基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联.pdf
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1、兰州大学学报(自然科学版),2 0 2 3,59(3)/6 月Journal of Lanzhou University(Natural Sciences),2023,59(3)/June基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联汪海锋,王浩浩,滕理送1.宁波市北仑区人民医院(浙江大学医学院附属第一医院北仑分院)肿瘤外科,浙江宁波3158 0 02.浙江大学医学院附属第一医院完肿瘤外科,杭州310 0 0 3摘要:通过胃腺癌肺转移模型确定SPINT3与胃癌转移之间的相关性.结果表明,SPINT3sgRNA在胃腺癌肺部转移中的表达均为阳性;SPINT3的表达与转化生长因子1(TGF
2、1)的分泌密切相关.检测SPINT3与肿瘤细胞的调亡、增殖、迁移、体内转移能力和肿瘤相关通路的关联,SPINT3在MKN-45细胞中的过表达能够促进肿瘤细胞的调亡,抑制增殖与迁移.SPINT3的抑制促进了MKN-45的体内转移能力,SPINT3的表达特异性的调节了TGF1通路.通过药物筛选确定了SPINT3的低表达能够被阿帕替尼和SB431542所逆转,这两种药物能够促进MKN-45SPINT3shRNA的调亡,阻断体内转移.关键词:TGF1结合通路;SPINT3;胃腺癌;肿瘤转移中图分类号:R735.2文献标识码:A文章编号:0 455-2 0 59(2 0 2 3)0 3-0 40 6-0
3、 9D0I:10.13885/j.issn.0455-2059.2023.03.016Association between SPINT3 and gastric adenocarcinomametastasis was determined by library screeningWANG Hai-feng,WANG Hao-hao,TENG Li-song?1.Department of Surgical Oncology,the Peoples Hospital of Beilun District,Beilun Branch Hospital of theFirst Affiliate
4、d Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Ningbo 315800,Zhejiang,China2.Department of Surgical Oncology,the First Affiliated Hospital,Zhejiang University School ofMedicine,Hangzhou 310003,ChinaAbstract:A correlation between SPINT3 and gastric cancer metastasis was determined via the lung me-
5、tastasis model of gastric adenocarcinoma,the expression of SPINT3 sgRNA was positive in lung metas-tasis nodules and the expression of SPINT3 was closely related to the secretion of TGF1.The relation-ship was detected between SPINT3 and apoptosis,proliferation,migration,in vivo metastasis and tumorr
6、elated pathways.The results showed that the overexpression of SPINT3 in MKN-45 cells could promotethe apoptosis,inhibit proliferation and migration of tumor cells,while the inhibition of SPINT3 promotedthe in vivo metastasis ability of MKN-45,and SPINT3 specifically regulated the TGF1 pathway.Throug
7、h drug screening,it was determined that the low expression of SPINT3 could be reversed by Apa-tinib and SB431542,which could promote the apoptosis of MKN-45 SPINT3 shRNA and block metasta-sis invivo.Key words:TGF1 binding pathway;SPINT3;gastric adenocarcinoma;tumor metastasis收稿日期:2 0 2 2-0 3-31修回日期:
