耳聋基因检测与耳聋一级预防-final.ppt

柴柴 永永 川川苏州大学附属第一医院苏州大学附属第一医院 耳鼻咽喉科耳鼻咽喉科耳耳聋基因基因检测与一与一级预防防亿人年耳聋防治耳聋防治 是重大医学难题是重大医学难题全球听力障碍人数(WHO)N Engl J Med.2007耳耳聋基基础数据来自：第二次（2006年）全国残疾人抽样调查中国耳聋人群庞大中国耳聋人群庞大耳耳聋基基础 先天性听力障碍先天性听力障碍发病率：病率：1-3 全国每年新增耳全国每年新增耳聋患儿：患儿：2-6万万 先天性听力障碍发病率高先天性听力障碍发病率高每每1000010000新生儿中先天性新生儿中先天性出生缺陷的发生率出生缺陷的发生率耳耳聋基基础导致致严重后果：重后果：语言障碍（十言障碍（十聋九九哑）目前无有效治目前无有效治疗方法，主要依方法，主要依赖助听器与人工助听器与人工耳耳蜗植入等植入等辅助手段助手段影响影响终生：家庭社会生：家庭社会负担沉重担沉重p每个听障患儿增加社会成本每个听障患儿增加社会成本约20-50万元万元先天性听力障碍危害性高先天性听力障碍危害性高耳耳聋基基础效果依效果依赖早期早期发现、早期、早期诊治和防控治和防控 助听器助听器验配配 人工耳人工耳蜗植入植入先天性听力障碍高度可干预性先天性听力障碍高度可干预性 言言语康复康复训练耳耳聋基基础先天性耳聋防治思路先天性耳聋防治思路东部地东部地区区中部地区中部地区西部地区西部地区UNHS及干及干预网网络的建立与的建立与实施施聋病基因孕前病基因孕前产前前筛查降低出生率降低出生率高危因素高危因素筛查及干及干预模式的建立与模式的建立与实施施关口前移关口前移重心下移重心下移重心下移重心下移偏远地区偏远地区重心下移重心下移儿童保健网儿童保健网络筛查及干及干预耳耳聋基基础耳聋的病因复杂：遗传性病因占主要部分性病因占主要部分明确的明确的遗传因素因素为耳耳聋的的预防防创造条件造条件耳耳聋基基础非综合征性耳聋基因60个p显性 30个p隐性 50个p线粒体 2个pX-连锁 4个综合征性耳聋基因40个遗传性耳聋具高度遗传异质性遗传性耳聋具高度遗传异质性HereditaryhearinglossHomepage耳耳聋基基础常见耳聋基因少，占遗传因素多常见耳聋基因少，占遗传因素多pJournaloftranslationalmedicine:GJB2mutationspectrumin2063Chinesepatientswithnon-syndromichearingimpairmentpAmerican journal of medical genetics:Molecular etiology of hearing impairmentassociatedwithnon-syndromicenlargedvestibularaqueductinEastChina.pAmericanjournalofhumangenetics:Maternallyinheritedaminoglycoside-inducedand nonsyndromic deafness is associated with the novel C1494T mutation in themitochondrial12SrRNAgeneinalargeChinesefamily.针对常见耳聋基因的一级预防具有高度可行性针对常见耳聋基因的一级预防具有高度可行性常常见耳耳聋基因占基因占遗传性耳性耳聋50%以上，以上，药物性耳物性耳聋40%以上以上pGJB2（40%-50%）pSLC26A4（15%-20%）p线粒体基因粒体基因（40%以上以上药物性耳物性耳聋）常见耳聋基因检测基因检测与婚育指导基因检测与婚育指导产前诊断产前诊断常见耳聋基因筛查常见耳聋基因筛查恋前恋前婚前婚前产前产前常见耳聋基因检测聋病基因筛查在北京、上海等重点城市已得到聋病基因筛查在北京、上海等重点城市已得到初步开展，筛查技术成熟初步开展，筛查技术成熟pGJB2GJB2pSLC26A4SLC26A4p线粒体线粒体DNADNA突变热