临床预后研究的设计与分析..ppt
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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,临床预后研究的设计与分析,燕 虹,武汉大学公共卫生学院,2015,年,12,月,1,.,案例,1,2,3,资料收集方法:,在心力衰竭患者入院时收集患者一般资料、生活质量、服药依从性、生活行为方式、抑郁等资料;在心力衰竭患者出院后每个月进行电话随访,记录心力衰竭患者出院后一年内每个月的再住院或死亡原因及日期。,研究中对心力衰竭患者再住院及死亡界定如下:再住院是指因心源性相关事件(如心力衰竭、心绞痛、心肌梗死、心源性导致的栓塞、各种心律失常等)导致。死亡是指因心源性事件(包括心力衰竭加重、猝死等)导致的死亡。,4,统计学分析:,以随访期一年内发生心源性再住院或死亡定义为终点事件,随访期内未发生终点事件定义为删失,以性别、年龄、,NYHA,心功能分级、生活行为方式、服药依从状况、抑郁状况等为自变量,以发生心源性再住院或死亡为终点事件,结合生存时间做,Cox,回归分析,。,5,6,结论:,心力衰竭患者,1,年内的累积再住院或死亡率为,34.3%,。性别、手术治疗状况、血钠浓度、血红蛋白浓度和,NTpro-BNP,水平仍是影响心力衰竭患者,1,年内生存的主要因素。,7,案例,2,8,1994,年,6,月,-2002,年,1,月,我科室共收治的,941,例胃癌患者,其中,698,例行根治性切除手术,除去术后一个月内因手术合并症或并发症死亡的,27,例和失访的,68,例,可作分析者,603,例。其中男性,374,例,女性,229,例,平均年龄,63.2,岁,(2486,岁,),。本组,603,例胃癌患者中,早期胃癌,83,例,进展期胃癌,520,例。,9,随访方法,生存时间以手术日起至末次随访时间为准,通过书信、电话和门诊随访,失访,68,例,随访率,89.9%(603/671),随访时间最长,12.5,年,最短,5,年,平均,7.9,年。,统计方法,用,Kaplan-Meier,法计算患者的生存率,Log-rank,检验进行单因素分析,应用,Cox,模型进行预后的多因素分析,统计分析采用,SAS6.12,软件,。,10,11,结论,:,影响胃癌预后的因素较多,以肿瘤的,TNM,分期与预后的关系最密切,其中淋巴结转移度对预后的影响比肿瘤浸润深度更大。,12,以上两个案例研究设计有什么特点?,13,纵向描述性研究,对预后进行估计并分析影响预后的因素,生存资料:,生存资料的获得需长期追踪随访观察,如观察病人术后的生存情况,需随访观察几年、十几年乃至几十年;有,截尾值,是生存资料的特点。,预后概率预测:生存分析,预后因素分析:,Cox,比例风险模型,14,案例,3,15,16,17,18,案例,4,预后研究,19,研究对象,以1996年1月-2002年4月因AMI在北京中医药大学附属东直门医院、东方医院心内科住院并度过急性期(28天)的资料完整的所有患者为研究对象,共162例。,资料收集与随访:,查阅所有入选患者发生AMI后在我院住院的历次病历,收集其首次发生AMI时的各种预后因素,并按照病历记录的通讯方法进行电话随访或家访,收集预后指标资料。随访工作在2002年6-8月完成,随访截止至2002年8月31日。,20,资料的整理与分析,根据历史资料进行暴露组和非暴露组,的,划分,:,按照急性期期间是否接受辩证论治中药汤剂治疗分为中药治疗组(暴露组)和对照组。,采用生存分析-Cox回归分析-向前逐步回归法。对影响因素和预后指标进行量化。,21,结论:,在AMI早期使用辩证论治中药汤剂,能降低患者的远期死亡风险,是AMI远期预后的保护因素。,22,前瞻性队列研究、回顾性队列研究,病例对照研究?