凝胶渗透色谱（GPC）_24页.pdf

1凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography）凝胶色谱原理 凝胶色谱(Gel Permeation Chromatography)一种新型的液相色谱，基于体积排阻效应原理，即根据化合物分子大小不同而达到分离净化的目的，是色谱法中最新的分离技术之一18。按溶质分子的大小进行分离2凝胶色谱的产生 1959年:porath&flodin 交联的缩聚葡糖制成凝胶 生物化学研究领域 1964年：moore 苯乙烯和二乙烯苯 有机溶剂体系 高分子科学领域 60年代末：开始用于农药残留分析 应用范围：生物化学、高分子化学、有机和无机化学等领域 是一种重要的分离手段凝胶的种类和选择 凝胶是凝胶色谱的核心，分离作用的基础 根据样品类型、各组分的分子量大小来决定所选择的凝胶的种类 选择和搭配不同性能、不同孔径的凝胶决定分离净化的效果凝胶的种类和性质亲油性硬胶非均匀胶多孔玻璃亲水亲油两性硬胶非均匀胶多孔硅胶无机胶亲水性软胶均匀胶琼脂凝胶亲水性软胶均匀胶交联聚丙烯酰胺两性胶软胶均匀胶羟丙基化交联葡聚糖亲水性软胶均匀胶交联葡聚糖亲油性软胶、半硬胶均匀胶半均匀胶交联聚乙酸乙烯酯亲油性软胶均匀胶交联聚苯乙烯有机胶亲和性硬度均匀性凝胶种类有机胶无机胶3凝胶色谱仪 主要组成部分包括：输液系统（包括溶剂贮存器、脱气装置、输液泵、进样器等）凝胶色谱柱 检测器、信号记录装置 馏分收集器凝胶色谱在农药残留分析中的应用 1967年：ruzicka等首先报道了凝胶色谱法用于蔬菜样本中有机磷农药的残留分析 1971年：stalling等将凝胶渗透色谱作为一种快速净化技术，用于脂类杂质与农药的分离，并使这种技术初步实现了自动化近年来的应用及研究情况90-150 甲苯-乙酸乙酯（1：3）27*2 Bio-Beads S-X3 有机磷有机氯蔬菜动物油脂100-250 环己烷37*2.5 Bio-Beads S-X2 有机磷有机氯含油脂食品100-280 环己烷33*2.5 Bio-Beads S-X2 有机磷、有机氯等鱼50-90 乙醇22.3*2 SephadexLH-20 有机磷蔬菜农药洗脱体积洗脱溶剂胶床（高*内径 cm）凝胶种类农药品种样品类型416-30 乙酸乙酯-环己烷（1：1）45*1 Bio-Beads S-X3 有机磷氨基甲酸酯蜂蜜120-200 乙酸乙酯-环己烷（1：1）34*2.5 Bio-Beads S-X3 有机氯含油脂食品150-320 二氯甲烷-己烷（1：1）48*2.5 Bio-Beads S-X3 有机氯动物脂肪玉米油80-300 二氯甲烷-环己烷（15：85）30*2.5 Bio-Beads S-X3 有机磷蔬菜水果16-31 乙酸乙酯-环己烷（1：1）30*1填料8.5克Bio-Beads S-X3 多残留水果蔬菜14-22 三氯甲烷-环己烷（2：3）50*0.8 Bio-Beads S-X3 benzoylurea苹果8-35 乙酸乙酯-环己烷（1：1）20*1填料7克Bio-Beads S-X3 有机磷有机氯谷物9-16 乙酸乙酯-环己烷（1：1）20*1填料7克Bio-Beads S-X3 有机磷蔬菜研究情况分析：填料1、基本要求：用于农药残留分析样本净化的凝胶必须是可以使用有机溶剂的且孔径较小的凝胶。2、曾经研究和使用过的有交联葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）和交联聚苯乙烯凝胶(Bio-Beads S-X)两大类。3、实验证实Bio-Beads这类凝胶对脂类杂质的净化效果更好。4、Bio-Beads S-X3可以在一定压力下使用，更有利于实现自动化，因此Bio-Beads S-X3已经成为农药残留分析中主要使用的凝胶品种。5研究情况分析：凝胶色谱柱 要求：耐压玻璃柱 或不锈钢柱内径：1.0-2.5cm之间柱内凝胶高度一般不低于20cm 存在的问题：往往因在实际使用时选择了比较大的柱子和填充过多的凝胶造成农药洗脱体积过大,浪费了大量的溶剂和分析时间。