聚嘧啶束结合蛋白2表达的增加与转基因SOD1＊G93A小鼠脊髓神经元死亡相关.pdf

*基金项目抚州市科技计划项目(FZS2021217)*作者简介周琦袁男袁汉族袁生于 1989 年 7 月袁江西省抚州市人袁医学博士袁研究方向院神经变性病遥*通信作者熊崇宇袁电话院0794-8563729袁E-mail:南 通 大 学 学 报 渊 医 学 版 冤Journal of Nantong University(Medical Sciences)2023 颐 43渊3冤DOI:10.16424/32-1807/r.2023.03.001引文格式院 周琦,熊崇宇.聚嘧啶束结合蛋白 2 表达的增加与转基因 SOD1*G93A 小鼠脊髓神经元死亡相关J.南通大学学报(医学版),2023,43(3)颐201-206.肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种神经退行性疾病，导致脑干、大脑皮层和脊髓中控制肌肉运动的神经元逐渐死亡1-2。目前，这种致命性的疾病还无有效的治疗方法。ALS 有家族性和散发性两种类型，其中家族性 ALS 占 5%10%，与多个基因突变有关，如 9 号染色体开放阅读框 723、超氧化物歧化酶 1(superoxide dismutase 1,SOD1)4和融合肉瘤5。ALS 的发病机制尚不清楚，但可能涉及谷氨酸兴奋毒性6、轴突运输缺陷7、自噬障碍8、氧化损伤9和神经炎症10等多种因素。ALS 患者的临床特征显示出依赖于个体运动神经元亚型的选择敏感性11。与 ALS 过程中脊髓、后脑和皮层中运动神经元亚型的逐渐破坏或丢失相反，中脑的动眼神经运动神经元通常在后期才会发生变化11-12。ALS 会导致大多数肌肉失去活动能力，但是眼睛和性器官的肌肉不受影响。这是因为控制这些肌肉的神经元比其他神经元更能抵抗病变13。而在同一类型的运动神经元中，也存在功能亚型的差异。聚嘧啶束结合蛋白 2 表达的增加与转基因 SOD1*G93A 小鼠脊髓神经元死亡相关*周琦*袁熊崇宇*(江西省抚州市第一人民医院神经内科袁抚州 344000)摘要目的院探讨聚嘧啶束结合蛋白 2(polypyrimidine tract binding protein 2,PTBP2)在肌萎缩侧索硬化症(amy鄄otrophic lateral sclerosis,ALS)发展中的作用及相关机制遥 方法院采用免疫荧光染色法和 Western Blot 分析检测野生型(wild type,WT)和转基因(transgenic,TG)(SOD1*G93A)小鼠脊髓中 PTBP2 的表达和分布袁分析 PTBP2 表达和分布与神经元细胞死亡之间的可能联系遥结果院在 ALS 的发病前尧发病和进展阶段袁PTBP2 在前角尧后角和中央管周围区域的表达和分布显著增加遥星形胶质细胞和小胶质细胞以及成体神经元表达 PTBP2 蛋白遥ALS 相关的神经元细胞死亡与 PTBP2 表达和分布的增加密切相关遥 表达 PTBP2 的神经元细胞在 ALS 进展过程中丢失遥 结论院PTBP2 在脊髓中的表达和分布变化可能与 ALS 的病因有关袁PTBP2 表达的增加与 ALS 中神经元细胞的丢失相关遥关键词肌萎缩性侧索硬化症曰聚嘧啶结合蛋白 2曰脊髓曰神经元死亡曰小鼠中图分类号R744.5文献标志码A文章编号1674-7887渊2023冤03-0201-06Increased polypyrimidine tract binding protein 2 distribution correlates with neuron death intransgenic SOD1*G93A mice spinal cord*ZHOU Qi*,XIONG Chongyu*(Department of Neurology,Fuzhou First People忆s Hospital,Jiangxi Province,Fuzhou 344000)AbstractObjective:To explore the role and related mechanisms of polypyrimidine tract binding protein 2(PTBP2)in thedevelopment of amyotrophic lateral sclerosis(ALS).Methods:Immunofluorescence and Western Blot analysis were used to detectthe expression and distribution of PTBP2 in the spinal cord of wild-type(WT)and transgenic(TG)(SOD1*G93A)mice,and toanalyze the possible relationship between PTBP2 expression and distribution and neuronal cell death.Results:The expressionand distribution of PTBP2 in the anterior horn,posterior horn,and