共聚焦激光扫描显微镜技术_复旦大学上海医学院_88页.pdf

Confocal黄娅林复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室黄娅林复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室Confocal共聚焦激光扫描显微镜技术共聚焦激光扫描显微镜技术Confocal?Confocal 技术基本情况介绍技术基本情况介绍?Confocal 工作原理和性能特点工作原理和性能特点?Confocal 样品制作和系统操作样品制作和系统操作?Confocal 技术在科研中的作用技术在科研中的作用Confocal共聚焦激光扫描显微镜共聚焦激光扫描显微镜Confocal Laser Scanning Microscopy(CLSM,Confocal)共聚焦激光扫描显微镜在传统荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合计算机对荧光图像进行加工处理观察细胞和组织内部各个层面或不同侧面的形态变化共聚焦激光扫描显微镜在传统荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合计算机对荧光图像进行加工处理观察细胞和组织内部各个层面或不同侧面的形态变化。?基本情况介绍基本情况介绍Confocal特殊结构特殊结构分辨率提高30%-40%产生真正意义的三维图像观察活细胞的动态变化细胞内离子的动态测量分辨率提高30%-40%产生真正意义的三维图像观察活细胞的动态变化细胞内离子的动态测量?基本情况介绍基本情况介绍Confocal激光器扫描装置荧光显微镜激光器扫描装置荧光显微镜直立或倒置探测器探测器PMT计算机计算机系统控制软件各种应用软件图像储存和输出设备图像储存和输出设备系统构成系统构成?基本情况介绍基本情况介绍ConfocalLeica TCS-NT(1997.6)Leica CLSM(1994.5）Leica TCS-SP2(2004.9)仪器简介仪器简介?基本情况介绍基本情况介绍医学神经生物学国家重点实验室（医学院路138号治道楼801）ConfocalLeica TCS-SP25(2007.12)仪器简介仪器简介?基本情况介绍基本情况介绍生物医学研究院干细胞研究所（东安路130号西13号楼410）ConfocalLeica CLSM显微镜激光器显微镜激光器?基本情况介绍基本情况介绍Confocal显微镜显微镜DM RBC 直立显微镜Objective type Magnification Numeral Technique Workingaperture distance(mm)PL FLUOTAR 5x 0.12 13.1PL FLUOTAR 10 x 0.30 4.9PL FLUOTAR 16x 0.50 IMM*0.15PL APO 50 x 0.75 W*0.12N PLAN 100 x 1.20-0.45 W 0.07*IMM=either water,glycerine or oil*W =water激光器激光器Argon(488，514nm)He/Ne 543nmHe/Ne 633nm?基本情况介绍基本情况介绍Leica TCS-NTConfocal?基本情况介绍基本情况介绍Leica TCS-NTConfocal显微镜显微镜DM IRE2 倒直显微镜Objective type Magnification Numeral Technique aperture HC PL FLUOTAR 5x 0.15 HC PL APO CS 10 x 0.4 HC PL APO CS 20 x 0.7 IMM*HCX PL APO CS 40 x 1.25 OIL HCX PL APO CS 63x 1.4 OILHCX PL APO CS 100 x 1.4 OIL *IMM=glycerin or oil 激光器激光器Argon(488，514nm)He/Ne 543nmHe/Ne 633nm双光子双光子780-900nm(DAPI、Hoechst、BFP、CFP)?基本情况介绍基本情况介绍Leica TCS-SP2Confocal?基本情况介绍基本情况介绍Leica TCS-SP2Confocal激光器激光器405nm LaserArgon(458nm，476nm，488nm，514nm)He/Ne 561nm He/Ne 633nm?基本情况介绍基本情况介绍Leica TCS-SP5显微镜显微镜DMI6000 倒直显微镜Objective type Magnification Numeral Technique aperture HC PL APO CS 10 x 0.4 DRYHCX PL FLUOTAR 20 x 0.4 DRY HCX PL APO 20 x 0.7 IMM*HCX PL APO 40 x 1.25 OIL HCX PL APO 63x 1.4 OIL*IMM=glycerin or oil Confocal?基本情况介绍基本情况介绍Leica TCS-SP5ConfocalLaserPinhole激光束经照明针孔反射至物镜，在样品的某一焦平面形成一个点，并进行扫描。聚焦平面内各个像素点的荧光强度经探测针孔后由光电倍增管收集放大，迅速形成高清晰度的荧光图像。激光束经照明针孔反射至物镜，在样品的某一焦平面形成一个点，并进行扫描。聚焦平面内各个像素点的荧光强度经探测针孔后由光电倍增管收集放大，迅速形成高清晰度的荧光图像。照明针孔和探测针孔的共轭照明针孔和探测针孔的共轭显微镜的步进马达装置显微镜的步进马达装置?工作原理工作原理ConfocalPinhole与图像的关系与图像的关系?