魔芋粗粉制备低聚糖工艺优化及产物生理活性分析.pdf
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1、张薇,孙楠,张钰瑶,等.魔芋粗粉制备低聚糖工艺优化及产物生理活性分析 J.食品工业科技,2023,44(18):147155.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100174ZHANG Wei,SUN Nan,ZHANG Yuyao,et al.Optimization of Oligosaccharide Preparation Process and Physiological ActivityAnalysis of Konjac Crude Powder J.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18
2、):147155.(in Chinese with Englishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100174 生物工程 魔芋粗粉制备低聚糖工艺优化及产物生理魔芋粗粉制备低聚糖工艺优化及产物生理活性分析活性分析张薇,孙楠,张钰瑶,伍小丫,赵育,张冰倩,张宝善*(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119)摘要:本文利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)水解魔芋粗粉制备低聚糖,通过单因素实验确定魔芋粗粉浓度、菌株接种量、水解温度、水解时间 4 个因素对魔芋粗粉水解率的影响,在此基础上利用响应面优化水解
3、条件。利用粘度计、薄层层析(TLC)分析水解产物特性,以OH、O2和 DPPH清除能力为指标评价魔芋粗粉低聚糖抗氧化活性,以体外发酵试验探究魔芋粗粉低聚糖益生元活性。结果表明,水解最佳工艺参数为魔芋粗粉浓度20 g/L、接菌量 1107 CFU/g、水解温度 43.6、水解时间 10.2 h,此时,魔芋粗粉水解率为 39.06%0.12%,魔芋葡甘低聚糖(Konjac glucomannan oligosacchrrides,KGOS)产率为66.72%。随着水解时间延长,溶液粘度由2430.33 mPas下降到 18.06 mPas。魔芋粗粉浓度 10 mg/mL 时,OH、O2和 DPPH
4、清除率分别为 61.47%、34.60%和 81.43%。KGOS、葡萄糖和魔芋粗粉对植物乳杆菌、短乳杆菌和干酪乳杆菌体外增殖作用 OD600分别为 0.775、1.371、0.236,0.791、1.339、0.224 和 0.916、1.336、0.243。该结果为魔芋粗粉低聚糖开发利用提供了依据。关键词:魔芋葡甘低聚糖,抗氧化活性,益生元,生理活性,薄层层析本文网刊:中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文章编号:10020306(2023)18014709DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100174OptimizationofOligosacch
5、aridePreparationProcessandPhysiologicalActivityAnalysisofKonjacCrudePowderZHANGWei,SUNNan,ZHANGYuyao,WUXiaoya,ZHAOYu,ZHANGBingqian,ZHANGBaoshan*(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xian 710119,China)Abstract:In this paper,konjac powde were hydrolyzed by Baci
6、llus licheniformis to prepare oligosaccharides.The effects ofconcentration of konjac powder,inoculum amount of strain,bacteriolysis temperature and hydrolysis time on hydrolysisrate of konjac powder were determined by single factor tests.The antioxidant activity of konjac powder oligosaccharideswas