periventricular region increased significantly during thepre-onset,onset,and progression stages of ALS.Astrocytes,microglia,and adult neurons expressed the PTBP2 protein.Theneuronal cell death associated with ALS was closely related to the increase in PTBP2 expression and distribution.Neuronalcells expressing PTBP2 were lost during the progression of ALS.Conclusion:The changes in the expression and distribution ofPTBP2 in the spinal cord may be related to the pathogenesis of ALS,and the increase in PTBP2 expression is associated withthe loss of neuronal cells in ALS.Key wordsamyotrophic lateral sclerosis;polypyrimidine tract binding protein 2;spinal cord;neuron death;mouse201窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊3冤然而，导致这种差异的分子机制仍不明确。因此，研究人员14-15利用基因表达谱分析了 ALS 小鼠模型中不同类型和亚型的运动神经元，发现了一些与 ALS相关的基因，如基质金属蛋白酶-9 和胰岛素样生长因子 2。但是，这些基因在人类 ALS 中是否也起作用还有待验证。除了基因表达水平的变化，RNA 剪接也是一种重要的遗传调控机制，可以影响神经系统中多种蛋白质的结构和功能16-18。RNA 剪接是由 RNA 结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)介导的过程，它们可以识别并结合到 RNA 分子上特定的序列。聚嘧啶束结合蛋白是一类 RBP，它们能与聚嘧啶束相互作用，并参与选择性剪接的调节。其中，聚嘧啶束结合蛋白 2(polypyrimidine tract binding protein 2,PTBP2)是一种特异性表达于神经系统的聚嘧啶束结合蛋白亚型，对神经元分化和成熟至关重要19-20。PTBP2 主要在分化后的神经细胞中表达，在巢蛋白阳性的神经元祖细胞中则表达很低或不表达。PTBP2 可以替代PTBP1，促进成人特异性外显子的剪接，并抑制胚胎特异性外显子的剪接，这对于胚胎大脑中神经元发育的转换非常重要21-22。目前关于 PTBP2 在 ALS 等神经退行性疾病中的作用报道很少。本研究拟利用野生型(wild type,WT)和转基因(transgenic,TG)(SOD1*G93A)小鼠检测PTBP2 在不同类型和亚型运动神经元中的表达和分布，并探讨其对 ALS 运动神经元死亡的影响。1材料和方法1.1动物和实验设计TG(SOD1*G93A)转基因小鼠 30 只，购自美国 Jackson 实验室，通过交配表达人G93A SOD1 的雄性小鼠和非转基因(C57BL/6 SJL)雌性小鼠维持，小鼠基因型鉴定的方法与本课题组前期研究23相同；WT 小鼠 30 只，购自美国 Jackson 实验室。分为 6 组，发病前：TG Pre-onset 组和 WT Pre-onset 组(日龄 5060 d)，发病期：TG Onset 组和 WTOnset 组(日龄 90100 d)，进展期：TG Progression 组和 WT Progression 组(日龄 120130 d)，每组 10 只小鼠。动物实验方案得到抚州市第一人民医院伦理审查委员会批准(批准号：FY20200911-09)。1.2免疫荧光染色和图像分析用 1伊PBS(pH7.4)水化脊髓切片，再用含 10%牛血清白蛋白的 1伊PBS(pH7.4)封闭。孵育一抗：PTBP2(A6054,ABclonal,1颐200)，神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)(ab4648,Abcam,1颐50)，神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein,NeuN)(MAB377,Millipore,1颐200)，电离钙结合适配器分子(1ionizedcalcium binding adapter molecule 1,IBA-1)(66827-1-lg,Proteintech,1颐100)和双皮质素(doublecortin,DCX)(sc-271390,Santa Cruz biotechnology Inc,1颐200)，4 益过夜。