneumoniae，sodA gene of Staphylococcus haemolyticus，cpn60 gene of Streptococcus mammary，gap gene of Staphylococcus squirrel，hblA gene of Bacillus cereus.Specific fragments of Proteus mirabilis ure gene，Streptococcus agalactis 16S rRNA gene，Staphylococcus chromogenes sodA gene and other genes were used to prepare positive control plasmids containing specific gene fragments of each pathogenPCR was used to detect pathogenic bacteria in mastitis samplesThe results showed that the detection rate of E.coli was the highest（76.19%）It was followed by coagulase negative staphylococcus，Streptococcus agalactis（26.19%），Streptococcus mastosus（45.24%），Pseudomonas aeruginosa（40.48%），Staphylococcus aureus（11.90%），Klebsiella pneumoniae（16.67%），Bacillus cereus（4.76%）and Proteus mirabilis（4.76%）Coagulase negative staphylococcus had the highest detection rate（57.14%）Keywords：cow mastitis，Pathogenic bacteria，PCR detection332023.8试验研究1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品及菌株采集宁夏银川市A奶牛场健康奶牛和乳房炎牛奶样品共计42份样品，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、溶血葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、产色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌菌株均为本实验室分离鉴定保存。1.1.2 主要试剂耗材主要试剂耗材见表1。表1 试验材料试剂生产厂家PCR引物上海生工工程股份有限公司PMDTM19-TVectorCloningKitTaKaRa公司PremixTaqTMTaKaRa公司GelRed核酸染料美国Biotium公司50TAE，氨苄青霉素国产感受态大肠杆菌DH5北京天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒北京天根生化科技有限公司普通DNA产物纯化试剂盒北京天根生化科技有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒北京天根生化科技有限公司1.1.3 主要仪器主要仪器设备见表2。1.1.4 主要培养基及其制备方法LB固体培养基：称取LB肉汤5 g，琼脂粉3 g溶于200 mL蒸馏水中，将其分装于500 mL蓝盖透明玻璃试剂瓶中，121 高压灭菌15 min，冷却至50 时加入2 mL氨苄青霉素，混匀后倾入90 mm培养皿中。表2 试验仪器试验仪器生产厂家AR1140电子天平美国奥豪斯公司TOMY全自动高压灭菌锅SX500日本TOMY公司高速离心机Eppendorf公司移液器美国Thermo Fisher公司DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱海门市恒昌仪器厂VS-840K-V超净工作台苏州安泰空气技术有限公司BL-33全自动台式制冰机上海比朗有限公司微波炉美的有限公司凝胶成像系统Bio-Rad公司PCR仪Bio-Rad公司超纯水系统Eppendorf公司超低温冰箱SANYO公司DYY-6C型电泳仪北京六一仪器厂LB液体培养基：称取LB肉汤5 g，琼脂粉3 g溶于200 mL蒸馏水中，将其分装于500 mL蓝盖透明玻璃试剂瓶中，121 高压灭菌15 min，冷却至50 时加入2 mL氨苄青霉素。SOC培养基：称取本品0.628 g，将其溶于20 mL蒸馏水中，分装于100 mL蓝盖透明玻璃试剂瓶中，121 高压灭菌15 min。1.2 方法1.2.1 PCR反应体系的建立参考文献合成特异性引物3，并由上海生工生物工程有限公司合成。按照110的比例稀释后分装于-20 备用。引物序列见表3。