卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFvmGM-CSF融合蛋白.doc

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/mGM-CSF 融合蛋白的构建、表达及活性测定

    【摘要】　目的　构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv和鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM)，以观察其在动物体内诱导的特异性免疫反应，为卵巢癌抗独特型疫苗应用于临床提供依据。　方法　用DNA重组技术，将mGM-CSF连于单链抗体6B11ScFv羧基末端，构建重组质粒pET30-6B11mGM，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导，以包涵体形式获高效表达，超声破碎细菌细胞获得包涵体，用8mol.L-1尿素溶解包涵体后直接稀释复性，SDS-PAGE分析蛋白纯度，ELISA分析技术和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性。　结果　复性蛋白纯度达90%以上。采用氧化型谷胱甘肽(GSSG)浓度为1mmol.L-1，还原型谷胱甘肽(GSH)浓度为5mmol.L-1，10℃复性48h，复性率达36%。表达的融合蛋白分别能与COC166-9单抗和大鼠抗小鼠GM-CSF单抗特异结合，并能刺激mGM-CSF依赖株NFS-60细胞增殖。　结论　以包涵体表达的融合蛋白6B11mGM保留了两种蛋白的活性，为研究融合蛋白在体内的免疫功能提供了基础。
　　【关键词】　卵巢癌；重组融合蛋白；抗体；抗独特型；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；包涵体
　　【中分类号】　R392.11　【文献标识码】　A　【文章编号】　0529-1356(2000)03-226
THE CONSTRUCTION， EXPRESSION AND ACTIVITY EXAMINATIONS
OF 6B11ScFv／MURINE GM-CSF FUSION PROTEIN
LIU Bei,CUI Heng?, FENG Jie, YE Xue, LI YI, CAO Shan-jin, GE Hua, FU Tian-yun, YAO Yu, QIAN He-nian
(Gynecologic Oncology Center, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing　100044, China)
　　【Abstract】　Objective　　To construct expression vector which expresses fusion protein of antiidiotypic single chain antibody 6B11ScFv and murine GM-CSF(6B11mGM) for observing its possible immune reactions in vivo. Methods　Using DNA recombinant techniques, the murine GM-CSF cDNA gene was recombined to 6B11ScFv and they were cloned into expression vector pET-30a(+) to produce insoluble protein. Inclusion bodies collected after the breakage of bacteria through sonication were subjected to repeatedly washing. Inclusion bodies solubilized in the resence of 8 mol.L-1 urea were diluted with renaturation solutions so that folding process could be initiated. The purity was examined by SDS-PAGE, ELISA and cell proliferation assay were used to determine the activities of fusion protein. Results　6B11mGM fusion proteins were obtained with a purity of over 90%. The optimum conditions were 1mmol.L-1 and 5 mmol.L-1 for the concentrations of GSSG and GSH, respectively, with 48 hours at 10℃ as renatured time. Fusion protein could specifically react with the primary anti-ovarian carcinoma monoclonal antibody(COC166-9) and rat anti-mouse GM-CSF monoclonal antibody, respectively, and fusion proteins could also stimulate murine GM-CSF dependent cell line NFS-60 cells to proliferate. Conclusion　Fusion proteins 6B11mGM expressed as inclusion bodies can keep the activity of both the proteins and provid foundation to research the immunoreactions in vivo.