洗涤后，用含 0.2%曲拉通 X-100 的 1伊PBS 洗切片 6 次，10 min/次。再用二抗(Santa Cruz Biotech原nology Inc.)室温孵育 2 h，PBS-T 冲洗。用含 DAPI 的封固液封固载玻片，4 益保存。切片用数码相机拍照，并用 Photoshop 或 ImageJ 软件处理。按照已发表的方法24-25，对至少 100 个 PTBP2 阳性细胞进行编号和分析。切片的成像和采集用徕卡显微镜完成，并保持显微镜参数不变。1.3Western Blot采用戊巴比妥钠对小鼠进行安乐死，并从不同实验组中提取脊髓样品，保存在液氮中。样品经 RIPA 裂解液处理后，加入蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)和磷酸酶抑制剂(R0020,Solarbio)，12 000 r/min 离心 10 min。利用 BCA 法(Solarbio)测定总蛋白含量，并用 SDS-PAGE 进行电泳分离。将电泳后的蛋白转印到 PVDF 膜(Solarbio)上，用含甘氨酸、Tris 和甲醇的缓冲液在 100 V 电压下转印60 min。然后用含 TBS、Tween-20 和 5%牛奶的溶液封闭膜 1 h，并在 4 益条件下与 PTBP2 一抗(ABclonal,1颐2 000)和肌动蛋白一抗(Proteintech,1颐5 000)孵育过夜。洗涤后，孵育 HRP 标记的二抗 45 min，用 ECL试剂(Beyotime Biotech)进行化学发光检测。最后用Labworks 软件(Bio-Rad)分析 Western Blot 图像。1.4统计学方法使用 GraphPad Prism 5 软件进行统计分析。对于单个数据集的多次比较，采用单因素方差分析(ANOVA)；包含多个变量时，采用双因素方差分析，并进行相应的事后检验；两组数据比较采用双尾非配对 t 检验；PTBP2 阳性细胞数与神经细胞数的相关性采用 Pearson 相关性分析，P0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.1PTBP2 在 WT 和 TG 小鼠脊髓中的表达与分布采用免疫荧光染色法检测了 PTBP2 在颈段、胸段和腰段的前角(anterior horn,AH)、后角(posterior horn,PH)和中央管(central canal,CC)及其周围灰质的表达情况，结果显示，在颈段，发病前、发病期和进展期 3个阶段，TG 小鼠脊髓 AH、PH 和 CC 及其周围灰质中 PTBP2 阳性细胞的数量均显著高于 WT 小鼠(图1)；在胸段，发病前和发病期，TG 小鼠的 AH 和 PH202窑窑WT Pre-onsetTG Pre-onsetWT OnsetTG OnsetWT ProgressionTG Progression注：A，WT 和 TG 小鼠在疾病发展的 3 个阶段脊髓胸段的典型切片图，Bar=100 滋m；B，在 WT 和 TG 小鼠的各个疾病阶段，脊髓胸段 AH、PH 和 CC 区域中 PTBP2 阳性细胞的数量。每组 n=4 只小鼠，每只小鼠脊髓节段 n=4 张切片，*P0.05。图 2PTBP2 在脊髓胸段中的表达和定位胸段中 PTBP2 阳性细胞的数量明显高于 WT 小鼠，而在进展期则差异无统计学意义(图 2)；在发病前和进展期，TG 小鼠的 CC 周围 PTBP2 阳性细胞数量也明显高于 WT 小鼠，而在发病期差异无统计学意义(图 2)；在腰段，TG 小鼠在 3 个阶段的 AH、PH 和 CC 周围PTBP2 阳性细胞的数量均显著高于 WT 小鼠(图 3)。这些数据表明，TG 小鼠在不同时间点和不同部位的AH、PH、CC 及其周围灰质中 PTBP2 的表达和分布均有显著增加。注：A，WT 和 TG 小鼠在 ALS 疾病发展的 3 个阶段脊髓颈段的典型切片图，Bar=100 滋m；B，在 WT 和 TG 小鼠的各个疾病阶段，脊髓颈段 AH、PH 和 CC 区域中 PTBP2 阳性细胞的数量。每组 n=3 只小鼠，每只小鼠脊髓节段 n=3 张切片，*P0.05。图 1PTBP2 在脊髓颈段中的表达和定位B颈段WT Pre-onsetTG Pre-onsetWT OnsetTG OnsetWT ProgressionTG ProgressionCCPHAHWT Pre-onsetTG Pre-onsetWT OnsetTG OnsetWT ProgressionTG ProgressionCCPHAH*5004003002001000AAWT Pre-onsetTG Pre-onsetWT OnsetTG OnsetWT ProgressionTG ProgressionCCPHAH*ns*CCPHAHB5004003002001000周琦，等.