HPLC法测定不同品种鸡蛋中的胆固醇含量.pdf

2 0 0 6 年第 8 期第 8 期(总第 7 3 期)农产品加工学刊N o.82 0 0 6 年 8 月A c a d e m i c P e r i o d i c a l o f F a r mP r o d u c t s P r o c e s s i n gA u g.文章编号：1 6 7 1-9 6 4 6(2 0 0 6)0 8-0 0 7 1-0 4收稿日期：2 0 0 6-0 8-0 1作者简介：杨琴（1 9 8 3-），女，在读本科生，研究方向：食品科学与工程。*为通讯作者：戴瑞彤（1 9 6 6-），女，副教授，博士，研究方向：畜产品加工。E-m a i l：d a i r u i t o n g 2 6 3.n e t。0 引言鸡蛋是我们日常膳食中多种营养素的重要来源，是居民日常生活中从饮食补充胆固醇、V A和 V E的主要来源。胆固醇是生物膜的重要成分，又是合成胆汁酸、类固醇激素及 V D等生理活性物质的原料。近年来的研究还发现，天然胆固醇有抗癌功能。同时，肾上腺皮质激素、雄激素及雌激素等体内许多重要的激素，也均以胆固醇为原料在相应的内分泌细胞中合成。另外，胆固醇也是人体不可缺少的营养成分。然而胆固醇在人体内的新陈代谢主要靠肝脏来实现，营养学家认为，当胆固醇和饱和脂肪酸结合成低密度脂蛋白、且低密度胆固醇多于身体所需要的时候，它就容易沉积、附着在动脉血管壁上，使血液中胆固醇含量增加，促使血管硬化，造成动脉血管阻塞，诱发心血管病，严重时将造成死亡。因此，低密度脂蛋白胆固醇是酿成血管栓塞的罪魁祸首，它是对人体有害的胆固醇。另外，胆固醇还会在胆道中沉积为胆结石。胆固醇过高并非罕见，综合全球各地的统计结果显 示，大 约 有 1 5%2 5%的 人，胆 固 醇 浓 度 在2 4 0m g/d l 之上，使他们患冠心病的概率大大增加，所以胆固醇过高表示身体健康已经亮起了红灯，但可怕的是，就算体内胆固醇过高，大多数人也没有症状。因此，定期检查身体内胆固醇浓度及保持胆固醇在适中的浓度非常重要。目前，胆固醇的定量分析方法主要有比色法、酶法、气相色谱法和高效液相色谱法。比色法是测定胆固醇含量的传统方法，用于鸡蛋胆固醇测定时重现性良好，平均回收率在 1 0 0.9 3%左右 1。但该法操作繁杂，特别是样品的前处理和样品中脂肪的提取比较耗时，即使连续操作也需要 4h以上，而且所需试剂多，造成了比色结果的偏差和计算结果的复杂化，且成本较高，从而限定了该方法的广泛使用；氧化酶法测定胆固醇由于技术含量较高，特异性强，所以难于推广使用 2，主要应用于血清胆固醇的测定；高效液相色谱法测定胆固醇，可以采用一种快速抽提鸡蛋中胆固醇的技术 3，配制一系列不同浓度的胆固醇标样，分别进样测得标准曲线，根据此标准曲线，用外标法可以测得鸡蛋样品中的胆固醇含量。这是一种准确度、精密度较好，自动化程度更高的测定方法 1；本实验采用 H P L C法测定市场上常见鸡蛋品种中的胆固杨琴，*戴瑞彤（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京1 0 0 0 8 3）H P L C法测定不同品种鸡蛋中的胆固醇含量摘要：采用高效液相色谱法测定鸡蛋中的胆固醇含量，以 C1 8（5m，2 5 0m m 4.6m m）为固定相，乙腈-异丙醇（4 1）为流动相，流速为 0.5m L/m i n，检测波长为 2 1 0n m，测定结果是，胆固醇浓度在 0.1 0.8g/L 范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。结果表明，不同鸡蛋品种中胆固醇含量差异较大。该方法快速，灵敏，简便易行，无须皂化便可直接定量。关键词：胆固醇；高效液相色谱；蛋黄中图分类号：T S 2 5 3.7文献标志码：AD e t e r m i n a t i o no f C h o l e s t e r o l C o n t e n t i nD i f f e r e n t E g g P r o d u c t s b y H P L CM e t h o dY a n g Q i n，*D a i R u i t o n g（C o l l e g e o f F o o dS c i e n c e a n dN u t r i t i o n a l E n g i n e e r i n g，C