工作原理工作原理Confocal一.横向分辨率比普通荧光显微镜高一.横向分辨率比普通荧光显微镜高1.4倍倍用抗Tubulin抗体染色的Astrocyte：非共焦（左）及共焦（右）图像并列显示?性能特点性能特点Confocal样品厚度可达500m深度分辨率为0.1m扫描模式：样品厚度可达500m深度分辨率为0.1m扫描模式：xy：观察样品不同层面的荧光强度变化：观察样品不同层面的荧光强度变化xz：观察样品沿Z轴的荧光强度变化：观察样品沿Z轴的荧光强度变化?性能特点性能特点二.具有连续光学切片功能和Z向观察能力二.具有连续光学切片功能和Z向观察能力Confocal扫描模式扫描模式决定了图像的扫描层次。基本上是扫描水平的xy-切片或垂直的xz-切片。为建立样品的三维图像，需要在第三维方向上进行连续的光学切片以产生图像垛。还可以以时间或波长为第三维坐标进行图像扫描。决定了图像的扫描层次。基本上是扫描水平的xy-切片或垂直的xz-切片。为建立样品的三维图像，需要在第三维方向上进行连续的光学切片以产生图像垛。还可以以时间或波长为第三维坐标进行图像扫描。扫描模式功能扫描模式功能xyz 在Z轴方向上进行连续的xy-切片xzy在y轴方向上进行连续的xz-切片xt连续进行多次线扫描xyt对xy-切片进行连续多次扫描xzt对xz-切片进行连续多次扫描xyzt以xyz扫描方式对图像垛进行连续多次扫描xy在不同的波长下扫描xy切片xz在不同的波长下扫描xz切片xyt在不同的波长下对xy切片进行连续多次扫描xyz在不同的波长下对xyz图像垛进行扫描?性能特点性能特点二.具有连续光学切片功能和Z向观察能力二.具有连续光学切片功能和Z向观察能力ConfocalA Series of Image of xy-sectionCultured gliocyte of rat brain stained by Fluorescin.二.具有连续光学切片功能和Z向观察能力二.具有连续光学切片功能和Z向观察能力?性能特点性能特点Confocal二.具有连续光学切片功能和Z向观察能力二.具有连续光学切片功能和Z向观察能力?性能特点性能特点Confocal探测低对比度或弱荧光信号通过目镜可直接观察各种生物样品的弱自发荧光探测低对比度或弱荧光信号通过目镜可直接观察各种生物样品的弱自发荧光三.采用激光照明三.采用激光照明?性能特点性能特点Confocal四.四.观察活组织和活细胞的动态变化四.观察活组织和活细胞的动态变化?性能特点性能特点ConfocalDrosophila mitosispre-cellularized embryoGFP-tagged histone,Tubulin:rhodamine四.观察活组织和活细胞的动态变化四.观察活组织和活细胞的动态变化?性能特点性能特点Confocal利用激光扫描技术，借以特定的荧光探针，快速、准确地测定细胞内各种离子含量，包括Ca利用激光扫描技术，借以特定的荧光探针，快速、准确地测定细胞内各种离子含量，包括Ca+、Mg、Mg+、Na、Na+、K、K+、H、H+以及pH值等。以及pH值等。细胞内游离钙测定细胞内游离钙测定细胞内Ca细胞内Ca2+2+稳态的维持对生命活动是至关重要的，病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，致细胞坏死和凋亡，测定细胞内钙在生理、病理和药理学上均具有重要意义。稳态的维持对生命活动是至关重要的，病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，致细胞坏死和凋亡，测定细胞内钙在生理、病理和药理学上均具有重要意义。五.细胞内各种离子的动态测量和分析五.细胞内各种离子的动态测量和分析?性能特点性能特点ConfocalConfocal提供高分辨率二维图像和三维图像提供高分辨率二维图像和三维图像准确测定单个细胞内不同部位的Ca准确测定单个细胞内不同部位的Ca+含量实时动态观察Ca含量实时动态观察Ca+含量变化含量变化钙敏荧光探针激发波长发射波长-钙敏荧光探针激发波长发射波长-Quin-2 339 nm 492 nmIndo-1 350 nm 485 nmFura-2 380 nm 510 nmFluo-3 490 nm 525 nmCalcium Green 505 nm 530 nmCalcium Orange 505 nm 530 nm 五.细胞内各种离子的动态测量和分析五.细胞内各种离子的动态测量和分析?性能特点性能特点Confocal五.细胞内各种离子的动态测量和分析五.细胞内各种离子的动态测量和分析?性能特点性能特点ConfocalPhysiology Chart(Time:10:15:21)0.0040.0080.00120.00160.00Int.200.00400.00600.00800.00sChannel 1Cultured hippocampal neurons of ratFluo-3(AM)五.细胞内各种离子的动态测量和分析五.细胞内各种离子的动态测量和分析?性能特点性能特点ConfocalCa2+-imaging:UV-uncagingCa-Indicator:Fluo 4,488 nmPancreatic acinar cells五.细胞内各种离子的动态测量和分析五.细胞内各种离子的动态测量和分析?性能特点性能特点ConfocalCardiomyocytesFluo-3Ca2+-sparks andCa2+-waves五.细胞内各种离子的动态测量和分析五.细胞内各种离子的动态测量和分析?性能特点性能特点Confocal五.细胞内各种离子的动态测量和分析五.细胞内各种离子的动态测量和分析?性能特点性能特点Confocal共定位（Co-localization）：是指两个或多个分子（蛋白）完全处于同一空间位置上。