聚嘧啶束结合蛋白 2 表达的增加与转基因 SOD1*G93A 小鼠脊髓神经元死亡相关2.2PTBP2 在 WT 和 TG 小鼠神经细胞中的不同时空分布为检测 PTBP2 蛋白在星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元及神经元前体细胞中的表达情况，分别使用 GFAP、IBA-1、NeuN 和 DCX 这些细胞特异203窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊3冤注：A，WT 和 TG 小鼠在疾病发展的 3 个阶段脊髓腰段的典型切片图，Bar=100 滋m；B，在 WT 和 TG 小鼠的各个疾病阶段，脊髓腰段 AH、PH 和 CC 区域中 PTBP2 阳性细胞的数量。每组 n=3 只小鼠，每只小鼠脊髓节段 n=3 张切片，*P0.05。图 3PTBP2 在脊髓腰段中的表达及定位注：A，脊髓 AH 中 PTBP2 与 GFAP 双重染色图；B，脊髓周围CC 与 PTBP2 和 IBA-1 双重染色图；C，脊髓 AH 中 PTBP2 与DCX 双重染色图；D，脊髓周围 CC 与 PTBP2 和 NeuN 双重染色图。Bar=100 滋m。图 4PTBP2 在多种神经细胞中的表达和定位ABCDCCAHDAPI+PTBP2+NeuNAHCCDAPINeuNPTBP2PTBP2DAPIDAPIDAPIPTBP2PTBP2DAPI+DCX+PTBP2DCXDAPI+PTBP2+IBA-1IBA-1DAPI+PTBP2+GFAPGFAP腰段WT Pre-onsetTG Pre-onsetWT OnsetTG OnsetWT ProgressionCCPHAHATG ProgressionWT Pre-onsetTG Pre-onsetWT OnsetTG OnsetWT ProgressionTG ProgressionCCPHAH*B6004002000性的生物标志物进行免疫荧光双重染色(图 4)。结果显示，PTBP2 蛋白在这些细胞类型中均有分布，尤其是在中间神经元中，PTBP2 与 DCX 有较高的共定位率，提示 PTBP2 可能参与调控神经元的分化和发育。在 WT 和 TG 小鼠的各种神经细胞或发育阶段，PTBP2 的表达水平或分布模式差异无统计学意义。2.3PTBP2 的表达与 WT 和 TG 小鼠神经细胞死亡之间的关系随着脊髓颈段、胸段和腰段神经元数量的减少，PTBP2 阳性细胞的数量相应增加(图 5A)。在 TG 小鼠的各个脊髓节段中，神经元的丢失与PTBP2 阳性细胞的增加呈正相关(图 5BD)，表明脊髓神经元的丢失与 PTBP2 表达的改变密切相关。为了直观地观察 PTBP2 阳性运动神经元的差异表达，对 WT 和 TG ALS 小鼠颈脊髓 AH 的 PTBP2 和 NeuN进行了免疫荧光双重染色。结果再次证实，TG 进展组小鼠颈段脊髓中 PTBP2 阳性运动神经元的数量显著减少(P0.05)(图 5EF)，说明表达 PTBP2 的运动神经元更容易丢失。上述结果提示 PTBP2 分布升高可能与 ALS 中神经元的死亡有关。2.4ALS 进展过程中 WT 和 TG 小鼠脊髓中 PTBP2的表达脊髓中 PTBP2 的相对蛋白质水平检测结果显示，与 WT 小鼠相比，随着 ALS 疾病的进展，TG小鼠中的 PTBP2 表达显著升高(图 6)。3讨论PTBP2 是一种能够调节 RNA 剪接的蛋白质，主要在神经系统中表达，参与神经发育和功能的调控22,26-27。PTBP2 能够与编码细胞增殖和肌动蛋白细胞骨架相关基因 mRNA 上的多嘧啶序列结合，影响它们的剪接选择28。本研究发现，在 ALS 小鼠模型中，随着疾病的进展，脊髓运动神经元中 PTBP2 的204窑窑表达增加，这可能导致神经元的损伤和死亡。然而，PTBP2 在整个中枢神经系统或某些神经元亚群中的缺失也会导致神经元的成熟和存活受损，以及神经元凋亡的增加21,28，这表明 PTBP2 在神经发育中具有复杂的双重作用。在 ALS 状态下，PTBP2 的过度表达可能与运动神经元死亡相关。因此，PTBP2 可能是ALS 发病过程中运动神经元丢失的一个重要因素。神经祖细胞是能够分化成神经元的细胞，它们在 PTBP2 这种蛋白质的调节下，可以变成不同类型的神经元。PTBP2 还可以影响巢蛋白和 TuJ 这两种神经元的标志物。巢蛋白可以帮助神经元延伸出突触，而 TuJ 是神经元分裂后的第一个迹象29。成人大脑里，PTBP2 的含量很低，甚至没有。但是，一些成人神经元前体细胞还是存在于血管周围和齿状回的边缘。研究30发现 PTBP2 在大脑中的表达会随着神经元的发育而变化。在神经元分化的早期，PTBP2 会替代 PTBP1 来调节剪接；在神经元成熟的后期，PTBP2的表达会降低。本研究结果表明，无论是 DCX 在内神经元前体细胞，还是成熟的神经元，都有 PTBP2的存在。而且，还发现 ALS 小鼠的运动神经元缺乏PTBP2 的表达。这些发现说明 PTBP2 可能与 ALS 相关的神经元死亡有关。ALS 会导致神经元在不同区域和程度上受损。这种差异可能与疾病在特定区域激活了某些基因有关。例如，在 SOD1*G93A 小鼠模型中，所有细胞都含有等量的变异 SOD1 和肌动蛋白31。本研究发现，在 ALS 进展过程中，TG 小鼠脊髓颈部 AH 的 PTBP2阳性运动神经元明显少于 WT 小鼠，这提示 PTBP2可能是这种小鼠模型中运动神经元死亡的一个指标。揭示这种细胞特异性损伤的分子机制，以及PTBP2 是否与运动神经元的兴奋性下降相关，对于理解 ALS 非常重要。