基因工程的原理和技术教学文案.ppt
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避免质粒和目的基因的自身环化?,1、避免载体和目的基因的自身环化、载体和目的基因间反向连接,2、提高重组DNA分子的重组率,(三)将目的基因导入受体细胞,(二)形成重组DNA分子(构建基因表达载体),一.基因工程的基本操作步骤,(技术),(一)获得目的基因,常用的受体细胞,:,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,重组质粒,大肠杆菌的拟核,目的基因,氨苄青霉素抗性基因(标记基因),将细菌用,CaCl,2,处理,使细胞处于感受态,可促进细胞吸收DNA分子,如果是导入微生物(如细菌),感受态,:,细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。,处于感受态的细胞称为,感受态细胞,.,CaCl,2,0,重组载体,感受态细胞,42,如果是导入微生物(如细菌),(三)目的基因导入受体细胞,1.转基因微生物,重组DNA分子,(基因表达载体),CaCl,2,处理,感受态细菌细胞,(工程菌),目的基因随受体细胞的繁殖而复制,增大细胞壁通透性,(二)形成重组DNA分子(构建基因表达载体),一.基因工程的基本操作步骤,(技术),(一)获得目的基因,吸收DNA分子,重组 DNA进入细菌细胞,如果是导入动物细胞,显微注射仪,受精卵,思考:,培育转基因动物时,受体细胞能否采用动物,体细胞,?试说明理由。一般可以采用动物的什么细胞?,用口径为1m的DNA,注射器,,将大量的目的基因片段注入到,受精卵的核,内,然后把经过注射的受精卵,移植,到另一只雌性动物的,子宫,内,使,受精卵发育,为转基因动物,。,(三)目的基因导入受体细胞,1.转基因微生物,重组DNA分子,(基因表达载体),CaCl,2,处理,感受态细菌细胞,(工程菌),目的基因随受体细胞的繁殖而复制,增大细胞壁透性,2.转基因动物,重组DNA分子,显微注射,受精卵,或早期胚胎细胞(,整合到染色体DNA上),转基因动 物,动物细胞培养,胚胎移植,(二)形成重组DNA分子(构建基因表达载体),一.基因工程的基本操作步骤,(技术),(一)获得目的基因,吸收DNA分子,重组 DNA进入细菌细胞,或病毒侵染,思考:,1、如果是导入植物细胞,最好以什么细胞为受体细胞?一般采用的运载体又是什么?,2、比如:培育抗虫棉,怎样操作才能成功导入?,农杆菌转化法,农杆菌的Ti质粒,T-DNA:(可转移的DNA),可转移,(也可以将目的基因转移),至受体细胞中,并且整合到受体细胞染色体的DNA上。,农杆菌转化法,3.转基因植物,重组DNA分子,农杆菌,植物体细胞(,整合到细胞染色体DNA上),侵染,植物组织培养,转基因植物,农杆菌转化法,利用压缩气体产生的动力,将包裹在金属颗粒(有钨粉粒子和金粉粒子,粒子的直径一般在0.64um)表面的表达载体DNA打入受体细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法。,这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法,但是成本太高。,基因枪,花粉管,卵细胞,花粉管通道法,受精后,花粉管通道法,就是在植物受粉后,花粉形成的花粉管还未愈合前,剪去柱头,然后,滴加DNA(含目的基因),使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,3.转基因植物,重组DNA分子,农杆菌,植物体细胞(,整合到细胞染色体DNA上),侵染,植物组织培养,转基因植物,基因枪或,花粉管通道法,农杆菌转化法,(三)目的基因导入受体细胞,(二)形成重组DNA分子(构建基因表达载体),一.基因工程的基本操作步骤,(技术),(一)获得目的基因,(四)目的基因的检测与鉴定,问题1:,根据中心法则,目的基因怎样表达?成功表达的标志是什么?,按照基因表达顺序逐步检测,逐步过关,检测转基因生物体内是否已含有目的基因,检测目的基因是否已转录出了mRNA,检测目的基因是否已翻译出了蛋白质,检测个体是否具有目的基因所对应表现型,如何检测?,思考:通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体?,没有质粒,含目的基因的质粒,正常质粒,没有质粒,含目的基因的质粒,正常质粒,DNA分子杂交法检测目的基因,DNA分子杂交法,制作方法:,化学合成或PCR法合成,特点:,1.被放射性同位素标记,2.目的基因片段,3.单链DNA,原理:,碱基互补配对,检测未知DNA分子,用途:,目的基因检测,DNA指纹,亲缘关系测定,基因诊断。,DNA分子探针法,检测转基因生物体内是否已含有目的基因,同理:,核酸分子杂交技术,按照基因表达顺序逐步检测,逐步过关,思考,:受体细胞摄入目的基因后就说明目的基因完成了表达吗?,检测目的基因是否已转录出了mRNA,检测转基因生物体内是否已含有目的基因,检测目的基因是否已转录出了mRNA,检测目的基因是否已翻译出了,蛋白质,利用,抗原-抗体,的特异性结合,按照基因表达顺序逐步检测,逐步过关,问题:,如何运用抗原抗体特异性结合的原理检测目的基因是否翻译出了蛋白质?,检测目的基因是否已翻译出了,蛋白质,利用,抗原-抗体,的特异性结合,将目的基因表达出的蛋白质作为抗原,制备抗体,检测转基因生物体内是否已含有目的基因,检测目的基因是否已转录出了mRNA,检测目的基因是否已翻译出了蛋白质,检测个体是否具有目的基因所对应表现型,按照基因表达顺序逐步检测,逐步过关,问题:,除了上述分子检测外,你能否在个体生物学水平上进行检测?例如,如何检测转基因抗虫棉具有抗虫特性?,转基因,抗虫植物,用棉花叶片饲喂棉铃虫,如虫吃后不出现中毒症状,说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡,则说明摄入了抗虫基因并得到表达,。,(四)目的基因的检测与鉴定,1.目的基因是否导入:,(1)标记基因检测法。,(2)DNA分子杂交法(,DNA探针检测法,),2.