研究情况分析：凝胶色谱条件 淋洗剂：对农药有良好的溶解性同时对凝胶有一定的溶胀能力(乙酸乙酯-环己烷或二氯甲烷-环己烷等不同比例的混合溶剂)上样量 上样体积:5mL 淋洗剂流速：1-5 mL/min研究情况分析：净化效果 水果蔬菜样本:一步净化、气相色谱法选择性检测器（FPD、ECD）等直接检测有机磷、有机氯类农药 含油脂类杂质较多的食品:配合吸附色谱法进一步净化6凝胶色谱存在的问题?溶剂用量大净化柱朝着小内径、大载荷量以及小体积进样的方向发展。从而提高宁叫色谱的分离度，扩展凝胶色谱技术的应用的范围。凝胶色谱存在的问题?不完全分离较大分子的农药可能会随着油脂等干扰物先流出，所以有时需再增加柱色谱进一步净化.分析方法的确立 样品-提取浓缩-上样 一定的压力下使流动相以恒定的速度流过色谱柱 检测器检测或分段收集浓缩后用气谱和液谱检测 根据杂质和农药的流出体积确定选择所要收集组分的体积7油脂油脂色素色素农药农药GPCGCMS油脂色素农药油脂色素农药油脂色素油脂色素农药农药SPE农药残留分析用凝胶色谱仪的研制及改进 1972年：Stalling和Tindle首先发明了自动的凝胶色谱仪并用于分离净化油脂和有机磷等农药 至今，自动化的凝胶色谱技术已经作为最有效的方法用于环境样品、食品、废弃污染物和其他样品的净化仪器的主要构成 输液泵 色谱柱 进样装置 检测器 馏分收集装置8半自动凝胶色谱仪 手动操作部分：进样、收集、检测 自动化部分：淋洗、上样 商品：KL-SX-3型、200mm*10mm（i.d.）Dedicated Sample Cleanup System（DSCS）Model 18LMS450mm*10mm（i.d.）优点 仪器组装简便，使用效果较好，成本低 可以选择凝胶的用量 可以人为控制多种色谱条件存在的问题 手动上样，使用较大体积的注射器（10mL）将样品注入六通阀，操作相对困难、耗时。溶剂易从注射器的后端流出，对操作人员有一定危害。9全自动凝胶色谱仪 实现了上样、检测和馏分收集等全面的自动化 商品：GPC AutoPrep 1001GPC AutoPrep 1002 AWater EnviogelJ2 AccuPrep 美国 J2 Scientific AccuPrep 美国 OI Analitical AutoPrep 2000 法国 Gilson GPC-3 德国 LC Tech VARIO GPC AutoPrep 1001&1002A60cm*2.5cm，进样体积为5 mL，流速为5 mL/min，分析一个样品大约需要 400mL溶剂，耗时1小时 AccyPrep连接高效快速的Express柱（300*10mm）,可以承受500mg的脂肪样品，节省溶剂和分析时间。10原理 Vt=VM+Va+Vp设柱床总体积为Vt，固定相体积为Va(多孔颗粒内孔穴所占体积)，Vp为多孔颗粒所占体积，VM为死体积(即溶剂化的多孔颗粒之间空隙中不受约束的溶剂体积)大的溶质分子被微孔排阻，VR=VM，kd=0，小的溶质分子可进入柱的所有微孔，VR=VM+VS，kd=1。其它溶质分子的kd在0和1之间。当0kdAbundanceTI C:4092412.D内标 1内标 2内标 3内标 4图2.4 109中农药和4种内标物的在选择离子模式下采集的总离子流图Figure 2.4 TIC of 109 pesticides representing and 4 internal standard representing using SIM mode.方法的线性范围、回收率和最低检出限方法的线性范围、回收率和最低检出限1.1.大部分农药回收率保持在70 110，变异系数小于20；大部分农药回收率保持在70 110，变异系数小于20；2.2.