奶酪发酵剂红曲霉的筛选及其对奶酪理化、质构和抗氧化性的影响.pdf
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1、为筛选适宜用作奶酪发酵剂的红曲霉菌株,通过对传统红曲发酵食品进行增菌培养,采用平板划线法初筛。将初筛菌株以一种新型短期成熟工艺制备奶酪进行风味品评复筛,最终筛选出6 株疑似红曲霉的风味优势菌,通过DNA序列比对,确认为红曲霉。将6 株优势菌以短熟工艺制备奶酪样品,并进行安全性、功能性、理化指标、质构和抗氧化性的检测,分析其对奶酪品质的影响。结果表明,红曲霉菌株BC20及ZX-99同时具备食用安全性及奶酪熟化能力。在奶酪成熟结束时,奶酪样品中的桔霉素含量皆低于国标检测限2 5ug/kg,远低于定量限8 0 g/kg,p H 4.6 可溶性氮含量分别为(40.990.90)%、(2 6.0 50.
2、56)%。该研究筛选出2 株适宜制作成熟奶酪的红曲霉菌株,提供了一种制备红曲霉奶酪的新型短熟工艺,为红曲霉奶酪品质的优化及缩短成熟期、减少生产成本提供依据。关键词红曲霉;风味菌株筛选;短期成熟;安全性与功能性;理化指标;质构分析;抗氧化性奶酪是一种传统发酵乳制品,种类数以千计,按照成熟菌种可分为细菌成熟、霉菌成熟和酵母菌成熟。目前,青霉、白霉常被用于制作霉菌成熟奶酪,常见的有蓝纹奶酪、布里奶酪、卡蒙贝尔奶酪(Camem-bert cheese)等。青霉所制备的奶酪由于蛋白水解及脂肪分解的程度较高,往往气味刺激、口感辛辣1-2 。相比之下,白霉所制备的奶酪在气味和口味上会更加温和。同是霉菌的红曲
3、霉,在我国虽长久以来被用于发酵食品中,例如红曲酒、红曲醋、红腐乳等3-5,却鲜少有人将其用于奶酪加工。在具备可食用性的基础上,红曲霉还可以生产红曲色素、-氨基丁酸、莫纳可林K及其他生物活性化合物6-8 ,益处良多。成熟一直是奶酪制作中相对昂贵的过程,通过改变成熟条件、筛选发酵菌株,可在不降低奶酪品质的基础上减少奶酪的成熟时间,对奶酪行业的发展具有重大意义。本实验从上海农家自制腐乳、福建农家自制酒糟中分离红曲霉菌株,以马铃薯葡萄糖琼脂(potato dex-trose agar,PDA)培养基分离纯化得到红曲霉,将分离出的红曲霉与实验室提供的10 株红曲霉菌株以一种新型短期成熟工艺进行奶酪制备,
4、再通过感官风味评第一作者:硕士研究生(刘振民教授级高级工程师为通信作者,E-mail:)基金项目:“十四五”国家重点研发计划项目(2 0 2 2 YFD2100704)收稿日期:2 0 2 2-12-0 2,改回日期:2 0 2 2-12-16定筛选能带来优良风味的菌株。随后对优良风味菌所成熟的奶酪样品进行理化分析、安全分析等。实验制作了一种红曲霉成熟奶酪,加工工艺借鉴了卡蒙贝尔奶酪,在其基础上优化了加工参数,创新出一种表面红色的霉菌奶酪,命名为上海玫瑰奶酪(ShanghaiRose cheese)。本研究旨在获得适宜用于成熟奶酪且能带来优良风味的红曲霉菌株,为进一步分析红曲霉奶酪优良特征风味
5、物质提供实验菌株。1材料与方法1.1材料与仪器红腐乳,上海农贸市场;红曲酒糟,福建宁德、古田、南平农场;牛乳、稀奶油、脱脂乳,光明乳业股份有限公司;10 株筛自红曲腐乳的红曲霉菌株,乳业生物技术国家重点实验室;商业发酵剂FLORA、ST I-13以及凝乳酶,科汉森(中国)有限公司;马铃薯葡萄糖肉汤(potatodextrosebroth,PD B)培养基、琼脂粉,青岛海博生物技术有限公司;CLOVER桔霉素免疫亲和柱,北京中检维康生物技术有限公司;NaCl、Na O H、HCI、硼酸、甲基红、亚甲基蓝,国药集团化学试剂有限公司;总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法、FRAP2023年第49 卷第
6、17 期(总第48 5期)127食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES法),上海碧云天生物技术有限公司;总抗氧化能力检测试剂盒(DPPH法),上海生工生物工程股份有限公司。生物安全柜,美国Thermo Scientific;电子天平,北京赛多利斯科学仪器有限公司;HVE-50高压蒸汽灭菌锅,日本HIRAYAMA;奶酪槽,英国Armfiled;HPP110奶酪成熟箱,德国MEMMERT;A c q u i t y U P-LC/FLR/SQD2超高效液相色谱-四极杆质谱仪,美国Waters;A g ile n t 12 6 0 I 高效液相色谱仪-配荧光检测器,