表3 引物序列致病菌基因引物序列（53）目的片段大小（bp）Tm（）产色葡萄球菌sodAGCGTACCAGAAGATAAACAAACTC22260CATTATTTACAACGAGCCATGC溶血葡萄球菌sodACAAATTAAATTCTGCAGTTGAGG214AGAGCCCCATTGTTCTTTGA表皮葡萄球菌rdrAAGAGCGTGGAGAAAAGTATCAAG130TCGATACCATCAAAAAGTTGG松鼠葡萄球菌gapGATTCCGCGTAAACGGTAGAG306CATCATTTAATACTTTAGCCATTG无乳链球菌16S rRNAGCTAATACCGCATAAGAGTAATTAAC317GGTAGATTTTCCACTCCTACCAA乳房链球菌cpn60TCGCGGTATTGAAAAAGCAACAT400TGCAATAATGAGAAGGGGACGAC奇异变形杆菌ureRGCGGTTTCGCAATAGG95155TTGGCGAGATTGAGTGC肺炎克雷伯氏菌KheATGAAACGACCTGATTGCATTCGC42555TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC蜡样芽孢杆菌hblAGGACACGATGTTAGAGCATTTGG99553GATACAGCGAGTAGTTTATTAGGGATT铜绿假单胞菌ETACGGTAACCAGCTCAGCCACA37555CGATGACTGATGACCGTGGG金黄色葡萄球菌16SrRNAGGACGACATTAGACGAATCA1 31953CGGGCACCTATTTTCTATCT大肠杆菌16SrRNAGCCTCGCCTGGAGAATGA27256CCTGAGACTGCGGTGGAA34 2023.8试验研究以先前分离鉴定的菌株DNA为模板，进行病原菌特异性DNA片段的PCR扩增。PCR反应体系为Premix 12.5L，ddH2O 10.5L，上游引物0.5L，下游引物0.5L，DNA模板1L，总反应体系为25L。PCR反应条件见表4。1.2.2 胶回收与PMD19-T载体的连接使用北京天根的胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，严格按照说明书进行操作。表4 PCR反应条件细菌名称反应条件产色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌94 预变性5 min，94 变性30 s，60 退火30 s，30个循环，72 延伸45 s，72 终延伸10 min肺炎克雷伯氏菌94 预变性3 min，94 变性60 s，55 退火45 s，30个循环，72 延伸60 s，72 终延伸10 min蜡样芽胞杆菌94 预变性10 min，94 变性30 s，53 退火30 s，30个循环，72 延伸45 s，72 终延伸10 min绿脓杆菌95 预变性5 min，95 变性60 s，55 退火30 s，35个循环，72 延伸30 s，72 终延伸7 min奇异变形杆菌94 预变性5 min，94变性30 s，55 退火30 s，30个循环，72 延伸80 s，72 终延伸10 min金黄色葡萄球菌95 预变性5 min，95 变性30 s，53 退火30 s，30个循环，72 延伸60 s，72 终延伸10 min大肠杆菌94 预变性5 min，94 预变性45 s，56 退火45 s，35个循环，72 延伸50 s，72 终延伸8 min载体连接的详细步骤如下。将PMDTM19-T载体与12种致病菌的基因片段胶回收产物进行连接反应，连接体系为PMDTM19-T 0.5L，纯化好的目的片段4.5L，Soultion I 5L。试剂在冰上融化，混匀后使用PCR仪16 过夜连接。提前打开42 水浴锅，制冰，制SOC液体培养基，含氨苄青霉素的LB固体培养基和液体培养基。（1）取感受态一管100L，冰上溶解1015 min。（2）将连接好的载体全部加入至感受态细胞中，冰上放置30 min。（3）取出后42 水浴加热90 s，随后冰上放置3 min（期间不能摇晃菌液）。（4）加入890L SOC液体培养基并封口，37，200 r/min摇菌1 h，然后2 000 r/min离心4 min。（5）丢弃800L上清，然后将菌体吹打混匀，分别取10、20、30、40L菌液涂到含氨苄青霉素的LB固体培养板上，37 恒温培养箱培养1214 h。（6）在1.5 mL离心管中加入750L含氨苄青霉素的LB液体培养基，用10L枪头挑取45个不同的白色菌落直接放到管中轻微振荡，37 振荡培养1014 h。（7）将培养的菌分别做菌液PCR，选择阳性菌液按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒。（8）用提取的质粒为模板进行PCR检查，确定有目的条带片段后，将质粒送去测序验证，然后将剩余的阳性菌液保种。1.3 乳样DNA的提取使用血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取乳样DNA，严格按照说明进行操作。1.4 乳样病原菌的PCR检测用制备好的质粒做阳性对照，使用上述PCR反应条件，以乳样DNA为模板对乳样进行PCR检测，统计各病菌在样品中的检出率。2 结果2.1 PCR扩增和重组质粒的制备应用特异性引物，本研究扩增出大肠杆菌16S rRNA基因、表皮葡萄球菌rdr基因、绿脓杆菌eta基因、金黄色葡萄球菌16S rRNA基因、肺炎克雷伯氏菌khe基因、溶血葡萄球菌sodA基因、乳房链球菌cpn60基因、松鼠葡萄球菌gap基因、蜡样芽胞杆菌hblA基因、奇异变形杆菌ure基因、无乳链球菌16S rRNA基因、产色葡萄球菌sodA基因等基因的特异性条带，并制备了含有各病原菌特异性基因片段的核酸重组质粒，电泳结果见图1至图4。