h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y，B e i j i n g 1 0 0 0 8 3，C h i n a）A b s t r a c t：Ar e v e r s e d-p h a s e h i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c a s s a y w a s a p p l i e df o r t h e r a p i dd e t e r m i n a t i o no f c h o l e s-t e r o l c o n t e n t i ne g gy o l k.T h eC1 8c o l u m n（5m，2 5 0m m 4.6m m）w a s s e l e c t e da n dt h em o b i l ep h a s ec o n s i s t e do f a c e-t o n i t r i l e a n d2-p r o p a n o l（4 1）a t a f l o wr a t e o f 0.5m L/m i n.T h e d e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s 2 1 0n m.Al i n e a r i t y w a s o b t a i n e df r o m0.1t o0.8g/Lo f c h o l e s t e r o l w i t hag o o dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t.O m i s s i o no f s a p o n i f i c a t i o nh a sm a d et h i sm e t h o dm o r ec o n v e n i e n t，a n dc a nb e u s e di ny o l kc h o l e s t e r o l a s s a y.K e y w o r d s：c h o l e s t e r o l；H P L C；y o l k 7 1 农产品加工学刊2 0 0 6 年第 8 期醇含量，以期对居民的膳食有一定的指导意义。1 材料和方法1.1 主要仪器和试剂L C-1 0 A T V P型高效液相色谱仪、S P D-1 0 A V P型紫外-可见分光光度检测器，日本岛津公司产品；旋涡混和仪，其林贝尔仪器制造公司提供；R E 5 2 C S 型真空旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产；K Q 5 0 B型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司提供；旋转蒸发仪等。胆固醇标准品，含量为 9 9.0%，北京化学试剂公司提供；乙腈、无水乙醚、异丙醇、无水乙醇和石油醚，均为分析纯。乙腈和异丙醇须经过微孔滤膜过滤和超声脱气。1.2 样品来源鸡蛋样品来源见表 1。表 1 样品各 1 0 个，购于北京中关村家乐福超市，其中以每 1 个品种的 3 颗鸡蛋为一组进行分析。1.3 标准样品的配置称取 5 0.4m g 胆固醇标准品，置于 5 0m L容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，得胆固醇储备液（1.0 0 8m g/m L）。分别精密量取胆固醇储备液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0m L，用无水乙醇定容至 5m L，得浓度分别约为 0.1 0 08，0.2 0 16，0.4 0 32，0.6 0 48，0.8 0 64m g/m L胆固醇标准液。在 H P L C进样前须经过 0.2 5m的微孔滤膜过滤。1.4 样品前处理（1）取同一品种的 3 颗鸡蛋分别称质量，除去蛋清，称取蛋黄总质量，计算蛋黄相对质量。（2）将蛋黄置于烧杯中打匀，精密称取蛋黄5.0g，置于 5 0m L量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，混匀，得蛋黄稀释液 0.1g/m L。（3）精密量取蛋黄稀释液 1.0m L，置磨口塞离心管中，加入 1m L体积分数为 9 5%的乙醇，旋涡混匀，以避免絮状沉淀产生。