氯氟醚菌唑对西红花球茎腐烂病原菌尖孢镰刀菌的生物活性.pdf
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1、研究论文doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0033氯氟醚菌唑对西红花球茎腐烂病原菌尖孢镰刀菌的生物活性邱谷丰#,1,任廷丹#,1,王强2,张传清*,1(1.浙江农林大学现代农学院,杭州311300;2.建德市三都西红花专业合作社,浙江建德311605)摘 要:球茎腐烂病是“新浙八味”浙产中药植物西红花上最为严重的病害。本研究采用菌丝生长速率法测定了 82 株西红花球茎腐烂病菌尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 对新型甾醇脱甲基酶抑制剂(DMIs)氯氟醚菌唑的敏感性,评价了其对尖孢镰刀菌生长、产孢、萌发和细胞膜透性的影响,同时测定了氯氟醚菌唑对尖
2、孢镰刀菌的保护和治疗作用。结果表明:氯氟醚菌唑对尖孢镰刀菌菌丝生长的 EC50值范围在 0.1822.491g/mL 之间,平均 EC50值为(0.8380.438)g/mL,敏感性频率分布符合正态分布。氯氟醚菌唑对尖孢镰刀菌的菌丝生长和产孢都有显著的抑制作用,对病菌细胞膜表现显著的破坏作用。此外,氯氟醚菌唑对西红花球茎腐烂病的保护作用要强于治疗作用。本研究结果可为生产上有效防治西红花球茎腐烂病提供依据。关键词:氯氟醚菌唑;尖孢镰刀菌;敏感性;西红花球茎腐烂病;防治效果中图分类号:S481.4;S481.9文献标志码:ABioactivity of mefentrifluconazole ag
3、ainst Fusarium oxysporumcausing saffron corm rotQIUGufeng#,1,RENTingdan#,1,WANGQiang2,ZHANGChuanqing*,1(1.College of Advanced Agricultural Sciences,Zhejiang Agricultural and Forestry University,Hangzhou 311300,China;2.Corm Professional Cooperative of Jiande,Jiande 311605,Zhejiang Province,China)Abst
4、ract:Cormrotisthemostseriousdiseaseonsaffron,aChinesemedicalherbbelongingtoNewZheBaWei.Thesensitivityof82isolatesofthepathogenicFusarium oxysporumtoanovelsteroldemethylaseinhibitor(DMI)mefentrifluconazolewasdeterminedusingthemycelialgrowthratemethodandtheeffectsofmefentrifluconazoleonthegrowth,sporu
5、lation,sporegermination,andcellmembranepermeabilityofF.oxysporumwereinvestigated.ThemostandleastsensitivestrainsinthepopulationwereusedtodeterminethebiologicalactivityofmefentrifluconazoleagainstF.oxysporumandtheprotectiveandcurativeefficacyweredetermined.TheresultsshowedthattheEC50valuesofmefentrif
6、luconazoleinhibitingmycelialgrowthofF.oxysporumrangedfrom0.182g/mLto2.491g/mL,andtheaverageEC50valuewas(0.8380.438)g/mL.Thesensitivityfrequencydistribution收稿日期:2022-11-21;录用日期:2023-04-10;网络首发日期:2023-04-19.Received:November21,2022;Accepted:April10,2023;Published online:April19,2023.URL:https:/doi.org