2.2 乳房炎乳样中主要致病菌的PCR检测结果检测结果表明，大肠杆菌的检出率最高76.19%（32/42），其次为凝固酶阴性葡萄球菌，其中凝固酶阴性葡萄球菌中产色葡萄球菌的检出率最高57.14%（24/42）、松鼠葡萄球菌4.76%（2/42）、溶血葡萄球菌7.14%（3/42）以及表皮葡萄球菌9.52%（4/42）。无乳链球菌与乳房链球菌的检出率分别为26.19%（11/42）和45.24%（19/42）、铜绿假单胞的检出率为40.48%（17/42）、金黄色葡萄球菌11.90%（5/42）、肺炎克雷伯氏菌16.67%（7/42）、蜡样芽胞杆菌4.76%（2/42）、奇异变形杆菌4.76%（2/42）。其中有3份样品仅检出一种病原，10份样品检测出2种病原，22份样品检测出3种病原，7份样品检测出4种以上病原。图1 大肠杆菌16SrRNA基因、表皮葡萄球菌rdr基因部分核酸序列重组质粒PCR鉴定结果M：DL2000 Marker；12：大肠杆菌重组质粒；35：阴性对照；67：表皮葡萄球菌重组质粒；8：阴性对照352023.8试验研究编辑：韩若图2 溶血葡萄球菌sodA基因、乳房链球菌cpn60基因、松鼠葡萄球菌gap基因、蜡样芽胞杆菌hblA基因、奇异变形杆菌ure基因部分核酸序列重组质粒PCR鉴定结果M：DL2000 Marker；12：溶血葡萄球菌重组质粒；34：乳房链球菌重组质粒；56：松鼠葡萄球菌重组质粒；7：阴性对照；89：蜡样芽胞杆菌重组质粒；1013：奇异变形杆菌重组质粒；14：阴性对照图3 无乳链球菌16SrRNA基因、产色葡萄球菌sodA基因部分核酸序列重组质粒PCR鉴定结果M：DL2000 Marker；1：无乳链球菌重组质粒；2：产色葡萄球菌重组质粒；3：阴性对照图4 绿脓杆菌eta基因、金黄色葡萄球菌16SrRNA基因、肺炎克雷伯氏菌khe基因部分核酸序列重组质粒PCR鉴定结果M：DL2000 Marker；12：绿脓杆菌重组质粒；3：阴性对照；45：金黄色葡萄球菌重组质粒；6：阴性对照；78：肺炎克雷伯氏菌重组质粒；9：阴性对照3 讨论与结论检测结果表明，大肠杆菌的检出率最高76.19%，凝固酶阴性葡萄球菌57.14%、无乳链球菌与乳房链球菌的检出率分别为26.19%和45.24%，铜绿假单胞的检出率为40.48%，肺炎克雷伯氏菌16.67%、蜡样芽胞杆菌4.76%、奇异变形杆菌4.76%。且本试验结果表明大多数奶牛都感染了多种致病菌。Gao J等4研究表明，最常见的病原菌的检出率由高至低分别为大肠杆菌、克雷伯氏菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌和金黄色葡萄球菌，本研究结果与其基本一致。Meiri-Bendek I等5基于16S rRNA基因设计引物，用于奶牛乳房炎源性的无乳链球菌的PCR检测。Khan M A等6利用金黄色葡萄（nuc）基因设计特异性引物，建立了用于诊断金黄色葡萄球菌的PCR体系，其准确度高并且特异性与敏感性也明显高于传统分类学方法。因普通PCR检测法一次只能对一种病原菌进行检测，国内外学者都在开发可以同时诊断多种病原菌的多重PCR检测方法。实时荧光定量PCR检测技术使PCR检测从定性到定量的飞跃，其灵敏度更高更省时省力，但因其成本高检测费用贵等方面的原因限制了其在基层牛场或兽医站的推广使用。虽然各种PCR检测方法均存在不同的问题，但其在奶牛乳房炎诊断领域仍具有广阔的应用前景。参考文献1希尼尼根，李桂宇，于景丽奶牛乳房炎病原菌多重PCR检测方法的建立J黑龙江畜牧兽医，2020（12）：60-632许信刚，杨丽花，童德文链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用J中国兽医学报，2012，32（4）：534-5383Shome B R，Das Mitra S，Bhuvana M，et alMultiplex PCR assay for species identification of bovine mastitis pathogensJJ Appl Microbiol，2011，111（6）：1 349-1 3564Gao J，Barkema H W，Zhang L，et alIncidence of clinical mastitis and distribution of pathogens on large Chinese dairy farmsJJ Dairy Sci，2017，100（6）：4 797-4 8065Meiri-Bendek I，Lipkin E，Friedmann A，et alA PCR-based method for the detection of Streptococcus agalactiae in milkJJ Dairy Sci，2002，85（7）：1 717-1 7236Khan M A，Kim C H，Kakoma I，et alDetection of Staphylococcus aureus in milk by use of polymerase chain reaction analysisJAm J Vet Res，1998，59（7）：807-813