7、evaluated with the scavenging ability of OH,O2 and DPPH as indexes.The prebiotic activity of konjac powderoligosaccharides was investigated by in vitro fermentation test.The results showed that the optimal hydrolysis processparameters was as follows:concentration of konjac powder 20 g/L,inoculation
8、capacity 1107 CFU/g,hydrolysistemperature 43.6,hydrolysis time 10.2 h.Under the optimal conditions,the hydrolysis rate of konjac powder was39.06%0.12%,and the yield of KGOS was 66.72%.With the prolongation of hydrolysis time,the viscosity of solution decreased from2430.33 mPas to 18.06 mPas.When the
9、 concentration of konjac powder was 10 mg/mL,the clearance rates of OH,O2and DPPH were 61.47%,34.60%and 81.43%,respectively.The OD600 of KGOS,glucose and konjac powder on theproliferation of Lactobacillus plantarum,Lactobacillus brevity and Lactobacillus casei in vitro were 0.775,1.371,0.236,0.791,1
10、.339,0.224 and 0.916,1.336,0.243,respectively.The results provide a theoretical basis for the further processingand utilization of oligosaccharides in konjac powder.收稿日期:20221019 基金项目:益生菌发酵果品功能饮料关键技术研究与示范(2023-YBNY-195);陕西特色果品干制及精深加工关键技术研究与示范(2023-ZDLNY-42)。作者简介:张薇(1999),女,硕士研究生,研究方向:食品微生物,E-mail:。*
11、通信作者:张宝善(1968),男,博士,教授,研究方向:食品发酵,食品微生物,E-mial:。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 Key words:KGM oligosacchrrides;antioxidant activity;prebiotics;physiological activity;thin layer chromatography(TLC)魔芋是天南星科(Araceae)魔芋属(Amorpho-phallus)多年生草本植物,具有低热
12、量、低脂肪、高膳食纤维的营养特性。中国有着丰富的魔芋资源,现代魔芋深加工主要生产魔芋粗粉、魔芋葡甘聚糖、魔芋葡甘低聚糖三类产品。魔芋经过干制、初步粉碎制得的粉末称为魔芋粗粉1,每 100 kg 鲜魔芋一般可制得粗粉 2030 kg。魔芋粗粉主要含有 50%60%的魔芋葡甘露聚糖(Konjac glucomannan,KGM)、20%30%淀粉、5%10%粗蛋白、2%5%粗纤维等营养物质。KGM 是一种高分子可溶性膳食纤维,羟基含量丰富,具有很强的溶胀性和凝胶性能,通常难以被胃肠道消化和利用,这导致其生物活性功能大大降低23。研究发现,将 KGM 制成低分子魔芋葡甘 低 聚 糖(Konjac g
13、lucomannan oligosaccharides,KGOS)4,其溶解性、流动性和口感大大改善,更易被机体吸收利用,还具有抑制淀粉老化、清除自由基、促进肠道益生菌增殖等多重作用56。KGM 属于半纤维素,而纤维素是结构物质不能作为能源物质,因此在 KGM 被分解为寡糖前,无法直接作为碳源为微生物的生长提供营养。当前 KGM主要通过物理和化学等方法改性,均存在产物分子质量范围难掌控、副产物多和寡糖得率低等问题7。研究发现部分特异性微生物生长及代谢产物分解 KGM,也同时分解其中的淀粉及蛋白质,且作用条件温和、寡糖产率高、成本低廉,能有效提高魔芋粗粉利用率8。因此,采用特异性菌株分解 KGM