（4）萃取：加入乙醚 2.5m L，摇动 3 0s。再加入石油醚 2.5m L，充分振荡，静置 3 0m i n，使液层分离。吸取上层有机相于另一具塞试管中，同法再依次加入乙醚、石油醚萃取 1 次，合并 2 次的萃取液。（5）浓缩：将萃取液于 4 0水浴中抽真空干燥，加入 2.0m L乙醇溶解，经 0.2 5m微孔有机过滤膜过滤后，作为 H P L C分析样品进样。每 1 个品种的鸡蛋做 3 次平行实验。1.5 色谱条件色谱柱：D i k m aD i a m o n s i lT M（钻石）-C1 8，5 m，2 5 0m m 4.6m m；流动相：乙腈-异丙醇（4 1）；流速：0.5 m L/m i n，柱温：2 5；检测波长：2 1 0n m；进样量：1 0L。2 结果讨论2.1 标准工作曲线的确定利用外标峰面积法测定标准曲线线性关系。将浓度分别为 0.1 0 08，0.2 0 16，0.4 0 32，0.6 0 48，0.8 0 64m g/m L的胆固醇系列标准液，按照本文 1.5 的色谱条件分别重复进样 3 次，进样量为 1 0L，得到峰面积的平均值。以胆固醇的质量浓度 X（m g/m L）为横坐标，相应的峰面积 Y（m A U）为纵坐标，所作胆固醇的标准工作曲线见图 1，并作线性回归。处理数据得到线性方程为：Y=95 2 00 0 0 X+3 0 00 0 0，r=0.9 9 92。结果表明，胆固醇的质量浓度和峰面积在胆固醇浓度为 0.1 0.8g/L 的范围内，具有良好的线性关系。2.2 鸡蛋中胆固醇的定性分析胆固醇标准溶液的色谱图见图 2，在选择的色谱条件下，胆固醇的保留时间为 2.2m i n。按照色谱条件，对所制备的鸡蛋样品进行色谱分析，鸡蛋样品胆固醇的色谱图见图 3，在 2.2m i n 时，胆固醇得到了分离，出现明显的色谱特征峰。蛋黄内源性物质与胆固醇色谱峰分离完全，不干扰胆固醇测定，具有较好的专一性，可以利用保留时间定性。显然，在所选择的色谱条件下，包括脂肪在内的其他组分能与胆固醇有效地分离。由此可见，采用反相高效液相色谱法测定蛋黄胆固醇含量时可以有效地避免脂表 1 鸡蛋样品来源样品编号样品名称产地123456油鸡鸡蛋柴鸡蛋 1柴鸡蛋 2红心鸡蛋普通白皮鸡蛋土鸡蛋北京油鸡产品开发中心河南中原集团集中饲养柴鸡蛋德青源无公害集中饲养柴鸡蛋北京德青源无公害红心鸡蛋北京古德曼绿色产品北京农家散养鸡 7 2 2 0 0 6 年第 8 期肪等其他组分的干扰。同时可以看出本实验所建立的色谱条件可以快速、灵敏有效地检测出样品的胆固醇含量。另外用保留时间和特征光谱图的一致性来定性，排除样品分析中一些杂质与被测物共流出的假阳性现象。胆固醇标准样品在 2m i n时的特征光谱图见图4，吸收峰波长为 2 1 0n m，正是胆固醇的检测波长（即胆固醇的特征吸收波长）。以特征光谱图吸收峰波长和胆固醇特征吸收波长的一致性来定性。2.3 鸡蛋中胆固醇的定量分析采用外标法测得鸡蛋中胆固醇的含量，按照本文1.5 所述的色谱条件，将经过前处理的鸡蛋样品上样1 0L，得到各样在 2.2m i n 时的峰面积，再由标准工作曲线 Y=95 2 00 0 0 X+3 0 00 0 0（式中 Y为峰面积，X为胆固醇的质量浓度）得到进样液中的胆固醇浓度。每 1g 蛋黄中的胆固醇含量由式（1）得出。A=X Ym。（1）式中：A 样品中的胆固醇含量，m g/g 蛋黄；X 由标准曲线得到的进样液中的胆固醇含量，m g/m L；Y 进样液的体积，即最终无水乙醇稀释的体积，m L；m 取样量，g。由式（1）计算得到结果（3 次平行实验结果的平均值），H P L C法测定不同鸡蛋中的胆固醇含量见表 2，图 5。由表 2 和图 5 可以看出，不同品种鸡蛋中的胆固醇含量存在比较大的差异，以 m g/g(蛋黄)计，胆固醇含量由大到小依次为：油鸡蛋红心鸡蛋白皮鸡蛋柴鸡蛋 2 土鸡蛋柴鸡蛋 1。其中油鸡蛋的含量最高为 2 2.3 7m g/g(蛋黄)，显著高于全国代表值1 5.1 0m g/g(蛋黄)4。柴鸡蛋 2 的胆固醇含量较低，仅为 7.0m g/g(蛋黄)，显著低于全国代表值。本次实验测定的鸡蛋黄胆固醇含量结果与报道数据基本一致，即 9.2 1 2 2.8m g/g(蛋黄)5。分析其中的原因可能有以下几点。（1）鸡蛋品种的差异在一定程度上是影响胆固醇水平差异的重要因素。