7、安捷伦;KT260凯氏定氮仪,丹麦FOSSScino;TA.XTplus质构分析仪,英国StableMicro Systems;Spec-tramaxM5酶标仪,美国Molecular Devices;DS-11超微量紫外分光光度计,美国DeNovix。1.2实验方法1.2.1菌株分离纯化向PDB培养基中加人1.2%(质量分数,下同)琼脂,制备PDA平板。向脱脂乳中加人1.2%琼脂,配制脱脂乳琼脂平板。取5g红曲腐乳或红曲酒糟,于PDB培养基中,置于17 0 r/min、32 下培养7 d,进行增菌培养。随后用接种环将PDB培养基接种于PDA于32 培养7 d,再挑选疑似红曲霉菌落继续划线纯化
8、3 5次,直至平板上仅有1种菌落。将单菌落分别接种于PDA及脱脂乳琼脂平板,32 下培养7 d,记录菌落形态。最终筛选出的菌株,送至上海杰李生物技术有限公司进行测序。1.2.2红曲霉发酵剂的准备从PDA培养基中取少量红曲霉菌丝接种于含120mLPDB培养基的2 50 mL锥形瓶中,17 0 r/min、32下培养7 d。随后,用装有约1cm高度脱脂棉的5mL注射器对培养后的菌液进行过滤。经平板计数,此时滤液中的活菌含量为10 CFU/L。滤液常温保存,现用现制。1.2.3奶酪的制作根据JIAO等10 1的方法稍作修改,具体工艺如下所示,整个制备及成熟过程需要严格保持卫生。原料乳标准化巴氏杀菌冷
9、却添加商业发酵剂发酵至pH6.4添加凝乳酶凝乳切割排乳清装模成型一17%盐水腌渍晾干涂抹红曲霉发酵液28 有氧成熟 14 d对于奶酪的分析,取样方法为将整块奶酪的表皮与内部混合均匀后取样,所有实验重复3份。1.2.4感官风味评价体系构建分别参考GALLI等、XIA等12】、DIEZHANDI-1282023 Vol.49 No.17(Total 485)NO等13 对霉菌(白霉、红曲霉、青霉)成熟奶酪的感官评定指标以及国标GB/T102212021感官分析术语,对感官风味评价体系进行构建。品评小组由20人组成(10 名奶酪研发人员,10 名资深奶酪爱好者,皆有丰富的奶酪品评经验),评分方法如表
10、1所示。表1红曲霉奶酪感官评定方法Table 1Sensory evaluation of Monascus cheese评价内容苦味、酸味、滋味程度适中,感官好,有点喜欢咸味、鲜味、滋味程度一般,感官普通,不讨厌也不喜欢甜味、刺激滋味程度欠缺或过重,可接受,一般不喜欢性(各7 分)滋味程度欠缺或过重,不接受,很不喜欢感官特别好,且有其自身特有的滋味,很喜欢滋味感官好,有其自身特有的滋味,风味较好,有点喜欢整体滋味感官适中,滋味良好,较淡,不喜欢也不讨厌(15分)感官有瑕疵,滋味合格,较淡,可接受,一般不喜欢感官最差,有明显异味,不能接受,很不喜欢无霉味有轻微霉味,不易察觉霉味(7 分)有轻微
11、霉味,不明显,可接受霉味明显,不可接受霉味明显,气味较大,不可接受有其自身特有的香气,程度适中,很喜欢有其自身特有的香气,程度适中,有点喜欢香味(7 分)无香味,或程度一般,不讨厌也不喜欢气味程度欠缺或过重,可接受,一般不喜欢程度欠缺或过重,不接受,很不喜欢感官特别好,且有其自身特有的气味,很喜欢感官好,有其自身特有的气味,有点喜欢整体气味感官适中,气味良好,较淡,不喜欢也不讨厌(15分)感官有瑕疵,气味合格,较淡,可接受,一般不喜欢感官最差,有明显异味,不能接受,很不喜欢色泽鲜艳,有食欲,很喜欢色泽(7 分)色泽一般,不喜欢也不讨厌色泽和组色泽过淡或过深,无食欲,不喜欢织状态组织细腻,质地软
12、硬适中组织状态组织较细腻,质地稍软或稍硬(7 分)组织粗糙或疏松,质地过硬或过软1.2.55安全性及功能性物质含量的测定桔霉素含量的测定:参考GB5009.2222016食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定。洛伐他汀与-氨基丁酸含量的测定:称取200mg样品,加人含1mL乙醇的研磨管中,6 0 Hz研磨3min后以12 0 0 0 r/min离心15min,取上清液进行1倍稀释,对于物质含量较高的上清液样品进行100倍稀释,计算物质含量时带入相应的稀释倍数。洛伐他汀使用Waters,BE H C 18 色谱柱(2.1mm100mm,1.7m),-氨基丁酸使用Waters,BE H T 3评分参