7、/10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0033http:/ Journal of Pesticide ScienceE-mail:conformstonormaldistribution.MefentrifluconazolesignificantlydecreasedmycelialgrowthandsporulationofF.oxysporum.TheconductivitytestofmyceliademonstratedthatmefentrifluconazoledamagedcellmembraneofF.oxysporumresultinginelec
8、trolyteleakage.Inaddition,theprotectiveefficacyofmefentrifluconazoleagainstsaffroncormrotwassuperiortothecurativeefficacy.Theseresultsprovideatheoreticalbasisfortheeffectivecontrolofsaffroncormrotinproduction.Keywords:mefentrifluconazole;Fusarium oxysporum;sensitivity;saffroncormrot;controlefficacy西
9、红花 Crocus sativusL.是鸢尾科番红花属的一种多年生草本植物,是浙江省“新浙八味”之一1,具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神、预防心血管疾病等效果2。西红花起源于伊朗、西班牙、希腊等地中海国家3。在中国,杭州建德是西红花种植栽培的发源地,被称为“西红花之乡”。西红花球茎腐烂病是由尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum引起的真菌病害,也是西红花上最重要的病害4。在球茎储存期和种植期,病球率高达 30%70%,严重降低了西红花产量和花丝品质,造成巨大的经济损失5。目前尚未见有关药剂可以有效防治西红花球茎腐烂病的系统研究报道。氯氟醚菌唑(mefentrifluconazole)
10、是巴斯夫公司于 2016 年上市的第 1 个新型脱甲基抑制剂(demethylationinhibitors,DMIs)6。DMIs 的作用靶点为病原菌细胞膜甾醇生物合成过程中的 C14-脱甲基酶6,氯氟醚菌唑分子结构中的异丙醇基团,能够与该作用位点更加紧密地结合7。据报道,氯氟醚菌唑能有效防治多种真菌病害,如:香蕉叶斑病8、小麦锈病以及由壳针孢菌引起的病害、由柱隔孢菌引起的大麦病害、水稻纹枯病、稻瘟病、苹果黑星病、核果树和杏树花腐病以及褐腐病9-10、葡萄白粉病、马铃薯早疫病等7。另外,相比于传统的三唑类杀菌剂,氯氟醚菌唑对于生态环境的风险更低11-12。目前有关氯氟醚菌唑防治镰刀菌病害的研
11、究甚少。仅刘亚慧等报道,氯氟醚菌唑对不同镰刀菌菌丝生长、孢子萌发及细胞膜通透性表现出不同的生物活性13,但对于西红花尖孢镰刀菌的生物活性尚不清楚。因此,本研究建立了西红花尖孢镰刀菌对氯氟醚菌唑的敏感性基线,并分析了氯氟醚菌唑对该病菌菌丝生长、孢子萌发及产孢量的影响;同时测定了氯氟醚菌唑对尖孢镰刀菌的细胞膜通透性的影响,评估了氯氟醚菌唑对西红花球茎的保护和治疗作用,以期为氯氟醚菌唑的科学使用及合理应用于西红花球茎腐烂病的防治提供依据。1 材料与方法 1.1 供试材料1.1.1供试菌株2021 年从浙江省杭州市西红花种植基地采集了 100 颗腐烂的西红花球茎。采用组织分离法14-15分离得到 82
12、 株病原菌,单孢分离纯化后通过综合形态特征及基于 Tef-1 的系统发育分析鉴定为尖孢镰刀菌 F.oxysporum,在 PDA斜面平板中于4保存,使用前在PDA平板上活化。1.1.2供试药剂97%氯氟醚菌唑原药和 400g/L氯氟醚菌唑悬浮剂(mefentrifluconazole400g/LSC),由巴斯夫股份公司提供。原药用甲醇溶解,配制成40mg/mL的母液,于 4 保存,备用。1.1.3供试培养基马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:称取去皮马铃薯 200g,煮沸后过滤,加入20g 葡萄糖和 20g 琼脂,加水定容至 1L,121高压灭菌锅灭菌,备用。水琼脂培养基(WA)培养基:20g