由于饲料、遗传和生活环境等表 2 H P L C法测定不同鸡蛋中的胆固醇含量鸡蛋品种鸡蛋质量g蛋黄质量g蛋黄相对质量%胆固醇平均含量蛋黄m g/g鸡蛋m g土鸡蛋油鸡蛋柴鸡蛋 1柴鸡蛋 2红心鸡蛋白皮普通鸡蛋5 3.6 73 6.5 84 3.8 35 9.3 75 2.5 95 4.4 51 2.9 51 2.1 71 5.5 21 6.3 41 1.9 91 4.5 22 4.1 33 3.2 73 5.4 12 7.5 22 2.7 92 6.6 70 9.5 32 2.3 70 7.0 01 2.4 71 8.4 21 2.7 61 2 2.5 12 7 2.2 41 0 8.6 42 0 3.7 52 2 0.8 51 8 5.2 7杨琴，等：H P L C法测定不同品种鸡蛋中的胆固醇含量 7 3 农产品加工学刊2 0 0 6 年第 8 期o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e，2 0 0 4，8 4（1 4）：1 8 3 1-1 8 3 8.A r i e l R.V，C a r l o sP，L a u r aL，P e d r oM，e t a l.U V-Ct r e a t m e n t r e d u c ed e c a y,r e t a i nq u a l i t ya n da l l e v i a t ec h i l l i n gi n j u r yi np e p p e r J.P o s t h a r v e s t B i o l o g ya n dT e c h n o l o g，2 0 0 5，3 5（1）：6 9-7 8.A h m e dE.G.，C h a r l e sL.W.，A n nM.C.I n d u c t i o no fC h i t i n a s e，-1,3-G l u c a n a s e，a n dP h e n y l a l a n i n eA m m o n i aL y a s e i nP e a c hF r u i t b y U V-CT r e a t m e n t J .P h y t o p a t h o l-o g y，2 0 0 3，9 3（3）：3 4 9-3 5 5.G u s t a v o G.A.，C h i e nYW.，G e o r g e J B.U V-Ci r r a d i a t i o nr e d u c e sb r e a k d o w na n dc h i l l i n gi n j u r yo fp e a c h e sd u r i n gc o l ds t o r a g e J.J o u r n a l o f t h eS c i e n c eo f F o o da n dA g r i-c u l t u r e，2 0 0 4，8 4（5 0）：4 1 5-4 2 2.A j m n o nL.S h a u l B.，L o m a n i e c S，D r o b y EC.T h e e x p r e s-s i o no f a g r a p e f r u i t g e n e a ni s o f l a v o n e r e d u c t a s e-l i k e p r o t e i ni s i n d u c e di nr e s p o n s et oU Vi r r a d i a t i o n J.P l a n t M o l e c-u l a r B i o l o g y，1 9 9 8，3 6：8 4 7-8 5 6.E s s a i dAB，S i a m a kK.，J o s e p hM.，e t a l.I m p a c t o f U V-CI r r a d i a t i o no nt h eC e l l Wa l l-D e g r a t i n gE n z y m e sd u r i n gR i p e n i n go f T o m a t oF r u i t S.J o u r n a lA g r i c u l t u r a lF o o dC h e m i c a l，2 0 0 0，4 8：6 6 7-6 7 1.E s s a i dA.B.P r o t e c t i v ee n z y m e sa g a i n s tr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sd u r i n gr i p e n i n go f t o m a t of r u i t si nr e s p o n s et ol o wa m o u n t s o f U V-C J.A u s t r a l i aJ o u r n a l o f P l a n t P h y s i o l o-g y，2 0 0 1，2 8：7 8 5-7 9 1.A n n e-C.