多通道同步采集图像研究各种组织和细胞内物质之间的相互关系共定位（Co-localization）：是指两个或多个分子（蛋白）完全处于同一空间位置上。多通道同步采集图像研究各种组织和细胞内物质之间的相互关系六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像?性能特点性能特点ConfocalABCD六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像3 Channels(A,B,C)+Overlay(D)?性能特点性能特点Confocal六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像?性能特点性能特点ConfocalMouse cerebellar cortex.Hoechst 33258,anti-GFAP/Cy5,anti-calbindin-D28k/Cy3六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像?性能特点性能特点Confocal四色荧光标记四色荧光标记C.Elegans nervous system,separation of 4 fluorescent proteins:CFP,YFP,GFP,DS RED.Courtesy.Dr.Harald Hutter,MPI for Medical Research,Heidelberg六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像六.多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像?性能特点性能特点Confocal七.荧光和透射光重叠图像观察和分析七.荧光和透射光重叠图像观察和分析用于观察和分析荧光信号在形态结构上的精确定位。用于观察和分析荧光信号在形态结构上的精确定位。?性能特点性能特点ConfocalLSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。八.三维重建和三维显示八.三维重建和三维显示?性能特点性能特点Confocal设定Z轴参数（厚度、步距）设定Z轴参数（厚度、步距）断层扫描断层扫描三维软件（数据重组）三维软件（数据重组）A Series of Image of xy-section Three Dimensional ImageObj:63.0/1.40 OIL Step:0.40 64-section八.八.三维重建三维重建和三维显示和三维显示?性能特点性能特点Confocal动画旋转法模拟荧光处理法动画旋转法模拟荧光处理法(Simulated Fluorescence Press,SFP)焦点扩展深度法焦点扩展深度法(extended depth of focus)双眼立体图对法双眼立体图对法八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示?性能特点性能特点Confocal模拟荧光处理法（模拟荧光处理法（SFP法）法）八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示?性能特点性能特点Confocal八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示模拟荧光处理法（模拟荧光处理法（SFP法）法）?性能特点性能特点Confocal八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示模拟荧光处理法（模拟荧光处理法（SFP法）法）?性能特点性能特点Confocal八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示模拟荧光处理法（模拟荧光处理法（SFP法）法）?性能特点性能特点ConfocalA Series of Image of xy-section Three Dimensional ImageObj:100/1.2NA W Step:0.50 34-section焦点扩展深度法焦点扩展深度法八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示?性能特点性能特点Confocal八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示焦点扩展深度法焦点扩展深度法?性能特点性能特点ConfocalSpirogyra crassaActin:Rhodamine-PhalloidinChloroplasts:Autofluorescence八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示焦点扩展深度法焦点扩展深度法?性能特点性能特点Confocal双眼立体图对法双眼立体图对法八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示?性能特点性能特点Confocal动画旋转法动画旋转法八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示?性能特点性能特点ConfocalDrosophila leg,FITC,projection Surface rendering动画旋转法动画旋转法八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示?