8、2 0 2 2-0 6-13基金项目:国家自然科学基金项目(8 17 7 2 8 53)作者简介:汪海锋(198 5-),男,绍兴上虞人,副主任医师,e-mail:,研究方向为肿瘤化疗、靶向及生物治疗;滕理送(196 2-),男,温州永嘉人,主任医师,博士,e-mail:;研究方向为肿瘤的生物治疗、分子靶向治疗及个体化治疗,通信联系人:407汪海锋,等:基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联胃癌在中国的癌症发病率和死亡率中排名前列.2 0 15年中国胃癌的新发病例为40.3万例,死亡病例达2 9.0 9万人,其中农村人口中的发病率为15.84例/10 万人,城市人口中的发病率
9、为11.0 5例/10万人 2.胃腺癌的发病机制十分复杂,除与遗传易感性、基因组不稳定性 4、微卫星不稳定性、染色体不稳定性等生物学事件显著相关外,在癌细胞的发生、发展过程中也伴随多种抑癌基因如P5317、钙依赖性细胞吸附蛋白1(CDHI)等 8 的突变缺失,癌基因如人类表皮生长因子受体2(HER2)9、成纤维生长因子受体2(FGFR2)的异常激活等。尽管随着早期筛查、多种联合治疗手段的应用,胃腺癌的发病率和病死率一直稳步下降,但出现远隔器官转移的胃腺癌患者5年生存率骤降至不足10%l.因此寻找胃腺癌转移过程中的驱动基因成为当前研究的热点。胃腺癌转移过程中转化生长因子-1(TGF1)是已知的能
10、够调节转移的细胞因子.在肿瘤转移的起始过程中,微环境中的TGF1表达能够招募多种免疫细胞,如骨髓来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressorcell,MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞等12.这些细胞能分泌多种细胞因子如白介素10(IL-10)、白介素8(IL-8),促进肿瘤细胞的增殖和侵袭(3.有学者尝试明确肿瘤微环境中TGF1分泌增加的机制,如YANG等141通过敲除TGF1结合通路中的基因LTBP4,使得肿瘤细胞的TGF1分泌显著增加,提高了肿瘤微环境中MDSC的比例,促进了肝癌的转移.在胃腺癌的早期转移中,TGF1已被证实与肿瘤细胞的转移相关 15,但由于TGF1的作
11、用范围十分广泛,仅在胃癌中其可能的机制就包括细胞分化、增殖、形态改变、细胞外基质产生、调亡等6,涉及的信号通路包括SMAD3、S MA D 2、S MA D 7、S T A T 1、MA P K、NF-kB等17,因此仅应用TGF1抑制剂并不能取得很好的效果 18 目前尚未有研究明确TGF1结合通路与胃腺癌转移之间的关联,明确TGF1促进癌细胞转移的分子机制,有助于肿瘤转移的早期诊断和相应的靶向治疗药物的开发。SPINT3(serine peptidase inhibitor,Kunitz Type3)基因于2 0 11年被发现,其功能可能与丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、受体拮抗剂活性、TGF1结
12、合相关.目前关于SPINT3的研究相对较少,且多数集中于单基因研究,无法从整体水平观察通路变化对胃腺癌转移的影响,其与胃癌之间的关联尚未有报道,本研究用动物模型通过文库筛选的方式明确胃腺癌转移的相关通路,论证TGF1结合通路中的SPINT3与胃腺癌转移之间的关联.1材料与方法1.1细胞培养与胃腺癌样本所用细胞为2 93t、MK N-45、小鼠前胃癌细胞(mouse forestomach carcinoma,MFC)细胞.2 93t与MKN-45细胞培养于DMEM高糖完全培养基(含10%胎牛血清FBS)中;MFC细胞培养于RPMI-1640完全培养基(含10%FBS)中,培养条件均为37,空气
13、中CO,体积分数5%.6 例胃腺癌肿瘤组织及其对应的癌旁组织来自浙江大学第一附属医院,所有样本均有患者签署的知情同意书,实验流程得到浙江大学第一附属医院伦理委员会批准。1.2文库筛选选用的sgRNA文库主要包括GO:0050431通路,为TGF1结合蛋白通路,其中包括2 2 个基因,均与TGF1的分泌、调节相关,根据这2 2 个基因设计了6 6 个sgRNA(每个基因设计3个sgRNA靶向).该文库由中国金唯智苏州分公司合成,骨架质粒为Lentiv2.在得到亚文库后,将该文库与慢病毒包装辅助质粒pMD2.G、p s P A X 2 载体按照4:1:3的比例混合,转染至2 93t细胞中,收取48
14、 h的病毒上清液.使用病毒上清液感染MKN-45细胞系48 h,并使用嘌呤霉素(4g/mL)筛选48 h后,得到文库感染的MKN-45.将MKN-45感染Lentiv2空载体作为对照,图1为文库组和对照组小鼠的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的荧光强度。本研究中所用小鼠包括裸鼠与严重免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠,购自北京维通利华有限公司.模型构建结束后,收取SCID小鼠胃部原位肿瘤及肺部转移肿瘤,提取DNA,试剂盒为血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化(北京)科技公司,DP304