临床试验?,预后因素研究,生存资料,生存分析、,Cox,比例风险模型,23,概 述,1,临床预后的相关概念、指标,2,临床预后研究设计、分析,3,内容,24,一、概 述,医生需要关心的问题,疾病的进程?,什么样的结局?,结局 何时发生?,发生的概率,?,影响因素,危险因素,保护因素,针对疾病的治疗,25,一、概 述,预后,:,是指在疾病发生之后,对该病未来的发展过程和不同结局做出的事先估计,。,疾病,预后,存活,死亡,治愈,残疾,缓解,慢性化,并发症,恶化,26,预后研究的目的与意义在于,(,1,)了解或者明确各种疾病的发生、发展的规律性以及预测各种不同结局发生的可能性,(,2,)研究影响疾病预后的各种因素,(,3,)用于正确评价治疗措施的效果,一、概 述,预后因素研究,27,预后因素:,指影响疾病结局的因素;强调当患者具有这些因素时,其病程发展过程中出现某种结局的概率就可能发生改变。,一、概 述,疾病本身特征,患者的机体状况,医疗条件,患者及医护人员的依从性,早期诊断、早期治疗,患者、家庭、社会因素,危险因素,?,28,一、概 述,预后因素与危险因素的区别,(,1,)危险因素,指能增加患某病危险的条件。即指健康人群中可使患病危险性增加的条件。,(,2,)二者区别,危险因素:健康 患病,预后因素:患病 结局,29,疾病自然史(,natural history,),指在没有医学干预情况下,疾病自然发生、发展直至最终结局的过程。,四个时期,痊愈,生物学发展期 临床前期 临床期 结局发生期 病残,死亡,临床病程,(,clinical course,):,是指疾病的临床期,即首次出现症状和体征到最后结局所经历的全过程。,二、临床预后的相关概念、指标,30,二、临床预后的相关概念、指标,1,、,疾病致死情况的指标,病死率(,case-fatality rate,):,指某病患者中因该病而死亡者所占的百分比。病死率作为预后指标常用于病程短易引起死亡的疾病,如心血管疾病、急性传染病、急性中毒和生存期很短的癌症,也用于疾病预后的远期效应。,31,二、临床预后的相关概念、指标,2,、,疾病恢复情况的指标,1,),反应率(,response rate,):,指经,“,干预,”,后出现某些改善的证据的病例数在全体受干预的病例总数中所占的百分比。,32,二、临床预后的相关概念、指标,2,),治愈率(,cure rate,):,指经过治疗后某疾病患者中治愈者所占的百分比。治愈率作为预后指标常用于病程比较短不易引起死亡的疾病。,33,二、临床预后的相关概念、指标,3,),缓解率(,remission rate,):,指给予某种治疗后,进入某疾病临床消失期的病例数占总治疗例数的百分比。分为完全缓解率、部分缓解率和自发缓解率。,34,二、临床预后的相关概念、指标,4,),复发率(,recurrence rate,):,指疾病经一定的缓解或者治愈后又重复发作的病例数占总观察病例总数的百分比。,35,二、临床预后的相关概念、指标,5,),致残率(,disability rate,):,指因某疾病引起肢体或器官功能丧失者占总观察病例总数的百分比。,36,二、临床预后的相关概念、指标,6,),副反应发生率(,side-effect rate,):,指给予某种治疗后,发生副反应的病例数占总治疗例数的百分比。,37,二、临床预后的相关概念、指标,3,、,生存状况的指标,1,)生存时间(,survival time,),从,起始事件,到,终点事件,之间的时间跨度,起始事件,重点事件,确诊,HIV,死于,AIDS,确诊,HIV,AIDS,发病,冠心病病人初次发病,冠心病病人再次发病,开始戒烟,接受治疗,重新吸烟,死亡,生存时间常呈偏态分布,38,二、临床预后的相关概念、指标,2,),n,年生存率(,survival rate,):,狭义的生存率,指从疾病临床过程的某一点开始,经过,n,年后存活的病例数占总观察例数的百分比。,式中,p,为生存率,前标,n,为随访时间长度,后标,0,为观察起始点。生存率常用于长病程致死性疾病,如各种癌症,病程较短的癌症一般用,1,年生存率,一般癌症用,5,年生存率。