　　【Key words】　Ovarian carcinoma; Recombinant fusion proteins; Antibodies, Anti-idiotypic; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; Inclusion bodies
　　本中心曾用卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB／c小鼠，制备了单克隆抗体COC166-9。经免疫组织化学染色证实该抗体对卵巢上皮癌具有较高的特异性［1］。继而用COC166-9单抗免疫小鼠制备了内影像型抗独特型抗体6B11。经免疫竞争抑制试验证实，该抗体具有模拟卵巢上皮癌初始抗原OC166-9的作用［2］，可在体内外诱导产生特异的抗卵巢癌免疫反应［3，4］。为了降低鼠源性抗体反复在体内应用时可能引起的副作用，本中心对卵巢癌抗独特型抗体6B11进行改造，构建了单链抗体6B11ScFv［5］。改型后的抗体，虽降低了鼠源性，但同时因分子量减少，免疫原性也随之下降，应用时必须与匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)等偶联并加用佐剂才能引起有效的免疫反应［6］，而现在常用佐剂往往对人体有害。因此，有必要寻求一种新的佐剂。最近研究表明粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)等细胞因子与抗原构成的融合蛋白，可增加抗原的免疫原性［7］。为提高单链抗体6B11ScFv的免疫原性，使其能做为卵巢癌抗独特型疫苗，本中心已构建成功6B11ScFv与人GM-CSF融合蛋白(6B11GM)，并且体外实验已证实在抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)和树突状细胞(dendritic cell,DC)存在情况下，可诱导T细胞增殖，同时APC对6B11GM摄取明显高于单用6B11［8］。但由于目前缺乏合适的动物模型，使抗独特型疫苗的效果和机制难以得到体内实验的验证。因此，本研究构建6B11ScFv与鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM)，目的在于进行体内外实验，为卵巢癌抗独特型疫苗6B11GM应用于临床打下基础。
材料和方法
1.质粒、细胞系
　　质粒pL／6B11ScFv-hGM-CSF由本中心构建。质粒pET30a(+)购自Novagen公司。质粒pTC-GM.2内含murine GM-CSF cDNA，由美国斯坦福大学Levy教授惠赠。pGEM-T Vector购自Prome-ga公司。鼠GM-CSF依赖株NFS-60细胞购自北京医科大学分子免疫学室。宿主菌E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司。
2.抗原、抗体和细胞因子
　　卵巢浆液性乳头状癌抗原OC166-9由本中心制备。HRP-COC166-9抗体、6B11单克隆抗体均为本室制备。大鼠抗小鼠GM-CSF单抗及重组murine GM-CSF购自美国R and D System。HRP-羊抗大鼠IgG购自Santa Cluz公司。
3.试剂
　　Tag酶、T4DNA连接酶及各种DNA限制性内切酶均购自美国Promega公司。MTT等生化试剂购自北京天象人公司和北京化学试剂公司。
4.鼠GM-CSF的PCR克隆
　　鼠GM-CSF位于pTC-GM.2质粒中，由于缺乏合适的酶切位点，依据融合蛋白6B11mGM的构建策略(1～3)。利用PCR克隆技术，在mGM-CSF上、下游引物中分别引入匹配的酶(SpeI、EcoRI)切点。
　　上游引物：5′-TATACTAGTGCACCCACCC-GCTCACCCAT-3′；下游引物：5′-GGGGAATTC-TCATTTTTGGACTGGTTT-3′。为避免PCR可能产生的突变，将mGM-CSF的PCR产物，克隆入测序载体pGEM-T Vector，构建成pGEM-T／mGM-CSF。经Sanger双脱氧末端终止法测序，证实所克隆到的mGM-CSF与文献发表序列及Genebank登录序列完全一致［9］(1)。引物合成、测序工作均由赛百盛生物工程公司完成。
5.6B11mGM融合蛋白表达质粒的构建
　　为获得融合蛋白的高表达，我们选择了原核高表达质粒载体pET30a(+)。首先将6B11ScFv-hGM-CSF以合适的酶切位点自pL／6B11ScFv-hGM-CSF中完整切下，克隆到pET30a(+)之中，构建成pET30／6B11ScFv-hGM-CSF(2)。之后将1.4中成功克隆到的mGM-CSF，自pGEM-T／mGM-CSF中切下，置换pET30／6B11ScFv-hGM-CSF中的hGM-CSF，从而构建成功6B11GM融合蛋白的高表达载体pET30／6B11ScFv-mGM-CSF(3)。连接产物转化DH5α受体菌，内切酶酶切鉴定阳性克隆。将筛选出的pET30／6B11ScFv-mGM-SCF阳性克隆，转化BL21(DE3)受体菌，进行诱导表达。
6.6B11mGM融合蛋白的表达及包涵体处理
　　将含有pET30／6B11ScFv-mGM-SCF的BL21(DE3)受体菌经37℃培养，以0.4mmol*L-1IPTG诱导表达4h，收获菌体。超声破碎细菌，释放包涵体。10 000r*min-1离心20min，弃上清。将沉淀物用3mol*L-1尿素，含0.2g*L-1TritonX-100反复洗涤处理，得到纯化的包涵体，称重。