性能特点性能特点ConfocalOne week old larvaeDAPI labelTwo Photon mode,Pulse length 1.2ps,Excitation 780 nm,Obj 20 x PL APO W,NA 0.5Total thickness:500 micrometerStereo Movie八.三维重建和八.三维重建和三维显示三维显示动画旋转法动画旋转法?性能特点性能特点Confocal原位杂交基因定位染色体鉴别检测特定DNA和RNA原位杂交基因定位染色体鉴别检测特定DNA和RNA优点:优点:1.观察同一平面以及各个层面的荧光杂交信号。2.提高激光强度、增加探测强度收集弱荧光杂交信号。3.对荧光杂交信号进行定位、定性和定量分析以及计算杂交点数。1.观察同一平面以及各个层面的荧光杂交信号。2.提高激光强度、增加探测强度收集弱荧光杂交信号。3.对荧光杂交信号进行定位、定性和定量分析以及计算杂交点数。九.深入观察原位杂交图像不同层面信息九.深入观察原位杂交图像不同层面信息?性能特点性能特点Confocal原位杂交+免疫组织化学荧光双标记（基因定位）原位杂交+免疫组织化学荧光双标记（基因定位）A.ERCC6 mRNA/FITC (in situ hybridization)B.GFAP/Rhodamine(immunohistochemistry)C.Expression of ERCC6 mRNA in Gliocyte(yellow)九.深入观察原位杂交图像不同层面信息九.深入观察原位杂交图像不同层面信息?性能特点性能特点Confocal?平滑处理、降低本底、增强反差?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal?平滑处理、降低本底、增强反差?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入?图像中标尺、箭头和文字等的插入十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?平滑处理、降低本底、增强反差?定性、定位、定量及动态测量和分析?多通道荧光不同强度测量和分析?测量细胞的面积和平均荧光强度等?图像的分屏、重叠、拼接等?图像中标尺、箭头和文字等的插入?图像中标尺、箭头和文字等的插入十.图像处理和分析十.图像处理和分析?性能特点性能特点Confocal样品样品其它活组织：活的脑片固定组织：1.石蜡切片、冰冻切片2.切片厚度培养细胞：1.活细胞、固定细胞2.活细胞的装置其它活组织：活的脑片固定组织：1.石蜡切片、冰冻切片2.切片厚度培养细胞：1.活细胞、固定细胞2.活细胞的装置染色染色免疫荧光组织化学染色法微量注射法（微量电泳法等）免疫组化和原位杂交双标记转染技术免疫荧光组织化学染色法微量注射法（微量电泳法等）免疫组化和原位杂交双标记转染技术?样品制作和系统操作样品制作和系统操作Confocal开机：显微镜开机：显微镜扫描装置扫描装置计算机系统计算机系统风扇和激光器观察：选择滤光片、物镜倍数(Zoom)和扫描区域扫描：预扫描(风扇和激光器观察：选择滤光片、物镜倍数(Zoom)和扫描区域扫描：预扫描(z-step,PMT)断层扫描处理：储存图像、后期处理和图像分析)断层扫描处理：储存图像、后期处理和图像分析系统操作系统操作?样品制作和系统操作样品制作和系统操作Confocal实验中需要注意的几个问题实验中需要注意的几个问题1.荧光探针的选择：确定用什么染料染色,检查其光谱性质,激发波长,发射波长,确信手头有相匹配的CONFOCAL的激光器.参考:1.荧光探针的选择：确定用什么染料染色,检查其光谱性质,激发波长,发射波长,确信手头有相匹配的CONFOCAL的激光器.参考:fluorescence.bio-2.2.Multi-labelling：合适的激光波长、不重叠的发射光谱3.细胞贴壁4.样品负载5.扫描参数：合适的激光波长、不重叠的发射光谱3.细胞贴壁4.样品负载5.扫描参数：Laser、PMT、z-step、Section6.实验室环境保护和仪器清洁保养6.实验室环境保护和仪器清洁保养?样品制作和系统操作样品制作和系统操作ConfocalYi-Ping Yan,neuroreport,1998,9(3):441 446National Key Laboratory of Medical Neurobiology and Department of Neurobiology,Shanghai Medical UniversityLeica TCS-CLSM?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalA.A Series of Image of xy-SectionB.Three Dimensional Image(Proj.)A protrusor hypoglossal motoneuron stained intracellularly by Lucifer Yellow.Obj:10.0/0.45 OILStep:4.0 39-sectionCLSMhypoglossal motoneuron/Lucifer Yellow5-HT terminals/RhodamineSerial rotations at 10 degreeObj:63.0/1.40 OILAB?Confocal 技术的作用技术的作用Leica TCS-CLSMYan Li,Shanghai Instiute of Brain ResearchChinese Academy of SciencesConfocalCA1 pyramidal cell in rat hippocampal slice labeled