,该指标是预后研究中的重要指标,39,3,)生存率曲线(,survival curve,):,它是以时间,t,为横轴,生存率,P,(,Xt,)为纵轴,可直观地对某一病例任意时刻的生存率做出估计,40,相同生存率的不同预后过程,二、临床预后的相关概念、指标,41,应用预后指标的注意问题,首先要根据疾病的特点选择指标,其次要注意多选择客观、特异、明确、具有公认标准的指标,二、临床预后的相关概念、指标,42,(一),以“了解或者明确各种疾病的发生、发展的规律性以及预测各种不同结局发生的可能性”为目的的预后研究设计、分析,-,预测生存结局的,研究,(二),以“评价治疗措施的效果”和“研究影响疾病预后的各种因素”为目的的预后研究设计、分析,-,预后因素的研究,三、临床预后研究设计、分析,43,三、临床预后研究设计、分析,描述性研究,预后研究中的描述性研究主要是对一定时期内确定的一群病人,纵向,调查观察的各种指标如生存率、病死率、致残率、复发率等和相关临床指标情况及其变化,以此为基础预测生存结局指标。,临床多通过病案资料进行资料收集,包括前瞻性和回顾性,(一)预测生存结局的研究,44,三、临床预后研究设计、分析,id,起始时间,终点时间,性别,年龄,药物使用(起始事件),终点事件,(死于,AIDS,),生存结局,生存时间,4,2004/4/5,2007/2/3,男,37,未使用,死于,AIDS,1,34,29,2003/3/1,2005/7/28,女,35,未使用,死于,AIDS,1,29,38,2002/9/5,2003/9/5,女,32,使用,失访,0,12+,78,2002/5/10,2005/12/7,女,26,未使用,死于,AIDS,1,43,89,2003/11/13,2008/12/31,男,26,未使用,截止日期,0,61+,生存资料收集的内容,开始观察日期,终止日期,结局,45,一般为正偏态分布,常存在截尾数据,效应变量有两个,生存时间资料的特点,生存时间,结局,三、临床预后研究设计、分析,id,生存结局,生存时间,4,1,34,29,1,29,38,0,12+,78,1,43,89,0,61+,注意:结局可以是死亡,也可以是病人治愈后复发,并发症发生等,还可以适用于其他情况,如移植器官的失效等。,46,常用的生存率计算方法有三种:,1,、直接法,:,又称粗生存率法,公式:,应用,:,直接法计算生存率简便,在病例较多时误差不大,但例数少时会出现后一年比前一年生存率高的不合理现象,这种方法,获得资料效率低,且不能预测,,目前该方法已经不再推荐使用。,三、临床预后研究设计、分析,47,例,1 ,对既往有偿献血人员,HIV,感染者自然史分析,中,采用回顾性分析,对来自河南省,12,个村庄的,2364,例有偿献血感染,HIV,的患者进行,5,年的观察,发现死亡病例,709,例,计算既往有偿献血人员,HIV,感染者,5,年粗生存率。,5,年观察的总病例数为,2364,例。,活满,5,年的病例数,=2364-709=1655,例,5,年粗生生存率,三、临床预后研究设计、分析,48,2,、,Kaplan-Meier,分析法,该方法属于非参数法,是用乘积极限法估计生存率,故又,称为乘积极限(,product-limit,)法。,计算生存率时,先将每个个体的生存时间按照由小到大的顺序排列,,排序时若截尾值与非截尾值的观察时间相同,则规定非截尾值小于截尾值,排在截尾值之前。,然后依次计算出各时段的死亡概率、生存概率,进而计算出从观察开始至各时刻的生存率及其标准误。,它以时间,t,为横轴,生存率,P,为纵轴,表示时间与生存率关系的函数曲线,其生存曲线称,Kaplan-Meier,曲线,。,应用,:,该方法适合于小样本和大样本,,,可充分利用截尾数据,,,也不需要对被估计的资料分布做任何假定。随访观察的时间单位越小,估计的精确性越高。,三、临床预后研究设计、分析,49,计算步骤,例,2,:某研究者对肺癌病人嗜酸粒细胞(,EC,)阳性与阴性病人的生存情况进行了分析,,26,名嗜酸粒细胞阴性病人与,35,名嗜酸粒细胞阳性病人的生存时间资料如下,试计算两组病人的生存率。