无菌操作技术在微生物四项基本实验技术中的应用和意义.doc

无菌操作技术主要是指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌实验器材及无菌操作方法等。
微生物学四项基本实验技术是指显微镜技术、无菌操作技术、纯种分离技术和纯种培养技术。
微生物学实验技术所用玻璃器皿。不但要像化学实验那样要求清洁，而且还要无菌（玻璃器皿、接种工具、材料要灭菌），实验过程中要严格无菌操作。实验结束后若桌面被菌液污染，可用3％来苏尔液擦拭干净，带菌工具（吸管、塑料吸嘴、玻璃刮棒、染色涂片等）洗涤前浸泡在3％来苏尔液中，消毒后再清洗。有微生物污染的废物要集中处理，不能污染环境。
无菌操作一般是在无菌环境条件下，使用无菌器材进行检验或实验过程中，防止微生物污染和干扰的一种常规操作方法。无菌操作的目的，一是保持待检物品不被环境中微生物所污染；二是防止被检微生物在操作中污染环境和感染操作人员，因而无菌操作在一定意义上讲又是安全操作。
无菌操作技术在微生物四项基本实验技术中的应用和意义从以下四个方面做简要的论述：
一、在显微镜技术中的应用和意义
微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察到，因此在微生物学的各项实验技术中，显微镜就成为研究者不可缺少的工具。显微镜的种类很多，根据其结构，一般分为光学显微镜和非光学显微镜两大类，在实验室观察微生物形态常用的显微镜，以光学显微镜最为常见。在显微镜技术中必不可少的是涂片、染色等技术，无论是在制片还是染色等过程中，防止杂菌的污染即无菌操作都是非常重要的，一旦被观察的玻片遭到杂菌污染，将使观察结果受到严重偏差和影响。
因此在操作过程中为保证无菌操作应注意：①在实验室观察平板培养物时，一般不宜开盖观察；检验结果，可以开盖检查。如取菌作涂片染色或移植培养时。培养皿上下盖可适度开缝，但不准完全揭开；②涂片染色时应使用夹子夹持玻片，切勿用手直接拿玻片，以防感染细菌；③用过的玻片应放置消毒液中或直接煮沸消毒，冲洗液也应煮沸或消毒处理后再倒掉以免污染环境。
二、无菌操作技术
在微生物实验中，菌种的移值、接种和分离工作等，都要排除杂菌的污染，才能获得纯的符合要求的微生物纯培养体。为此，除严格按无菌操作进行外，尚需要有一个无杂菌污染的工作环境。通常，可在酒精灯旁进行无菌接种；小规模的操作可以使用无菌箱(接种箱)或超净工作台；工作量大的使用无菌室(接种室)；要求严格的可在无菌室内再结合使用超净工作台。
无菌操作技术包括无菌环境、无菌器材和无菌操作三个方面。
无菌环境只是相对而言的，是指人们利用物理的方法或化学的方法，在某一可控制空间内使微生物数量降低至最低限度，接近于无菌的一种空间。而无菌室和无菌柜、超净工作台就可做到这样的空间。无菌室是最常用的无菌环境之一。无菌室的建筑设计应考虑布局合理，使用方便，操作安全以及造价适宜等条件。无菌柜的优点是简单轻便体积小，易于灭菌消毒，安全并可移动，但操作不便，适用于一般接种操作，尤其适用于致病菌检验中阳性菌的接种、划线等操作。超净工作台目前较常用，它是通过通入经超细过滤的无菌空气以维持其无菌状态的。
无菌器材是无菌技术的主要组成部分，微生物检验和实验用器材可分为两类：①器材灭菌：凡是检验中使用的器材，能灭菌处理的必须灭菌，如玻璃器皿（包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培养基、稀释剂、无菌衣、口罩、胶管、乳胶头。金属器材（如外科刀、剪、镊子、针头等），凡能包裹的，应先用包装纸包裹后，再进行灭菌。②器材消毒：凡检验用器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理，例如无菌室内的凳、试管架、天平、工作服等，这些虽然无法灭菌，但是可以消毒。消毒可用化学药品熏蒸、喷洒或擦拭。
上述的无菌环境条件只是相对而言，实际上不可能保持环境的绝对无菌。因此关键是要严格进行正确的无菌操作。
三、在纯种分离技术中的应用和意义
在微生物学中，为了研究某种微生物的特性，必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养物，这种获得只含有某一种或某一株微生物纯培养的过程，成为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养物，一般是根据该微生物的特性，设计适宜的培养基和培养条件，以利于该微生物的生长繁殖，或加入某些抑制因素，造成只利于此菌生长，而不利于其他菌生长的环境条件，从而淘汰其他杂菌。然后再通过各种稀释法，使所需的菌在固体培养基上形成单菌落。当然，从微生物群体中经分离后生长在平板上的单个菌落，并不能保证一定是纯培养，还要经过一系列的分离、纯化和鉴定，才能获得所需要的纯菌株。
常用的微生物分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养基法等。其中前三种方法最为常用，不需要特殊的仪器设备，分离纯化效果好。
四、在纯种培养技术中的应用和意义
在微生物学实验技术中，常需要用接种环把微生物纯培养物，由一个器皿移接到另一个培养容器中进行培养。由于周围环境（主要是空气）中，存在着大量肉眼无法发现的各种污染物，只要一打开器皿，就可能会引起器皿内的培养基或培养物，被环境中其他微生物所污染。因此，微生物菌种移接的所有操作，均应在无菌环境下进行严格的无菌操作。
将微生物的培养物或含有微生物及可疑含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态、生理的实验及观察研究都必须进行接种，接种的关键要严格的无菌操作，如操作不慎引起污染则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。因此应注意：①一切操作均应在火焰旁进行，要充分利用火焰周围的高温区（无菌区），即接种时，管口和瓶口始终保持在火焰（如酒精灯焰）旁边，进行熟练地移接种操作，以便保证微生物的纯种培养。②棉塞应该始终夹在手中，如掉落应更换无菌棉塞 ③如不慎使棉塞触及火焰着火，切勿用口吹，应在刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不足很快熄灭，若棉塞外端着火，则可用手捏灭，或废弃踩火后更换无菌棉塞。④接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染，如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净，凡吸过菌液的吸管或滴管应立即放入有消毒液的容器内。此外，挑取和移接微生物纯培养物用的接种环及接种针，应采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌；转移液体纯培养物时，应采用无菌吸管或无菌移液枪。接种和培养过程中必须保证不被其他微生物污染，因此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外，熟练地掌握各种无菌操作技术是很重要的。
微生物无处不在，无孔不入，因此，在对微生物的研究和应用过程中，必须随时注意保持微生物纯培养物的纯洁性，防止其他微生物（杂菌）的混入；在进行分离、转接及培养微生物纯培养物事，要采用严格的无菌操作技术，防止被其他微生物所污染。
实际上，人工创造的无菌环境条件只是相对而言，不可能保证环境的绝对无菌。因此，在实验过程中必须保证不被其他微生物污染，关键是要严格进行正确的无菌操作，熟练地掌握各种无菌操作技术。

附图：
普通光学显微镜 荧光显微镜
超净工作台 高压蒸汽灭菌器
全自动细菌接种分离培养系统 斜面接种的无菌操作
接种环 红外接种环灭菌器
手提式灭菌锅 普通无菌室操作
无菌室 无菌隔离系统