by Fluo-3(AM)in situ.Obj:63.0/1.4OILCultured Vessel Endothelial Cell of Human Umbilicus(Fluo-3).Obj:40/1.30 OIL Zoom:2.1Liu-Hua WangActa Physiologica Sinica,1998,50(3):355 358State Key Laboratory of Medical Neurobiology,Shanghai MedicalCollege of Fudan University Zhong-Xiang Yao,第三军医大学学报第三军医大学学报,1998,20(3):205 207Department of Histology and Embryology,Third Military UniversityLeica TCS-CLSM?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalAnalysis of surface expression of DOR in NG108-15 cells.12CA5/FITC Obj:100 x/1.2NA WZhao Jing,BBRC,1997,283(1):71 76State Key Laboratory of Medical Neurobiology,Shanghai Medical College of Fudan University Leica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalCCR5(A)/CXCR4(B),12CA5/FITC TCS/Texas RedABJian Zhao,J.Exp.Med.1999,109(1):101111,Shanghai Institute of Cell Biology and Shanghai Research Center of Life Sciences,Chinese Academy of SciencesColocalization of TCS with Chemokine receptors on HEK293 cells surface.Leica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalYoYo-1 iodide stains nuclei in paraffin tissue section.Cy3 stains HCV antigen.HCV antigen express extensively around of HCC(Obj:10 x)HCV antigen express in nucleus and cytoplasma of HCC.(Obj:100 x)Wang-Hai Zhang,Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry,1999,8(2):211 215Division of Pathology,Shanghai Medical College of Fudan UniversityLeica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalThree-dimensional view of spindle cell HCC(A)and tubular adenocarcinoma of HCC(B).YOYO-1 iodideObj:50 x/0.75NA WWang-Hai Zhang,World J Gastroentero 2000,6(3):344 347Division of Pathology,Shanghai Medical College of Fudan UniversityLeica TCS-NTAB?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalFei Sun,P.S.E.B.M.2000;223:295 301Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Obstetric and Gynecologic Hospital,Fudan UniversityNeuropeptide Y/FITCEstrogen receptor/TRITCExpression of estrogen receptor in neurons of rat brain(yellow).Obj:50 x/0.75NA WLeica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalGFAP positive cells(Mller cells)/FITCGABA transporter/Texas RedExpression of GABA Transporter subtype2 on Bullfrog Retinal Mller Cells.Obj:50 x/0.75NA WJing-Wei Zhao,GLIA 2000;31:104 117Shanghai Institute of Physiology,CASLeica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalEAAT1/FITCGFAP/RhodamineObj:50 x/0.75NA W ContralateralIpsilateralF.TAO,Neuroscience,2001,102(3):503 513National Key Laboratory of Medical Neurobiology,Shanghai Medical College of Fudan UniversityLeica TCS-NTExpression of EAAT1 in astrocytes of rat cerebral cortex(yellow).Expression of EAAT1 in neurons(green)and astrocytes(yellow)after hypoxia-ischemia.?