以信号与噪音比3计算的最低检测限保持在120 ng/g之间；以信号与噪音比3计算的最低检测限保持在120 ng/g之间；3.3.109种农药除氯氰菊酯和氟氯氰菊酯线性范围在0.168 109种农药除氯氰菊酯和氟氯氰菊酯线性范围在0.168 g/mL之间内，其它大部分农药的线性范围在0.048 g/mL之间内，其它大部分农药的线性范围在0.048 g/mL之间,相关系数均大于0.99g/mL之间,相关系数均大于0.99234.由于基质增强效应的存在，碘硫磷；特效唑；环丙唑醇；戊唑醇；伏杀硫磷；蝇毒磷等农药的回收率高于110；5.敌敌畏，速灭磷，甲基内吸磷；乙拌磷；二嗪磷；嘧啶磷；等药不稳定，回收率低于 70；6.联苯菊酯；苯醚菊酯；呋线威；氯菊酯；氟硅菊酯由于GPC切割点的选择，回收率较低。4.由于基质增强效应的存在，碘硫磷；特效唑；环丙唑醇；戊唑醇；伏杀硫磷；蝇毒磷等农药的回收率高于110；5.敌敌畏，速灭磷，甲基内吸磷；乙拌磷；二嗪磷；嘧啶磷；等药不稳定，回收率低于 70；6.联苯菊酯；苯醚菊酯；呋线威；氯菊酯；氟硅菊酯由于GPC切割点的选择，回收率较低。苏丹红的分析三种溶剂对辣椒中苏丹红染料提取效果比较 添加回收率%提取溶剂 颜色 透明度 苏丹红 1 号 苏丹红 2 号 苏丹红 3 号 苏丹红 4 号乙腈 浅红色 澄清 97.2 96.4 92.8 93.7 乙酸乙酯 红色 浑浊 93.1 89.6 86.3 89.0 正己烷 深红色 澄清 87.5 87.0 83.0 85.9 NNHONNHONNHONNNNHONN辣椒中天然色素（主要是辣椒红素和辣椒玉红素）、油脂（植物性C16、C18脂肪酸，分子量在600-1500），鸭蛋中蛋白质和脂肪（动物性C16、C18脂肪酸，分子量在600-1500）241.0 02.0 03.0 04.0 05.0 06.0 07.0 08.0 09.0 01 0.0 01 1.0 0T im e01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%1.0 02.0 03.0 04.0 05.0 06.0 07.0 08.0 09.0 01 0.0 01 1.0 0T im e01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%图 4.1.2 空白鸭蛋的 HPLC-MS/MS 的 MRM 色谱图 2.004.006.008.0010.0012.0014.00Time0100%0100%0100%0100%0100%0100%2.004.006.008.0010.0012.0014.00Time0100%0100%0100%0100%0100%0100%图 4.1.3 鸭蛋中四种苏丹红染料的 HPLC-MS/MS 的 MRM 色谱图（添加浓度 10ng/kg 1.0 02.0 03.0 04.0 05.0 06.0 07.0 08.0 09.0 01 0.0 01 1.0 0T im e01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%1.0 02.0 03.0 04.0 05.0 06.0 07.0 08.0 09.0 01 0.0 01 1.0 0T im e01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%图 4.1.5 空白辣椒的 HPLC-MS/MS 的 MRM 色谱图 1.0 02.0 03.0 04.0 05.0 06.0 07.0 08.0 09.0 01 0.0 01 1.0 0T im e01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%1.0 02.0 03.0 04.0 05.0 06.0 07.0 08.0 09.0 01 0.0 01 1.0 0T im e01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%01 0 0%图 4.1.6 辣椒中四种苏丹红染料的 HPLC-MS/MS 的 MRM 色谱图（添加浓度 10ng/kg）