13、考滋味程度适中,感官特别好,很喜欢分值7564231次13 15101279461375642317564231次13 1510 127946135741357413研究报告色谱柱(2.1 mm100 mm,1.7m)。流动A相为进行测定。0.1%甲酸水溶液,B相为乙腈,柱温40,流速1.2.7奶酪质构的测定0.25mL/min,进样量2 L,质谱选择离子模式m/z=使用P/50探头,测试前与测试后速度为5mm/s,104,洗脱条件如表2 所示。测试速度为1 mm/s,测试距离为7 mm。根据测量结表2 超高效液相色谱-四极杆质谱仪梯度洗脱条件果,由仪器自带软件进行质地剖面分析(texture
14、 pro-Table 2Gradient elution conditions of UHPLC-quadrupole洛伐他汀洗脱条件时间/minA相/%B相/%时间/minA相/%B相/%095810121012.19515951.2.6奶酪理化指标的测定水分含量测定:参考CB5009.32016食品安全国家标准食品中水分的测定的直接干燥法。脂肪含量测定:参考GB5009.62016食品安全国家标准食品中脂肪的测定的碱水解法。蛋白质含量测定:参考CB5009.52016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定的凯氏定氮法。pH4.6可溶性氮含量测定:参考袁然等14 方法样品苦味酸味咸味鲜味甜味刺激
15、性整体滋味霉味香味整体气味颜色组织状态得分BC185.5BC175.5ZX-995.2BC204.7BC075.0X2-24.9BC153.9X4-23.9BC133.6BC143.6ZX-24.1ZX-14.1X5-14.2X4-14.1X6-23.9X2-14.2BC103.5X5-23.5BC043.9X6-13.6X4-43.7X6-32.6X4-32.8BC012.8X5-33.2注:各指标的得分为2 0 位品评员给分的平均值,统计结果显示标准偏差均在0 1之间。file analysis,TPA)。mass spectrometer1.2.8奶酪抗氧化性的测定-氨基丁酸洗脱条件按照
16、所购试剂盒的使用说明进行测定。1.2.9数据处理50902906512512.1Table3Sensory score of Monascus cheese滋味气味5.25.25.34.95.05.24.35.24.75.24.55.24.14.34.3.4.54.03.73.93.73.83.83.33.84.23.54.33.84.14.13.33.62.63.13.13.73.23.63.13.84.24.43.83.92.73.74.34.04.33.59999101099表3红曲霉奶酪感官得分5.74.75.54.64.35.86.05.05.64.05.94.24.14.04.74
17、.04.14.04.24.03.84.03.94.04.24.03.84.04.14.04.14.03.84.04.14.04.14.03.84.04.64.03.94.04.44.03.73.72.64.011909014.34.24.34.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.03.94.04.04.04.04.04.04.03.24.0液相数据采用Empower软件进行分析,其余数据由Excel、SPSS2 6.0 进行处理,系统发育树由MEGA11进行构建,柱状图由Origin2021完成。2结果与分析2.1红曲霉奶酪感官评价根据红曲霉的菌落外观、颜色、正反
18、面差别等特征,从红曲腐乳、红曲酒糟中初步分离出15株疑似红曲霉菌株。将这15株自分离菌株与实验室提供的10株红曲霉用于奶酪制备,并进行感官评价。如表3所示,按照构建的感官风味评价体系,对制备的红曲霉奶酪样品进行评分。总体12.46.212.35.712.65.411.55.410.35.211.04.78.24.78.34.27.85.07.64.97.75.67.85.57.64.27.74.27.04.28.83.77.74.56.83.96.43.57.43.85.73.17.13.85.73.76.32.84.93.6颜色和组织状态6.311.96.311.35.910.53.67.2