点突变热点常见耳聋基因筛查常见耳聋基因筛查常见聋病基因筛查使先天性听力障碍的预防成为可能常见聋病基因筛查使先天性听力障碍的预防成为可能常见耳聋基因检测耳聋基因筛查与预防模式耳聋基因筛查与预防模式高危筛查模式高危筛查模式p目标：高危人群（耳聋人群及其亲属等）目标：高危人群（耳聋人群及其亲属等）p筛查手段：全序列测定为主（筛查手段：全序列测定为主（GJB2GJB2、SLC26A4SLC26A4和和MT-RNR1MT-RNR1）p筛查时间：孕前、婚前、恋前筛查时间：孕前、婚前、恋前普遍筛查模式普遍筛查模式p目标：正常听力人群目标：正常听力人群p筛查手段：快速筛查为主，序列测定为辅筛查手段：快速筛查为主，序列测定为辅(GJB2(GJB2、SLC26A4SLC26A4和和MT-RNR1MT-RNR1三大基因的热点突变三大基因的热点突变)p筛查时间：孕前或孕早期筛查时间：孕前或孕早期常见耳聋基因检测耳聋基因高危筛查耳聋基因高危筛查试点及合作单位：上海市长宁区试点及合作单位：上海市长宁区残联会员残联会员常见耳聋基因检测GJB2双等位基因突变（29.5%）SLC26A4双等位基因突变（14.1%）线粒体基因突变（6.0%）原因不明：（50.3%)29.5%14.1%6.0%50.3%常见耳聋基因突变检出比例：常见耳聋基因突变检出比例：49.7%49.7%耳聋基因高危筛查耳聋基因高危筛查N200N200例例常见耳聋基因检测耳聋基因高危筛查耳聋基因高危筛查 效率高，阳性检出率高效率高，阳性检出率高 可全面检测目标基因的全部编码序列可全面检测目标基因的全部编码序列,提高基因诊断与遗传咨询的准确性提高基因诊断与遗传咨询的准确性Advantage 会漏过正常听力人群中由隐性突变携会漏过正常听力人群中由隐性突变携带者之间婚配生育所造成的耳聋带者之间婚配生育所造成的耳聋Disadvantage优缺点分析优缺点分析常见耳聋基因检测耳聋基因普遍筛查耳聋基因普遍筛查育龄或孕早期女育龄或孕早期女性性隐性基因突变携隐性基因突变携带者带者配偶基因芯片筛配偶基因芯片筛查查耳聋基因芯片筛耳聋基因芯片筛查查夫妇双方均为夫妇双方均为同证基因突变同证基因突变携带者携带者线粒体线粒体A1555G突变突变产前基因诊断产前基因诊断遗传咨询遗传咨询药物性耳聋遗传药物性耳聋遗传咨询咨询常见耳聋基因检测有效有效检测样本（本（怀孕早期孕孕早期孕妇）：）：3056例例孕孕妇中携中携带耳耳聋基因突基因突变160例，占例，占总样本的本的5.23%。携携带者自身均听力正常，者自身均听力正常，157例无家族史，例无家族史，3例例MT突突变孕孕妇家族多人家族多人有有药物性物性聋病史。病史。MT突突变7例，例，对母系成母系成员进行行氨基糖苷氨基糖苷类抗生素抗生素药物物预警，以避免警，以避免药物性耳物性耳聋全序列全序列检测非非MT突突变的阳性孕的阳性孕妇配偶配偶124例，例，13家庭具家庭具隐性性遗传性性耳耳聋生育生育风险，5例例进行了行了产前前诊断，断，1例胎儿例胎儿为p.V37I/c.235delC复合复合杂合合，其余，其余为突突变携携带或野生型或野生型。耳聋基因普遍筛查耳聋基因普遍筛查常见耳聋基因检测耳聋基因普遍筛查耳聋基因普遍筛查优缺点分析优缺点分析 覆盖面广，可对隐性耳聋基因突变携带者加以有覆盖面广，可对隐性耳聋基因突变携带者加以有效发现及干预效发现及干预 高通量、自动化筛查方法有助于耳聋基因检测的高通量、自动化筛查方法有助于耳聋基因检测的更大规模推广更大规模推广Advantage只针对热点突变进行筛查，非全序列测定只针对热点突变进行筛查，非全序列测定阳性检测率较低，投入产出比有待进一步卫生经阳性检测率较低，投入产出比有待进一步卫生经济学评估济学评估Disadvantage常见耳聋基因检测 Aa Aa AA父母正常，孩子耳聋 “隐性遗传”耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例？