14、是高效、快速制备葡甘寡糖的有效途径之一。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种在土壤中广泛存在的革兰氏阳性嗜热腐生菌9。该菌可促使机体产生抗菌活性物质,调整体内菌群失调,同时杀灭致病菌,达到治疗目的。长期以来,该菌在发酵工业方面的应用广泛,常被用于生产碱性蛋白酶、淀粉酶、表面活性剂的生产原料,并且对人体和环境无毒害作用10。据 Xan 等11研究显示,芽孢杆菌代谢产物含有葡聚糖酶,因此具有水解 KGM 的能力,利用水解物进行生长代谢,因此魔芋粗粉可直接作为地衣芽孢杆菌培养基的营养来源。本论文利用地衣芽孢杆菌水解魔芋粗粉,研究其水解特性和主要产物及其功能性,旨在将魔芋
15、粗粉通过生物水解作用,制成完全可溶的液态功能食品材料,以期提升魔芋的加工利用率和食用价值。1材料与方法 1.1材料与仪器鲜魔芋使用产自陕西省岚皋县花魔芋;地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,CGMCC 1.8791)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,CGMCC 1.12974)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis,CGMCC 1.2028)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,CGMCC 1.580)均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心;胰蛋白胨北京拜尔迪生物技术有限公司;酵母提取物北京奥博星生物技术有限责任公
16、司;氯化钠、正丁醇、冰乙酸、氢氧化钠、无水乙醇天津市天力化学试剂有限公司;3,5-二硝基水杨酸天津市大茂化学试剂厂;苯胺上海麦克林生化科技有限公司;-甘露聚糖酶(10000 U/g)上海源叶生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。Autoflex Speed 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、AVANCE NEO600M 核磁共振波(600 Hz)德国布鲁克公司;Multiskan Go 型酶标仪美国Thermo Electron 公司;RVDV-+Pro 型粘度计美国博利飞公司;LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;SHP-200B 型摇床上海世平实验设备有限公司。1
17、.2实验方法 1.2.1 魔芋粉制备魔芋粗粉制备方法为1213:将魔芋洗净、去皮、切片、热风烘干、粉碎,过 80 目筛(取筛下物),获得魔芋粗粉(不经漂白处理),置于干燥器中常温保存。1.2.2 魔芋粗粉基础指标测定水分:参照 GB5009.3-2016 方法14;KGM:参照 GB/T 18104-2000方法15;粗纤维:参照 GB/T 5009.10-2003 方法16;蛋白质:参照 GB 5009.5-2016 方法17;粗脂肪:参照GB 5009.6-2016 方法18;灰分:参照 GB 5009.4-2016方法19;pH:参照 GB 5009.237-2016 方法20;淀粉:参
18、照 GB 5009.4-2016 方法17。1.2.3 地衣芽孢杆菌活化将地衣芽孢杆菌接种于LB 固态培养基,培养箱 40 恒温培养至有明显褶皱及不规则边缘的白色菌落,获得活化菌株。1.2.4 菌悬液的制备将活化的地衣芽孢杆菌接种到含有 50 mL LB 液体培养基,在 40、180 r/min的条件培养 22 h,将 1 mL 培养物转移到 50 mL LB液体培养基,用于制备种子液。将种子液 4000 r/min离心 10 min,弃上清液,0.9%无菌生理盐水(w/v)洗涤两次,添加无菌生理盐水制备细菌悬浮液,调整浓度为 108 CFU/g。1.2.5 指标测定 1.2.5.1 还原糖和
19、总糖含量测定采用 3,5-二硝基水杨酸比色法测定反应混合物中的还原糖浓度和总糖浓度,参考 Chen21的方法并略做修改。还原糖的测定:移取 1.0 mL 稀释过的魔芋粗粉水解液或魔芋粗粉溶液于 25 mL 具塞试管中,加入1 mL 蒸馏水,再在每个具塞试管中加入 1.5 mLDNS 显色液,摇匀后置于沸水浴中 5 min,立即冷却,148 食品工业科技2023 年 9 月用蒸馏水定容至刻度,于 540 nm 处测定吸光度。利用测得的标准曲线,计算溶液中还原糖含量,以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,建立回归方程为:y=0.4131x+0.0057,决定系数 R2=0.9982。总糖的