19、5.610.35.49.94.18.54.07.34.18.64.18.54.07.84.07.84.07.64.07.74.07.74.06.94.07.84.07.14.06.64.06.94.05.74.07.04.07.04.04.54.06.92023年第49卷第17 期(总第48 5期)3.63.64.36.43.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.65.23.66.56.64.56.65.65.54.45.04.34.54.23.53.93.43.84.24.54.24.73.54.53.45.05.14.2
20、77.575.873.069.969.168.857.957.856.856.656.455.355.054.654.554.353.152.051.651.551.551.150.649.648.8129食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES根据感官得分情况,选取奶酪得分在6 0 分以上的红曲霉菌株进行菌种鉴定及二次筛选,即BC18、BC17、ZX-99、BC 2 0、BC 0 7、X 2-2。这6 株菌制作的奶酪皆咸鲜适中,滋、气味良好。其中,BC20奶酪在苦味、酸味、气味方面的评分相对较低,这可能是由于菌株发酵能力较强,奶酪的成熟度比其余5款奶酪高而导致
21、的。ZX-99奶酪在鲜味和组织状态的评分相对较低,这可能是由于奶酪的成熟度比其余5款奶酪低,导致风味不足,奶酪质地偏硬。对于这2 种情况,后续可通过调整成熟时间、成熟温度或其他工艺优化来进行改善。由气味部分的评分可知,整体气味的得a分与霉味、香味的得分呈正相关。说明霉味的存在会破坏奶酪整体的气味,一些奶酪因具有其自身特有的香气而对奶酪整体气味具有较大积极作用。由颜色部分的评分可知浅色的奶酪外表比深色的奶酪外表更受欢迎,深色外表的奶酪由于彼此之间颜色差异较小而得分接近。2.2红曲霉分离鉴定2.2.1红曲霉的菌落特征经感官筛选后,从菌种库菌株及自分离菌株中优选出的红曲霉菌落如图1、图2 所示。ba
22、-BC07;b-BC17;c-BC18;d-BC20;e-X2-2;f-ZX-99图1红曲霉菌落形态图(PDA)Fig.1Colony morphology of Monascus(PDA)a-BC07;b-BC17;c-BC18;d-BC20;e-X2-2;f-ZX-99图2 红曲霉菌落形态图(脱脂乳琼脂)Fig.2Colony morphology of Monascus(skim milk agar)由图1、图2 可知,BC07、BC 17、BC 18、X 2-2 的菌落形态较为相似。在PDA平板中菌落呈橘红色,其营养菌丝体密布在营养基质内部,边缘呈不规则花瓣状,气生菌丝较为疏松、丝状交
23、织。在脱脂乳琼脂平板中,菌落呈深红色,表面毛绒状菌丝不明显,菌落边缘趋于圆形。BC20、ZX-99的菌落形态较为相似。在PDA平板中表面呈同心圆状,菌落色泽较浅,BC20的气生菌丝较为密集、丝状交织,ZX-99的气生菌丝较为致密。在脱脂乳琼脂平板中,营养菌丝体为深红色,气生菌丝体为粉白色。以上6 株菌的菌落形态与KUMURA等15 记录的红曲霉属相似,故初步认定其为Monascus。由图2 可知,这6 株菌在脱脂乳基质中生长状态良好,有望用于奶酪制备。2.2.2生物学鉴定根据EL-DAWY等【16 对分离自柑橘类水果的青霉菌进行系统发育分析的方式进行修改。将2.1节1302023 Vol.49
24、 No.17(Total 485)中筛选出的优良风味菌进行DNA测序,于NCBI中挑选序列相似性较高的红曲霉菌株,通过MEGA11的ClustalW程序进行比对,使用邻接法推断进化历史,进行1 0 0 0 次相似度重复计算构建发育树17 。具体如图3所示,上标“T”代表模式菌株,括号内为登录号。根据发育树构建结果,鉴定菌株BC07、BC17、BC18、X 2-2、BC2 0、ZX-99为红曲霉属(Monas-cus)。结合菌落特征、生物学鉴定以及KUMURA等15 对于不同红曲霉菌株在乳清蛋白基质上生长情况的记录,初步推测BC07、BC 17、BC 18、X 2-2 为紫色红曲霉(Monasc
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