孕早期羊水穿刺产前基因诊断 AA(25%)Aa(50%)aa(25%)产前基因诊断可有效预防隐性遗传性耳聋的再生育风险产前基因诊断可有效预防隐性遗传性耳聋的再生育风险耳聋遗传咨询父母耳聋，孩子个个耳聋 同证婚配：后代100%会耳聋耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例聋人婚前进行耳聋基因检查，可避免同证婚配的出现聋人婚前进行耳聋基因检查，可避免同证婚配的出现 AA AA AA AA AA耳聋遗传咨询AA;bb aa;BB 父母耳聋，孩子正常 Aa;Bb“多基因遗传”?携带不同隐性耳聋基因突变的聋人夫妇可生育携带不同隐性耳聋基因突变的聋人夫妇可生育正常听力的孩子正常听力的孩子耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋遗传咨询？Bb正常人群中耳聋基因突变携带率(Bb)为5%耳聋基因诊断可为遗传性耳聋高危人群提供生育耳聋基因诊断可为遗传性耳聋高危人群提供生育风险评估及预防风险评估及预防BBBbBbBb耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋遗传咨询 C C“线粒体基因母系遗传”?携带线粒体耳聋基因突变的人群通过指导可避免携带线粒体耳聋基因突变的人群通过指导可避免药物性耳聋的发生药物性耳聋的发生耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋遗传咨询耳聋基因遗传咨询与诊断耳聋基因遗传咨询与诊断 了解病因，帮助确了解病因，帮助确诊 预防下一代防下一代聋病的病的发生生 预防防亲属或下一代属或下一代药物性耳物性耳聋的可能的可能耳聋遗传咨询罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测 非常见耳聋基因致病患者的分子病因非常见耳聋基因致病患者的分子病因p 罕见已知耳聋基因致病？罕见已知耳聋基因致病？p 罕见已知耳聋基因众多，如何检测？罕见已知耳聋基因众多，如何检测？罕见耳聋基因检测本研究所检测的79个耳聋基因常见的耳聋致病基因：Sanger测序罕见耳聋基因检测：定向捕获二代测序p可行性分析：OtoSCOPE芯片（54个已知耳聋基因，2010年，UniversityofIowa）p79个已知耳聋基因的二代测序（本研究）2010年二代测序首次应用于已知耳聋基因检测适宜的检测技术罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测罕见耳聋基因检测总样本量：183例经济高效的检测方案检测方案（二步法）p第一步：常见耳聋基因Sanger测序（所有样本）p第二步：79个耳聋基因二代测序（排除常见耳聋基因致病样本）二步法优点：节约二代测序二步法优点：节约二代测序样本数量样本数量罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测罕见耳聋基因检测79个已知耳聋基因病因构成图常见耳聋基因突变：35.5%pGJB2:19.7%pSLC26A4：12.0%pMT-RNR1:3.8%罕罕见见耳耳聋聋基因突基因突变变：15.8%罕见已知耳聋基因病因构成：15.8%罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测罕见耳聋基因检测罕见耳聋基因的异质性强罕见基因突变分布图p致病突变广泛分布于15个基因中Novel mutation 91.8%(45/49)Reportedmutation:8.2%（4/49)p新发突变占绝大多数致病突变是否报道分布图Orphanet Journal of Rare Diseases2013,8:85罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测罕见耳聋基因检测新耳聋基因克隆与发现新耳聋基因克隆与发现 所有已知耳聋基因检测后都为阴性p 新耳聋基因致病？p已知耳聋基因非编码区致病？p已知耳聋基因大片段缺失？