目的基因是否表达:,(3)是否出现目的基因所控制的性状:,(2)是否翻译合成了蛋白质:,抗原抗体杂交检测法,核酸,分子杂交法,(1)是否转录出了信使RNA:,观察法,基因工程的基本操作程序,基因文库,获取目的基因,基因组文库,cDNA文库,化学合成法,PCR扩增法,运载体(细菌质粒),酶切、连接,构建,重组DNA(基因表达载体),受体细胞,导入,筛选,动物受精卵,植物体细胞,细菌细胞,组织培养,发酵工程,胚胎移植,表达产物,转基因动物,转基因植物,目的基因的表达与鉴定,总结:,二.基因工程的原理,1.整体原理:,人工的基因重组,2.各步骤原理:,(1)基因能转移:,基因是独立的遗传单位,(2)不同生物的基因能拼接:,不同生物的DNA有着相同的双螺旋结构和碱基互补配对原则,限制酶和连接酶的作用。,(3)同一基因在不同生物的细胞中合成相同的蛋白质:,复制、转录和翻译过程相同,密码子具有通用性,3.优点:,定向改变生物的遗传特性,例,1,科学工作者分离得到了某真核生物的基因,A,,将其解离成两条具有互补关系的单链,其中的一条与基因,A,的信使,RNA,进行配对,杂交后可以观察到如图所示的结构对此结果的合理解释是(),A,1,、,3,、,5,、,7,为,DNA/RNA,的杂交体,,2,、,4,、,6,为单链,DNA,部分,B,1,、,3,、,5,、,7,为,DNA/RNA,的杂交体,,2,、,4,、,6,为单链,RNA,部分,C,1,、,3,、,5,、,7,为双链,DNA,部分,,2,、,4,、,6,为,DNA/RNA,的杂交体,D,1,、,3,、,5,、,7,为单链,RNA,部分,,2,、,4,、,6,为,DNA/RNA,的杂交体,A,例,2,.质粒是基因工程中最常用的运载体,质粒上有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况也不同。右图表示外源基因插入位置(插入点有a、b、c),请据下表细菌生长情况,推测三种重组细菌与外源基因插入点相对应的一组是,重组细菌,含氨苄青霉素培养基,含四环素的培养基,能生长,能生长,能生长,不能生长,不能生长,能生长,A是c、是,a,、是,b,B 是c和b、是b、是c,C是c和b、是c、是b,D 是a、是b、是c,b,a,c,A,b,c,a,例,3,.培育转基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因(kan)常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程.,抗虫基因,含kan质粒,重组质粒,土壤,农杆菌,含重组质粒土壤农杆菌,A,构建,C,诱导选择,导入,转基因,抗虫植株,再生植株,愈伤组织,离体棉花叶片组织,侵染,B,培养选择,分化,D,检测,(1)A过程需要的酶有 _。,(2)B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备 的两个条件是_。,(3)C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外,还必须加入_。,限制性核酸内切酶和DNA连接酶,能够自我复制、具有标记基因,卡那霉素,4.如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测,D过程应该用_作为探针。,5.科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。,将转基因植株与_杂交,其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1:1。,若该转基因植株自交,则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为_。,若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养,则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_%。,标记的目的基因,非卡那霉素敏感型,3:1,100,例,4,.,科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组,并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答问题,典型例题1:,(1)步骤和中常用的工具酶是,和,。,(2)图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因,经过和步骤后,有些质粒上的,基因内插入了外源目的基因,形成重组质粒,由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。,(3)步骤是,的过程,为了促进该过程,应该用,处理大肠杆菌。,(4)步骤将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养,目的是筛选,,能在C中生长的大肠杆菌有,种。,(5)步骤:用无菌牙签挑取C上的单个菌落,分别接种到D(含氨苄青霉素和四环素)和E(含四环素)两个培养基的相同位置上,一段时间后,菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于,(D、E)上,请在图中相应的位置上圈出来。,答案,(1)限制性核酸内切酶 DNA连接酶,(2)氨苄青霉素抗性基因,(3)将重组质粒(目的基因)导入大肠杆菌(受体细胞)CaCl2溶液,(4)含四环素抗性基因的大肠杆菌(含抗性基因的大肠杆菌给分,回答含目的基因的大肠杆菌不给分)2,(5)E(评分标准:在两个菌落中圈一个也可给分),把正常基因导入目标细胞,以纠正或补偿基因缺陷,达到治疗的目的。,基因治疗,蛋白质工程,:,基因DNA,氨基酸序列多肽链,蛋白质,空间结构,mRNA,转录,翻译,DNA合成,生物功能,预期功能,点突变,分子设计,折叠,原理:,改造基因(基因修饰或基因合成),目的:,定向改造或制造,自然界不存在,的,蛋白质,(,以满足人类的生产和生活的需求,),第二代基因工程,例:T4溶菌酶,异亮氨酸,半胱氨酸,二硫键的形成提高了,T4溶,菌酶,的热稳定性,此课件下载可自行编辑修改,仅供参考!感谢您的支持,我们努力做得更好!谢谢,- 配套讲稿:
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