本研究发现，PTBP2 在脊髓中的分布和表达水平都有所升高，这可能与 ALS 的发病机制有关。PTBP2 不仅在成熟的神经元中存在，还在星形胶质细胞和小胶质细胞中有表达，说明它在调控神经元分化方面发挥着重要作用。此外，PTBP2 分布的改变与ALS 小鼠神经细胞的减少有关。特别是，表达 PTBP2的运动神经元在 ALS 小鼠中更容易丢失。这些研究结果提示，PTBP2 是一个潜在的 ALS 治疗靶点，并揭示了导致 ALS 患者运动神经元易损伤的特殊机制。参考文献1ROWLAND L P,SHNEIDER N A.Amyotrophic lateralsclerosisJ.N Engl J Med,2001,344(22):1688-1700.2KIERNAN M C,VUCIC S,CHEAH B C,et al.Amyotrophiclateral sclerosisJ.Lancet,2011,377(9769):942-955.3MAJOUNIE E,RENTON A E,MOK K,et al.Frequency ofthe C9orf72 hexanucleotide repeat expansion in patientswithamyotrophiclateralsclerosisandfrontotemporaldementia:a cross-sectional studyJ.Lancet Neurol,2012,11(4):323-330.4ROSEN D.Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase geneare associated with familial amyotrophic lateral sclerosisJ.Nature,1993,364(6435):362.5VANCE C,ROGELJ B,HORTOBA魣GYI T,et al.Muta鄄注：A，在疾病的不同阶段，TG 和 WT 小鼠脊髓腰段中 PTBP2的免疫蛋白质印迹图；B，PTBP2 蛋白相对表达水平分析。每组 n=4 只小鼠，*P0.05。图 6ALS 不同阶段 WT 和 TG 小鼠脊髓中 PTBP2 蛋白表达ABWT Pre-onsetTG Pre-onsetWT OnsetTG OnsetWT ProgressionTG ProgressionPTBP2茁-actin57 ku42 ku0.80.60.40.20.0*注：A，WT 小鼠和 TG ALS 小鼠不同脊髓节段和疾病阶段神经细胞和 PTBP2 阳性细胞数的动态变化图；BD，WT 和 TGALS 小鼠的脊髓颈(B)、胸(C)、腰(D)段 PTBP2 阳性细胞数与神经细胞数的相关图；E，进展期 WT 和 TG 小鼠的脊髓颈段AH 中 NeuN(绿色)和 PTBP2(红色)的双重免疫染色图，Bar=100 滋m；F，WT 和 TG 小鼠在进展期脊髓颈段 AH 中 PTBP2阳性运动神经元的表达水平，每组 n=3 只小鼠，每只小鼠脊髓节段 n=3 张切片，*P0.05。图 5神经细胞死亡和 PTBP2 的表达和分布CABDEF1 5001 0005000颈段 PTBP2 细胞胸段 PTBP2 细胞腰段 PTBP2 细胞颈段神经细胞胸段神经细胞腰段神经细胞R2=0.831 1,P=0.000 6R2=0.692 4,P=0.005 5R2=0.549 4,P=0.002 51 0008006004002000颈段PTBP2 细胞数胸段PTBP2 细胞数腰段PTBP2 细胞数0500 1 000 1 5008006004002000800600400200005001 000 1 50005001 000 1 500WT ProgressionTG ProgressionNeuN+PTBP2NeuN+PTBP20.80.60.40.20.0*100 滋m100 滋m周琦，等.聚嘧啶束结合蛋白 2 表达的增加与转基因 SOD1*G93A 小鼠脊髓神经元死亡相关205窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊3冤tions in FUS,an RNA processing protein,cause familialamyotrophic lateral sclerosis type 6J.Science,2009,323(5918):1208-1211.6ROTHSTEIN J D,MARTIN L J,KUNCL R W.Decreasedglutamate transport by the brain and spinal cord in amy鄄otrophic lateral sclerosisJ.N Engl J Med,1992,326(22):1464-1468.7ZHANG B,TU P,ABTAHIAN F,et al.Neurofilaments andorthograde transport are reduced in 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