pp新耳聋基因克隆遗传性耳聋家系连锁分析遗传性耳聋家系连锁分析遗传标记遗传标记基因型分离基因型分离表型分离表型分离基因型基因型-表型共分离表型共分离耳聋基因的定位克耳聋基因的定位克隆隆新耳聋基因克隆p 外显子捕获外显子捕获/二代测序二代测序 二代测序二代测序耳聋基因定向外显子捕获耳聋基因定向外显子捕获/测序平台测序平台排除已知耳聋基因排除已知耳聋基因增加克隆新耳聋基因的把握增加克隆新耳聋基因的把握新耳聋基因克隆Genome-WideLinkageAnalysisnPerformedin9affectedand9unaffected(35yrs)新耳聋基因克隆候选区域候选区域新耳聋基因克隆Genome-WideLinkageAnalysisn9affectedand8unaffectednIlluminaOmniZhongHuaBeadChip(900,015SNPs)nChr16p13nkgp1005458-kgp2546988(2.1Mb)nMaxiumLOD=3.8nOverlappedwithDFNB86interval新耳聋基因克隆WholeExomeSequencingn3affectedand2unaffected新耳聋基因克隆WholeExomeSequencingnCandidatevariants:non-synonymousvariants(missense,nonsense,splicingsite,indels,etc)withallelefrequencies0.001II-3III-9III-7III-5III-11II-3,III-7,III-9:AffectedIII-5,III-11:Unaffected新耳聋基因克隆WholeExomeSequencingnConfirmedbySangersequencinginallfamilymembers新耳聋基因克隆Genome-WideLinkageAnalysisn9affectedand8unaffectednIlluminaOmniZhongHuaBeadChip(900,015SNPs)nChr16p13nkgp1005458-kgp2546988(2.1Mb,124genes)nMaxiumLOD=3.8nOverlappedwithDFNB86interval新耳聋基因克隆Thep.Ser178LeuVariantofTBC1D24nHighlyconservativenNotseenin1000normalhearingcontrols新耳聋基因克隆Hum Mutat，2014,35(7):814-818 TBC1D24新耳聋基因克隆耳聋基因检测技术：一代测序耳聋基因检测技术：一代测序DNADNADNADNA抽提抽提抽提抽提 PCR PCR PCR PCR扩增扩增扩增扩增 扩增片段测序扩增片段测序扩增片段测序扩增片段测序 突变检测突变检测突变检测突变检测优点：可覆盖目标基因全部编码序列，适合特优点：可覆盖目标基因全部编码序列，适合特定目标诊断定目标诊断总结-检测技术高通量定点突变检测技术高通量定点突变检测技术pp耳聋基因突变芯片检测法耳聋基因突变芯片检测法耳聋基因突变芯片检测法耳聋基因突变芯片检测法pp飞行时间质谱法飞行时间质谱法飞行时间质谱法飞行时间质谱法ppSNAPshot/HRMSNAPshot/HRMSNAPshot/HRMSNAPshot/HRM等等等等优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查总结-检测技术外显子目标外显子目标 捕获结合二代测序捕获结合二代测序优点：覆盖绝大多数（优点：覆盖绝大多数（优点：覆盖绝大多数（优点：覆盖绝大多数（140140140140个）已知耳聋基因编码序列个）已知耳聋基因编码序列个）已知耳聋基因编码序列个）已知耳聋基因编码序列Orphanet J Rare Dis,2013,8(1):85 总结-检测技术耳聋基因研究与临床应用耳聋基因研究与临床应用临床应用临床应用基础研究基础研究总结谢谢！