1　mGM-CSF的PCR克隆
Fig.The cloning of mGM-CSF by PCR

2　pET30／6B11ScFv-hGM-SCF
构建策略示意
Fig.2 The construction strategy of pET30／
6B11ScFv-hGM-SCF

3　pET30／6B11ScFv-mGM-CSF
构建策略示意
Fig.3 The construction strategy of pET30／
6B11ScFv-mGM-CSF

7.包涵体的变性及复性
　　包涵体用8mol*L-1尿素，含10mmol*L-1二硫苏糖醇(DTT)溶解变性，包涵体溶解变性后，10 000r*min-1离心20min。上清直接用复性液：50mmol*L-1Tris*HCl，1mmol*L-1EDTA,1mmol氧化型谷胱苷肽(GSSG)，5mmol*L-1还原型谷胱苷肽(GSH)稀释，使蛋白最终浓度不超过200mg*L-1，10℃复性48h后，PEG20 000浓缩后，离心。测上清总蛋白量，计算复性率。
8.融合蛋白的活性测定
　　直接法ELISA检测抗体活性：复性蛋白作倍比稀释，包被96孔板，每孔100μl，4℃过夜，PBS-T洗3次，加HRP-COC166-9每孔100μl，37℃1h，PBS-T洗3次，OPD显色，测490nm处吸光度(A)值。
　　间接ELISA测融合蛋白的mGM-CSF活性：复性蛋白作倍比稀释包被ELISA板，以重组的mGM-CSF为阳性对照。加大鼠抗小鼠GM-CSF单抗，37℃1h，加HRP-羊抗大鼠IgG,OPD显色，测490nm处吸光度值。
　　融合蛋白细胞因子增殖活性测定：取生长状态良好的NFS-60细胞，以不含mGM-CSF的1 640培养液洗3遍。在96孔培养板内将待测融合蛋白和重组mGM-CSF作倍比稀释，每孔加入2×104～1×105个细胞，总体积100μl。37℃孵育48h，加入MTT(5g*L-1)10μl，37℃孵育4h，加入10g*L-1SDS-0.01mol*L-1HCl 100μl，37℃过夜，测A570。
结　果
1.6B11mGM融合蛋白表达载体的构建
　　以pTC-GM.2为模板，进行mGM-CSF基因的PCR扩增，产物经10g*L-1琼脂糖凝胶电泳获约400bp的条带，与mGM-CSF cDNA一致，且测序结果与原始序列一致［9］。重组载体pET30／6B11ScFv-mGM-SCF分别以NcoI／EcoRI，NcoI／BamHI及SpeI／EcoRI酶切，各见约1 200bp，780bp,400bp的条带，与预期片段大小一致，表明克隆成功(4)。
2.重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达
　　重组质粒pET30-6B11mGM转化大肠杆菌BL21(DE3)，经0.4mmol*L-1 IPTG诱导4h后，将全菌进行超声裂解，分别将全菌、上清及沉淀进行10%SDS-PAGE电泳，在相对分子质量约为4.8×104处可见1新增条带，并且以包涵体形式表达(5)。经电泳扫描，证实融合蛋白的表达量占菌体蛋白的30%。
3.包涵体的处理及复性
　　包涵体经反复洗涤后，采用8mol*L-1尿素裂解后，1mmol*L-1GSSG和5mmol*L-1GSH，10℃复性48h后，复性率为36%，复性蛋白的纯度为90%以上。

4　重组体分别以NcoI／EcoRI,NcoI／BamHI及SpeI／EcoRI
双酶切后10g*L-1琼脂糖凝胶电泳分析结果
Fig.4 10g*L-1agarose gel eletrophoresis of coloned
phagemied digested with NcoI／EcoRI, NcoI／BamHI
及SpeI／EcoRI,respectively

5　SDS-PAGE鉴定6B11mGM融合蛋白的表达和纯度
1.分子量标准；2.阴性对照；3.诱导后；
4.超声破碎后上清；5.包涵体；6.复性后蛋白
Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression and
purity of 6B11mGM fusion proteins

6　ELISA测定融合蛋白抗体活性
Fig.6　Antibody activity assay of fusion protein by ELISA

7　ELISA测定融合蛋白mGM-CSF活性
Fig.7　mGM-CSF activity assay of fusion protein by ELISA

4.活性检测
　　复性后的表达蛋白浓缩透析后进行直接法ELISA、间接法ELISA和细胞增殖法分别测定两种蛋白活性。
　　直接法ELISA检测，融合蛋白能与6B11的初始抗体COC166-9单抗特异结合(6)。
　　间接法ELISA检测，融合蛋白能与大鼠抗小鼠GM-CSF单抗特异结合(7)。
　　复性后的融合蛋白能维持NFS-60细胞的生长，在1∶2(体积比)稀释度时，其刺激细胞增殖的活性相当于12.5μg*L-1浓度时的重组mGM-CSF。
讨　论