,26,名嗜酸粒细胞阴性患者观察期内全部死亡,其生存月数分别为:,0.3,,,1,,,2,,,2,,,3,,,3,,,4,,,4,,,4,,,4,,,6,,,6,,,6,,,7,,,7,,,7,,,7,,,8,,,8,,,11,,,12,,,12,,,14,,,18,,,21,,,24,。,35,名嗜酸粒细胞阳性患者观察期内,28,人死亡,另外,7,人生存时间为截尾值(带“,+”,者)。生存月数分别为:,4,,,4,,,4,,,5,,,5,,,8,,,9,,,9,,,9,,,10,,,11,,,12,,,12,,,12,,,12+,,,13,,,14,,,16,,,16,,,17,,,19,,,20,,,20,,,22,,,23,+,,,24,,,24,+,,,26,,,26,,,30,+,,,32,,,36,,,36,+,,,36,+,,,36,+,。,50,(,1,)将病人按生存时间由小到大依次排列并编秩,如第(,1,)栏、第(,2,)栏。生存时间相同时,截尾值排在非截尾值之后,如两个病人生存时间都为,24,个月,,24,排在前,,24,+,排在后;,4,名病人生存时间都为,36,个月,则,36,排在前,,3,个,36,+,排在,36,之后。,(,2,)计数各时段开始观察时的病例数,如第(,3,)栏。第(,3,)栏可由下至上累计计数。如最后一行中生存时间为,36,+,个月的病人有,3,人,他们都活过了,36,个月那一刻,在此之后截尾,因此最后一行,36,个月的期初观察人数为,3,;倒数第二行中也有,1,人活过,36,个月,因此期初观察人数为,4,;生存时间满,32,个月的病人除倒数第三行的,1,个病人外,还有前述,4,人,期初观察人数为,5,;,。嗜酸粒细胞阳性的所有,35,人都活满,4,个月,所以第一行期初观察人数为,35,。,(,3,)写出各时段的死亡例数,如第(,4,)栏。,(,4,)按下式计算各时段的死亡概率,q,,见第(,5,)栏。,q,=,第,1,行中,q,=3/35,。,51,(,5,)计算各时段的生存概率,见第(,6,)栏,此栏的值为,1-,第(,5,)栏。例如第,1,行中,生存概率为,p,=32/35,,余类推。,(,6,)计算病人从观察开始活过各时点,t,的生存率,p,(,Tt,),即,S,(,t,)。根据概率的乘法原理,从观察开始至某时点的生存率为此前各时段的生存概率的连乘积,如第,2,行,T5,个月的生存率为前,2,行生存率概率的连乘积,p,(,T5,),=,各行生存率见第(,7,)栏。,(,7,)计算各生存率的标准误,其说明抽样误差的大小,结果见第(,8,)栏。计算公式为,52,53,54,生存率曲线,以生存时间为横轴,生存率为纵轴,将嗜酸粒细胞阳性和阴性肺癌病人的生存率绘制成曲线,可形象直观地比较两组病人的生存率。由图可见,两组病人生存率呈阶梯式下降,嗜酸粒细胞阴性肺癌病人生存率曲线高于阳性组。,55,急性白血病,A,疗法缓解时间的,21,例随访资料,记录如下,其中有,“+”,为截尾数据,括号内为重复死亡数:,6(3)6,+,7 7,+,10 10,+,(2)13 16 16,+,(3)22 23 23,+,(5),。,56,3,、寿命表法,寿命表法:,也称间接法,是利用概率论的乘法定律估计各个观察组在任一特定随访时期患者的生存率。,应用:,寿命表法适用于大样本或者无法准确得知研究结果出现时间的资料。可充分利用各种数据,例如在随访期间内的失访者,观察年限不到的病例与死于其他原因者(不是死于所研究的疾病)。,三、临床预后研究设计、分析,57,例,3,:,某大学附属医院,401,例胃癌根治手术寿命表生存分析。按年代分成两组,一组为,1961-1969,年)共计,95,例,另一组为,1973-1982,年共计,252,例。