，D o u i l e t B.，P h i l i p p eJ e.，e t a l.C h a n g e si nt h eP h y t o a l e x i nC o n t e n t o f V a r i o u sV i t i sS p p.I nR e s p o n s et oU V-CE l i c i t a t i o n J.J o u r n a l A g r i c u l t u r a l F o o dC h e m i c a l，1 9 9 9，4 7：4 4 5 6-4 4 6 1.崔彦玲，张环.番茄叶霉病抗性与苯丙氨酸解氨酶的相关性 J .华北农学报，2 0 0 3，1 8（1）：7 9-8 2.薛应龙，欧阳光察，澳绍根.植物苯丙氨酸解氨酶的研究 J .植物生理学报，1 9 9 3，9（3）：3 0 1-3 0 5.陈毓荃.生物化学研究技术 M.北京：中国农业出版社，1 9 9 5.范淑琴，梁淑文.现代植物生理学实验指南 M .北京：科学出版社.段玉权.中国寿桃采后生理及果肉褐变机理的研究 D .北京：中国农业大学，2 0 0 2.4 5 6 7 8（上接第 7 0 页）因素的变化会影响鸡蛋胆固醇含量，使鸡蛋蛋黄的胆固醇含量因地域或饲养方法的不同而异。地域或饲养方法对鸡蛋胆固醇含量的影响已有文献记载，如全国代表值为 1 5.1 0m g/g(蛋黄)4，北京、甘肃、福建、湖北、陕西产品的胆固醇含量分别为 1 7.0 5，1 1.5 1，1 1.3 5，2 0.2 7，1 2.7 1m g/g(蛋黄)6。（2）实验过程中的误差也是导致所测值有偏差的原因。实验中所提取出的胆固醇的损失，可能导致所测值偏低。（3）不可预见因素的影响。3 结论（1）目前，测定鸡蛋蛋黄中胆固醇含量所采用的比色法和高效液相色谱法，多需对样品进行皂化处理和多次提取，以消除蛋黄中其他共存脂质成分的干扰，操作繁琐费时，通常需要数小时甚至 1 3d 完成一个样品的测定，不适用于大批量样品的快速检测。（2）采用反相高效液相色谱法测定蛋黄中的胆固醇含量，样品不需皂化处理，直接用乙醚和石油醚混合溶剂萃取处理，在 3 0m i n 内即可完成 1 个样品的分析，不仅具有简便快速的特点，而且具有良好的重现性。与比色法比较，该方法能更准确地反映样品中胆固醇的真实含量。蛋黄样品中含有的其他脂溶性成分与胆固醇色谱峰分离完全，不干扰胆固醇的测定结果。样品预处理操作步骤的简化，减少了产生测定误差的环节，使测定结果比较准确。该方法能有效地用于蛋黄中胆固醇的分离和测定，对大批样品的测定效果尤其显著 7。（3）实验结果表明，不同品种鸡蛋蛋黄的胆固醇含量存在差异，因此测定不同品种鸡蛋胆固醇含量的参考值，对于指导当地居民合理饮食具有重要意义。参考文献：曹劲松.两种测定鸡蛋胆固醇方法的比较 J.食品科学，1 9 9 6，1 7（9）：4 8-5 1.宁正祥.食品成分分析手册 M .北京：中国轻工业出版社，1 9 9 7：1 7 5-1 7 9.Wa s h b u r ne r a l.AR a p i dT e c h n i g u ef o r E x t r a c t i o no f Y o l kc h o l e s t e r o l J .p o u l t r.S c i，1 9 7 4，5 3：1 1-1 8.杨月欣.中国食物成分表 2 0 0 2 M.北京：北京大学医学出版社，2 0 0 2：1 3 5-1 3 7.张蓉真.测定鸡蛋胆固醇的高效液相色谱新方法 J .色谱，1 9 9 8，6（2）：9 1-9 4.王光亚.食物成分表（全国分省值）M .北京：人民卫生出版社，1 9 9 2：2 4 3.齐永秀.高效液相色谱法测定鸡蛋蛋黄中的胆固醇含量 J .药物生物技术，2 0 0 5，1 2（4）：2 5 8-2 6 0.1 2 3 4 5 6 7!9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 7 4