　　卵巢癌发生率占女性生殖系统恶性肿瘤的第3位，但死亡率却居首位，5年生存率仅30%～40%，部分患者经手术、化疗等治疗后可获缓解，但亦常在2～3年复发，即使少部分可获长期存活，由于多次手术、化疗，病人生活质量极差。为提高卵巢癌患者生存率，降低复发率，并在某种程度上提高患者生存质量，近年来我们一直试用可模拟卵巢癌抗原的抗独特型抗体(Ab2β)构建基因工程卵巢癌疫苗(抗独特型疫苗)。
　　根据免疫网络学说［10］，抗独特型抗体具有模拟抗原和免疫调节双重作用。许多研究亦证明应用抗独特型肿瘤疫苗，有可能打破机体对肿瘤的免疫抑制状态［11］。国外已有用抗独特型肿瘤疫苗进行临床Ⅰ、Ⅱ期实验，并观察到其能诱导产生保护性免疫反应［12，13］。但抗独特型疫苗在临床广泛应用，还存在3个主要问题：(1)目前的Ab2β大多为鼠源性，难以在临床反复应用；(2)缺乏有效、安全的佐剂。常用的佐剂如铝剂、矿物油等不能提供有效的T细胞刺激信号，而且有一定的副作用；(3)缺乏合适的动物模型来验证抗独特型疫苗的效果。针对以上问题，我们首先构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv，降低了鼠源性。在此基础上，又制备出6B11GM融合蛋白，解决了佐剂问题。为解决缺乏合适的动物模型，本研究构建并表达了卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM)，以便在鼠模型上观察效果。为阐明卵巢癌抗独特型疫苗的抗肿瘤机制及效果奠定了基础。
　　pET系列表达载体是近年来最有效的用来在大肠杆菌克隆，表达外源基因的载体之一。我们利用pET-30a(+)载体，分别将6B11ScFv／mGM-CSF cDNA克隆入该表达载体，构建成pET30-6B11ScFv／mGM-CSF融合蛋白表达载体。该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中，以包涵体形式高效表达，为蛋白的大量制备和纯化提供了有利条件。我们对诱导表达条件进行摸索，以0.4mmol*L-1IPTG诱导4h时，表达量最高。但包涵体只具有抗体分子的1级结构，必须进行分离、溶解及复性。使包涵体蛋白错配的二硫键打开，还原成1级结构的形式下，在谷胱苷肽氧化-还原体系中，抗体分子正确地形成二硫键，折叠成具有抗原结合能力的抗体。经摸索本研究将细菌破碎后释放的包涵体，经3mol*L-1尿素含0.2g*L-1Triton X-100反复洗涤后，以8mol*L-1尿素溶解包涵体蛋白，采用氧化型谷胱苷肽(GSSG)浓度为1mmol*L-1，还原型谷胱苷肽(GSH)浓度为5mmol*L-1，10℃复性48h，复性率较高。另外，蛋白在复性过程中的再聚合是令人棘手的问题，我们采用将包涵体裂解液逐渐稀释于复性液中，保持蛋白浓度在200mg*L-1以下，避免了复性中间产物再聚合。此外，我们还观察到蛋白复性、透析过程，也是蛋白纯化的过程，包涵体经洗涤、裂解、复性、浓缩和透析后，纯度可达90%以上。
　　我们对复性后的6B11mGM融合蛋白进行活性检测，结果表明，表达的融合蛋白6B11mGM能分别与COC166-9单抗和大鼠抗小鼠GM-CSF单抗特异结合，并且融合蛋白能刺激鼠GM-CSF依赖株NFS-60细胞增殖能力，在培养中能维持NFS-60细胞的生长。表达的融合蛋白中的抗体和细胞因子两种蛋白的免疫学活性和生物学活性均得到了很好保留，为进一步研究其在体内的免疫功能提供了基础。
【基金项目】教育部优秀年轻教师基金资助项目
【作者简介】　刘蓓(1964—)，女，天津市人，硕士，副主任医师，现在天津市中心妇产科医院实验室工作，天津　300052
?通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
刘蓓（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
崔恒（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
冯捷（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
叶雪（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
李艺（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
曹善津（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
葛华（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
付天云（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
姚煜（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
钱和年（北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心，北京　100044）
参考文献
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【收稿日期】1999-06-25　【修稿日期】1999-09-10