13、琼脂,无菌水定容至 1L。马铃薯葡萄糖(PDB)液体培养基:马铃薯 200g,20g 葡萄糖,加水定容至 1L。1.2 仪器设备BJ-2CD 超净工作台,上海博讯实业有限公司;XT5107-IM250 霉菌培养箱,杭州雪中炭恒温技术有限公司;MLS-3781L-PC 高压蒸汽灭菌锅,松下健康医疗器械株式会社;Scope.A1 型光学显微镜,德国CarlZeiss 公司;ZWY-2102C 恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;DDS-307A 电导率仪,上海仪电科学仪器股份有限公司。1.3 试验方法1.3.1尖孢镰刀菌对氯氟醚菌唑的敏感性测定采用菌丝生长速率法16-18测定。在灭菌的
14、PDA培养基中加入氯氟醚菌唑药液,使其质量浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1 和 2g/mL13。将尖孢镰刀菌菌株在 PDA平板上预培养 5d 后,从菌No.4邱谷丰等:氯氟醚菌唑对西红花球茎腐烂病原菌尖孢镰刀菌的生物活性851落边缘制取直径为 5mm 的菌饼,转接至上述含不同质量浓度氯氟醚菌唑的 PDA 平板中央。以不含药剂的 PDA 板作为对照。每处理重复 3 次。在25 恒温培养箱黑暗培养 6d 后,采用十字交叉法测量各处理的菌落直径,按公式(1)计算各药剂处理对菌丝生长的抑制率(Im)。Im/%=(DCDT)/(DCD0)100(1)式中:DC为对照组菌丝生长直径,cm;D
15、T为处理组菌丝生长直径,cm;D0为菌饼直径,cm。利用 SPSS22.0 软件,通过药剂质量浓度的对数值(x)与抑制率的几率值(y)之间的线性回归关系,求出毒力回归方程、EC50值及相关系数 r。1.3.2氯氟醚菌唑对尖孢镰刀菌菌丝生长及产孢量影响的评价随机选取 10 株尖孢镰刀菌分别在PDA 平板上进行黑暗培养。5d 后从菌落边缘取直径为 5mm 的菌饼,转移至含 0.125、0.5 和 2g/mL氯氟醚菌唑的 PDA 平板上19,以不含药剂的 PDA平板作为对照,每处理 3 个重复。培养 6d 后,采用十字交叉法测量菌落直径,按公式(1)计算菌丝生长抑制率(Im)。参照宋化稳等20的方法
16、制备孢子悬浮液。将供试菌株在 PDA 平板上活化,5d 后从菌落边缘打取直径为 5mm 的菌饼,放置在药剂质量浓度为 0.125、0.5 和 2g/mL 氯氟醚菌唑的 PDA 平板上培养,以不含药剂的 PDA 平板作为对照。培养6d 后,加入 5mLddH2O,用涂棒将菌丝表面的孢子刮下,用灭菌纱布过滤到三角锥形瓶中,加ddH2O 定容至 10mL,充分混匀用血球计数板采用五点取样法统计孢子数量,每处理重复 3 次。按公式(2)和(3)计算各药剂处理下的产孢量(S)及产孢量抑制率(Is)。S/(个/mL)=n/(165)400104d(2)式中:n 为 80 个小方格中孢子个数;d 为稀释倍数
17、。Is/%=(ScSs)/Sc100(3)式中:Sc为对照组菌株的产孢量;Ss为处理组菌株的产孢量。1.3.3氯氟醚菌唑对尖孢镰刀菌孢子萌发影响的测定随机选取 2 株尖孢镰刀菌在 PDA 平板上活化,5d 后从菌落边缘打取直径为 5mm 的菌饼,分别置于药剂质量浓度为 0.125、0.5 和 2g/mL氯氟醚菌唑的 PDA 平板上培养,以不含药剂的PDA 平板作为对照21。培养 6d 后,用无菌水分别洗下供试菌株的分生孢子,用灭菌纱布过滤,充分混匀,制得孢子悬浮液,用血球计数板计数观察,将孢子悬浮液浓度调至 106个/mL。取 100L孢子悬浮液均匀涂布于含 0.125、0.5 和 2g/mL
18、氯氟醚菌唑的 WA 培养基平板上,于 25 下黑暗培养。分别于 2、4、6、8、10h 镜检观察孢子萌发情况,每重复检查孢子总数不少于 200 个,以芽管长度达到孢子短直径的 1/2 视为萌发,记录孢子总数及孢子萌发数。每处理重复 3 次,以不含药剂的 WA 板为空白对照20-21。孢子萌发率(RG)按公式(4)计算。RG/%=(NG/NT)100(4)式中:NG为孢子萌发数;NT为孢子总数。1.3.4氯氟醚菌唑对尖孢镰刀菌细胞膜通透性影响的测定随机选取 4 株尖孢镰刀菌在 PDA 上黑暗培养 5d 后,在菌落边缘打取直径为 5mm 的菌饼,接种至灭菌的 250mLPDB 培养基中,每瓶接种
19、5 个菌饼,摇培 5d(28、175r/min)后,经灭菌滤纸过滤冲洗,收集菌丝。称取 1.0g 洗净的菌丝,放入盛有 40mL 无菌水的离心管中,悬浮,用氯氟醚菌唑处理,设置质量浓度梯度为0.125、0.25、0.5、1、2g/mL,以滴加等体积的无菌水作为对照20-21,每处理重复 3 次。继续摇培 0、2、4、6、8、16h 后,收集菌液,在 25、5000r/min 下高速离心 10min,取上清液测定电导率。1.3.5氯氟醚菌唑对西红花球茎腐烂病的保护治疗作用评价随机选取 2 株尖孢镰刀菌,用1.3.3 节方法制备,获得各菌株浓度为 106个/mL的孢子悬浮液,备用。400g/L 氯