,三、临床预后研究设计、分析,58,表,1 95,例胃癌根治手术后生存率寿命表计算(,1961,1969,年),(,5,),=,(,4,),1/2,(,2,),+,(,3,)(,7,),=,(,6,),/,(,5,),=1,(,7,)(,10,),=,(,8,),(,5,),(,11,),=,(,7,),/,(,10,)(,13,),=,(,9,),(,1 2,)(,10,),(,13,)各年生存率标准误的计算过程,三、临床预后研究设计、分析,59,表,2 252,例胃癌根治手术后生存率寿命表计算(,1973,1982,年),三、临床预后研究设计、分析,60,(,1,)栏:为手术后年数(,X-,):,0,组是患者术后未能活满一整年者的人数;,1,组是患者术后已活满一年以上者,但尚未活满二年时即死去者的数,余下依此类推。,(,2,)(,3,)栏:期内终检人数与期内死于其他疾患者数(,1,Wx,与,1,Dx,),这些病例都按随访半年统计。,(,4,)栏:期初观察人数(,Lx,),如表,1,期初观察病例为,95,人,即各年代术后开始观察的总病例数,从,1961-1969,共,95,人;,1,组期初观察病例数为术后活满一整年开始的病例数为,82,人,其余类推。,三、临床预后研究设计、分析,61,(,5,)栏:校正人数(,1,Nx,):即期初人数减去终检人数的一半作校正。,1,Nx=Lx-1/2(,1,Wx+,1,Dx),。如,4,组校正人数,1,N,4,=39-1/2(8+0)=35,。,(,6,)栏:期内死于胃癌人数(,1,Dx,),直接填入。,(,7,)栏:死亡概率,(,1,Qx)=,期内死于胃癌人数,(,1,Dx)/,同期校正人数,(,1,Nx),,即(,7,)栏,=,(,6,),/,(,5,)。如,0,组死亡概率(,1,Q,0,),=13/95=0.1368,,余类推。,三、临床预后研究设计、分析,62,(,8,)栏:生存概率(,1,Px,),=1-,死亡概率(,1,Qx,),即(,8,),=1-,(,7,)。如,0,组生存概率,1,P,0,=1-0.1368=0.8632,,其余类推。,(,9,)栏:各年限的生存率(,nP,0,):根据乘法定律,将各年生存概率相乘即可得出各年限生存率。如,1,年生存率为,1,P,0,=0.08632,,,2,年生存率为,2,P,0,=,1,P,0,1,P,1,=0.86320.8049=0.6948,,,3,年生存率为,3,P,0,=,1,P,0,1,P,1,1,P,2,=,2,P,0,1,P,2,=0.69480.7405=0.5145,,其余依此类推。,三、临床预后研究设计、分析,63,(,10,),-,(,13,)栏:为各年限生存率的标准误(,SnP,0,)计算。按公式可计算出,5,年生存率的标准误,=0.5233,。其余类推。,5,年生存率,95%,可信限为:,5,P,0,1.96S,5,P,0,=46.33%1.965.23%=36.08-56.58%,三、临床预后研究设计、分析,64,生存率曲线:,以横轴为术后年数,纵轴为生存率(,%,)作图,即可得出生存率曲线。,三、临床预后研究设计、分析,图,3,胃癌根治手术后生存,曲线,65,(二)预后因素的研究,研究方法和步骤同疾病的危险因素研究。,描述性研究(回顾临床资料)提供线索分析性研究(病例对照研究和队列研究)和,/,或干预试验检验假设,1,、,病例对照研究,根据疾病的不同结局分为,“,病例组,”,和,“,对照组,”,,如将死亡、恶化、有并发症、复发的病人作为,“,病例组,”,,而将无此类表现的同类患者作为对照组,进行回顾性分析,追溯产生该结局的有关影响因素。其分析方法同一般的病例对照研究,。,三、临床预后研究设计、分析,66,三、临床预后研究设计、分析,例,4,菌阳结核病患者近期预后影响因素的病例对照研究中采用整群抽样研究方法抽取接受短程督导化疗的菌阳患者,237,例,初治病例第,2,月、,5,月、,8,月末,复治病例第,2,月、,5,月、,8,月末进行痰检,两者在治疗的第,5,个月和第,8,个月末连续阴性者定义为,对照组,,在治疗过程中痰检持续阳性者,或中途转阴而在治疗结束又转阳者,或者结核死亡病例定义为,病例组,。然后调查了解患者的一般情况、既往病史、症状和体征、用药方案及患者的生活特征等,5,个方面的,45,个有关因素。