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalVEGF/FITC GFAP/RhodamineNSE/FITC VEGF/RhodamineZeng-Jin Yang,Wei-Li Bao,Journal of Neuroscience Research 2002,70:140 149 National Key Laboratory of Medical Neurobiology,Shanghai Medical College of Fudan UniversityLeica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalBCDFGHJian-Yi Xu,Neuroscience,2003,118:59 67National Key Laboratory of MedicalNeurobiology,Shanghai Medical College,Fudan UniversityLeica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalJia-Li Li,Journal of Biological Chemistry,2003,278(32):3021930226National Laboratory of Medical Neurobiology,Shanghai Medical College,Fudan UniversityLeica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalLeica TCS-NTShuiyun Lan,FEBS Letters,2003,554:289294Key Laboratory of Medical Molecular Virology,Shanghai Medical College,Fudan University?Confocal 技术的作用技术的作用Confocal?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalbFGF/FITC nuclei acid/Radiant Red GFAP/Cy5Expression of bFGF-like IR in frontoparietal cortex.Obj:50 x/0.75NA WWei OuYang,ACUP.&ELECTRO-THERAP.RES,1999,24:1 10State Key Laboratory of MedicalNeurobiology,Shanghai Medical Collegeof Fudan UniversityLeica TCS-NT?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalF-actin/PhalloidinTublin/Texas RedGFAP/RhodamineNeuN/FITCXPB/Cy5Hoechst 32258TRS/DTAFINS/Cy3DAPILeica TCS-SP2?Confocal 技术的作用技术的作用Confocal123 Blood Vessal WallIntima(I),Media(M),Intimal Elastic Lamina(IEL)Obj:10 x/0.3NA dryWang-De Dai,Zhongshan Hospital,Fudan UniversityAortic Wall in the AnimalModel of Takayasus Arteritis.Obj:50 x/0.75NA WZhi-Peng Hong,Zhongshan Hospital,Fudan UniversityHuman Paralacrimal GlandObj:16x/0.5NA IMMHong-Ping ChuiEye、Ear、Nose&Throa Hospital,Fudan UniversityAutofluorescence?Confocal 技术的作用技术的作用ConfocalABJian-Xin XieDepartment of Anatomy,ShanghaiMedical College of Fudan UniversityState Key Laboratory of Medical Neurobiology,Shanghai Medical College of Fudan UniversityObj:5x/0.1NA Obj:50 x/0.75NA W Zoom:2.0Obj:5x/0.1NA Obj:50 x/0.75NA W Zoom:2.0Mucosa Layer of Intestinal Tract Vessel in Intestinal wallIntestinal Mucosa of HumanAutofluorescence?Confocal 技术的作用技术的作用Confocal?对科研项目的支撑作用对科研项目的支撑作用国家973项目国家863项目国家自然科学基金重点项