20、测定:移取 1.0 mL 稀释过的魔芋粗粉水解液或魔芋粗粉溶液于 25 mL 具塞试管中,准确加入 3 mol/L 硫酸 0.5 mL,摇匀后在沸水浴中具塞密封水解 1.5 h,取出,冷却。准确加入 6 mol/L 氢氧化钠 0.5 mL,摇匀;再在每个具塞试管中加入 1.5 mLDNS 显色液,摇匀后置于沸水浴中 5 min,立即冷却,用蒸馏水定容至刻度,于 540 nm 处测定吸光度。利用测得的标准曲线,计算溶液中总糖含量。总糖含量(mg/mL)=T式(1)式中:为换算系数,=0.9;T 为待测溶液用DNS 法测定在标准曲线所得的值。1.2.5.2 水解率和低聚糖产率测定通过测定水解前 K
21、GM 溶液中总糖含量与水解前、后溶液中还原糖含量,得到水解率22,即公式(2)。水解率(%)=菌解液中还原糖含量初始还原糖含量初始总糖含量100式(2)通过测定水解前 KGM 溶液中总糖含量与水解后溶液中总糖含量,得到低聚糖产率,即公式(3)。低聚糖产率(%)=初始总糖含量水解后的总糖含量初始总糖含量100式(3)1.2.6 魔芋粗粉水解工艺单因素实验以水解率为评价指标,研究各因素对魔芋粗粉水解的过程的影响,固定底物浓度 20 g/L,接菌量 1107 CFU/g,水解温度 43,水解时间 12 h 进行试验。考察不同因素水平分别设定为底物浓度(10、20、30、40、50 g/L)、接菌量(
22、1105、1106、1107、1108、1109 CFU/g)、水解温度(37、40、43、46、49)和水解时间(0、2、4、6、8、10、12、14 h)对水解率的影响,各组试验均重复 3 次。1.2.7 响 应 曲 面(RSM)试 验 设 计 根 据 Box-Behnken 试验设计原理,以单因素实验结果为基础,选取对魔芋粗粉水解影响较大的接菌量(A)、水解温度(B)和水解时间(C)3 个实验因素,以水解率为响应值进行三因素三水平的 Box-Behnken 响应面试验,优化水解魔芋粗粉获取 KGOS 的水解条件,因素水平编码表见表 1。表 1 响应面试验因素水平设计Table 1 Res
23、ponse surface test factor level design水平因素A接菌量(CFU/g)B水解温度()C水解时间(h)11106408011074310111084612 1.2.8 水解时间对粘度的影响粘度越大表示溶液内分子量越大,因此粘度能直观地表现魔芋粗粉溶液内 KGM 分解效果;在生产加工过程中,常以粘度表示 KGM 含量23。本试验选用粘度作为 KGM 分解效果的一项指标。魔芋粗粉浓度为 20 g/L、接菌量为 1107 CFU/g、水解温度 43,设定水解时间分别为 0、2、4、6、8、10 h,测定水解时间对魔芋粗粉溶液粘度的影响24。1.2.9 水解产物的薄层
24、层析(TLC)在尺寸为 2020 cm 的硅胶玻璃板上对纯化后的 KGM 水解产物进行 TLC 分析,参考张敏25的方法并略做修改。取水解时间分别为 0、2、4、6、8、10 h 低聚糖溶液和经-甘露聚糖酶酶解 4 h 低聚糖溶液作为样品液,用移液枪分别吸取各样品液,在距离玻璃板 2.5 cm,间距 1.5 cm 分别点样,点样直径小于 0.5 cm。使用比例为 4:3:4(v:v:v)的正丁醇:水:冰醋酸溶液作为展开剂。将 1 g 二苯胺、1 g 苯胺和 50 mL 三氯乙酸溶解于 50 mL 丙酮以制备显色剂。样品经展开剂充分展开且晾干,将显色剂均匀喷洒在硅胶玻璃板上,于 105 下加热
25、1520 min,观察斑点并进行拍照记录。以浓度为 10 mg/mL 的甘露糖、葡萄糖、麦芽糖和甘露糖三糖为标准溶液。甘露糖和葡萄糖标准溶液(10 mg/mL)点样量为 1.5 L,麦芽糖和甘露糖三糖标准溶液(10 mg/mL)点样量为 3 L,所有样品在 TLC 硅胶板上的点样量为 25 L。1.2.10 魔芋粗粉水解液低聚糖的生理活性分析 1.2.10.1 OH 自由基清除率测定取最优工艺条件下魔芋粗粉水解液 1 mL,分别加入 1 mL 8 mmol/LFeSO4溶液,1 mL 8 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液和 1 mL8 mmol/L H2O2溶液,摇匀于37 放置40 min,5
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