进而通过,经典的病例对照研究分析方法,获得预后因素主要包括不规则治疗间断时间、咯血和吸烟指数等因素,67,三、临床预后研究设计、分析,(二)预后因素的研究,2,、队列研究,队列研究是将符合研究标准的某种疾病病例,按照接受的干预措施(因素)分为,“,暴露组,”,和,“,非暴露组,”,,对此队列随访一段时间,比较两组预后的差异。,队列研究是预后研究,最常用也是最有效的研究方法,由研究的起点和收集资料的时间序列,可将队列研究分为,回顾,性队列研究、前瞻性队列研究和双向性队列研究,而其中尤以前瞻性队列研究,效果,为最佳。,临床中最易获取的是从病例资料中获得的回顾性队列研究资料,68,三、临床预后研究设计、分析,(二)预后因素的研究,2,、队列研究,传统队列研究分析方法仅利用了效应变量的结局指标,而忽略了,生存时间变量,,因此传统的队列研究分析方法是不适合的,一般为正偏态分布,常存在截尾数据,效应变量有两个,生存时间资料的特点,生存时间,结局,69,Log-rank,检验(时序检验),应用:,可用来比较两个或多个生存率,。,基本思想,:,检验分析实际死亡数与理论死亡数之间的差别意义大小。,步骤:,用,例,2,比较嗜酸粒细胞阳性与阴性肺癌病人的病死率,(二)预后因素的研究,三、临床预后研究设计、分析,单因素分析,70,计算过程,(,1,)将各生存时间数据按照由小到大的顺序排列编秩(各样本统一编秩),如表中第(,1,)和(,2,)栏,截尾值与非截尾值生存时间相同时,非截尾值排在前面。,(,2,)列出各时段内的死亡病例数(各样本合计),如第(,3,)栏。,(,3,)计数各时段的初期观察人数,如第(,4,)、(,5,)栏。一般由最后一行向上累计计数,并将各样本期初观察人数合并得到合并期初观察人数,如第(,4,)、(,5,)栏合并得第(,6,)栏。,(,4,)由各时段死亡病例数与合并期初病例数计算各时段的死亡概率,见第(,7,)栏,即(,7,),=,(,3,),/,(,6,)。,(,5,)根据各时段的死亡概率计算各样本的期望死亡数,如第(,8,)栏和第(,9,)栏,第(,8,)栏,=,(,4,),(,7,),第(,9,)栏,=,(,5,),(,7,)。,71,(,6,)分别累计各样本不同时段内的期望死亡数,得,T,值,如本例嗜酸粒细胞阴性组,T,1,=12.714,,嗜酸粒细胞阳性组,T,2,=41.286,。已知嗜酸粒细胞阴性患者实际死亡例数,A,1,=26,,嗜酸粒细胞阳性患者实际死亡例数,A,2,=28,,,X,2,=,自由度为,1,,查,2,界值得,P40=1,,,40=0,文化程度文盲及小学,X3,文盲及小学,=1,,初中,=2,,高中,=3,感染途径,*,X4,输血,=1,,静脉吸毒,=2,,性行为,=3,,不祥,=4,口腔、食道真菌感染,X5,有,=1,,无,=0,肺部真菌感染,X6,有,=1,,无,=0,肺结核,X7,有,=1,,无,=0,X8,有,=1,,无,=0,相关性脑病,X9,有,=1,,无,=0,贫血,X10,有,=1,,无,=0,病人存活时间(月),t,实际时间,病人结局,Y,死亡,=1,,截尾,=0,表,4,艾滋病患者预后影响因素赋值表,*Cox,分析时进行哑变量处理,以输血组为参照,艾滋病患者预后影响因素赋值表,三、临床预后研究设计、分析,81,将原始数据录入计算机软件,首先采用,log-rank,检验进行每个备选自变量的单因素分析,结果如下表,.,艾滋病患者的不同影响因素与预后关系,三、临床预后研究设计、分析,82,三、临床预后研究设计、分析,将有统计学意义的因素纳,Cox,模型中,结果如下表所示,.,多因素结果显示文化程度、肺部真菌感染、卡氏肺孢子虫肺炎(,PCP,)、,HIV,相关性脑病是,AIDS,患者生存率的影响因素。文化程度较低、肺部有真菌感染、患有卡氏肺孢子虫肺炎和有,HIV,相关脑病的艾滋病患者死亡风险更高。,艾滋病患者预后逐步,Cox,回归模型分析结果,83,Thank 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