20、氟醚菌唑悬浮剂用无菌水配制成有效成分质量浓度梯度为 0.125、0.5、2g/mL,备用。挑选健康的西红花球茎,去皮后用无菌水洗净后,晾干,分有伤和无伤处理。治疗作用测定:在西红花球茎左右两侧均滴加 20L 孢子悬浮液,以滴加等体积的无菌水作为对照,置于 2512h 光暗交替的光照培养箱中保湿(相对湿度 80%)培养,24h 后每个球茎表面分别喷洒 0、0.125、0.5、2g/mL 的氯氟醚菌唑200L22。保护作用测定:在每个西红花球茎表面分别喷洒 0、0.125、0.5、2g/mL 的氯氟醚菌唑200L,置于 25 光暗 12h 交替的光照培养箱中保湿培养,24h 后每个球茎表面均滴加
21、20L852农药学学报Vol.25孢子悬浮液,以滴加等体积的无菌水作为对照23。每处理 3 个重复。7d 后根据分级标准24调查发病情况:0 级,无病斑;1 级,病斑面积占整个球茎面积的 5%以下;3 级,病斑面积占整个球茎面积的 5%20%;5 级,病斑面积占整个球茎面积的 21%50%;7 级,病斑面积占整个球茎面积的50%以上。按公式(5)和(6)计算各处理病情指数(ID)及防治效果(E)。ID=(NLL)/(NLMax)100(5)式中:NL为各级病球茎数;L 为相对级数值;N 为调查总球茎数;LMax最高病级。E/%=(IDcIDt)/IDc100(6)式中:IDc为对照组病情指数;
22、IDt为处理组病情指数。2 结果与分析 2.1 尖孢镰刀菌对氯氟醚菌唑的敏感性测定结果(图 1)显示,氯氟醚菌唑对供试的82 株尖孢镰刀菌的 EC50值分布在 0.1822.491g/mL之间,平均 EC50值为(0.8380.438)g/mL,敏感系数 Rf(最高 EC50值/最低 EC50值)为 13.69。对EC50值进行正态性分布 Kolmogorov-Smirnov 检验,显著性 P=0.190.05,表明 82 株供试菌株对氯氟醚菌唑的敏感性分布符合正态分布。同时,供试菌株对氯氟醚菌唑的敏感性频率分布呈现出一条连续的曲线。2.2 氯氟醚菌唑对西红花尖孢镰刀菌菌丝生长及产孢量的影响结
23、果(表 1)表明,氯氟醚菌唑对所测定菌株的菌丝生长有明显的抑制作用。0.125g/mL 氯氟醚菌唑对菌丝生长的抑制率较低,随着药剂质量浓度的增加,抑制率逐渐增强。对于产孢量,菌株 XHH14 在 0.125g/mL 下的抑制率仅为 1.58%,2g/mL 时抑制率也仅为 13.45%。对于其他菌株产孢量的抑制率也较低。表明氯氟醚菌唑对尖孢镰刀菌的菌丝生长的抑制作用较强。2.3 氯氟醚菌唑对西红花尖孢镰刀菌的孢子萌发的影响测定结果(图 2)表明:2h 时,各处理组的菌株孢子基本上均未萌发,与 CK 处理相比,孢子萌发率被显著抑制;随着时间的推移,各处理组的孢子逐渐萌发,且渐与 CK 无显著性差异
24、;到表 1 氯氟醚菌唑对尖孢镰刀菌的菌丝生长及产孢量的抑制作用Table 1 The inhibiting effect of mefentrifluconazole on mycelial growth and sporulation quantity of F.oxysporum尖孢镰刀菌F.oxysporum菌丝生长抑制率Inhibitionrateofmycelialgrowth/%产孢量抑制率Inhibitionrateofsporulation/%0.125g/mL0.5g/mL2g/mL0.125g/mL0.5g/mL2g/mLXHH143.41d50.00cd67.32b28.
25、83d32.58cd37.99deXHH1224.15bc37.77de61.92d18.05a21.12a33.00aXHH1341.61b50.83c71.39d24.55cd31.36cd40.66deXHH1425.61a39.51b64.03bc1.58b9.40c13.45bXHH2949.24e53.03g66.16b21.31d36.48d40.24eXHH4640.95cd50.50ef63.57a25.88d29.02cd32.98deXHH5320.95b36.19de60.32cd16.51bc21.64bc27.77bcXHH6230.97cd52.80h64.31d
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