15、).基因组DNA使用sgRNAForward与Lentiv2R(F-5-GAGCCAGTACACGACATCAC-3-R)扩增,并使用凝胶电泳检测sgRNA的表达.1.3细胞分组分组包括对照组(CON)、S P INT 3s g R NA 及CON、S P INT 3过表达组.在CON与SPINT3sgRNA组中,细胞分别感染CON和SPINT3sgRNA慢病毒上清液或转染CON与SPINT3sgRNA慢病毒载408兰州大学学报(自然科学版),2 0 2 3,59(3)3mmmma对照组2.5mm2.5mmb文库组图1小鼠肺部细胞的GFP荧光强度Fig.1GFP fluorescence in
16、tensity of mouse lung cells体(使用lipofectamine2000转染,购自美国Invit-rogen公司,货号116 6 8 0 30).CON为Lentiv2载体,SPINT3 sgRNA序列为GTCAAACCTACATGACGCGA.在CON与SPINT3过表达组中,MKN-45与MFC细胞系分别转染或感染人或小鼠SPINT3过表达载体.以上两种载体均由中国华大基因公司合成,骨架质粒为pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(美国System Biosciences(SBI)公司,CD526A-1).1.4通路富集分析在通路富集分析中,选取数据集为癌症基因组
17、图谱-胃腺癌(cancer genome atlas-stomach ad-enocarcinoma,T CG A-S T A D)数据集,使用R软件进行分析.数据集用GDCRNATools下载标准化后,用org.Hs.eg.db注释,并提取出GO:0050431(TGF1结合通路)通路中的基因.将TCGA-STAD数据集中的样本按照SPINT3的均值分为低表达与高表达组,使用Limma包进行差异分析,其中P1均被认为是差异表达基因,用ClusterProfile进行通路富集分析.1.5免疫印迹通过Westernblot方法实现:通过研钵磨碎组织,用RIPA裂解液裂解,细胞直接用RIPA裂解液
18、裂解,裂解时间30 min.裂解液加人相应体积的上样缓冲液,沸水浴10 15min后,加至十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中,12 0 V恒压直至溴酚蓝跑至胶板底部.将蛋白以30 0 mA恒流的方式转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride,PVDF)上,用5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1h,PVDF膜4过夜标记一抗.本研究中SPINT3抗体由上海碧云天公司合成,其余抗体包括甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH,ab8245)、T G F-1(ab215715)、TGF-type 1 receptor(ab31013)、T G F-type 2 re-ceptor(ab1
19、86838)、S MA D 3、p-S MA D 3(a b 52 90 3)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、g a m a(a b 154598)、PI3K-p85(ab191606)、p-磷酸化受体丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)(Ser473)(ab81283)、磷酸化有丝分裂原活化蛋白激酶1(p-MEK1)(ab96379)、糖原合成酶激酶-3(t-GSK3)(ab93926)、-catenin(ab32572)均购自美国Abcam公司.t-MEK1(12761)p-GSK3(Ser9)(9322)、p-catenin(Ser 33,37)(9651)磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p
20、-ERK1/2)(4370)、t-ERK1/2(4695)购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司.抗体稀释质量比除SPINT3为1:2 0 0,GAPDH为1:50 0 0 外,其余均为1:10 0 0.PVDF膜用含0.1%Tween20的磷酸盐吐温缓冲液(phos-phate buffer solution,PBS)清洗3次后,标记相应种属的二抗,抗体稀释质量比为1:50 0 0,室温孵育二抗30 min后,使用PBS(含0.1%Tween20)清洗3次.加人增强化学发光底物并通过CCD扫描仪(美国Bio-Rad公司,ChemiDoc)检测蛋白水平的表达改
21、变.1.6细胞凋亡、增殖与迁移细胞调亡:使用膜联蛋白5-别藻青蛋白(An-nexinVAPC)/碘化丙啶(PI)双染法检测.检测试剂盒购自武汉普诺赛生命科技有限公司,货号P-CA-207.细胞消化后,用原培养上清液终止消化,用PBS清洗3次.细胞使用结合缓冲液重悬,加人AnnexinVAPC抗体与PI染料,室温避光标记10min后,用流式细胞仪检测细胞调亡的变化.细胞增殖:用细胞计数试剂盒-8(日本同仁化学研究所,CK-04)法检测.细胞首先铺于96 孔板中,每孔30 0 0 个细胞,设立4副孔,并分别在0、24、48、7 2、96 h 加人1/10 体积的CCK-8试剂,37避光孵育3h后,
22、用酶标仪检测450 nm光密度,最终细胞的增值指数=(其余时间点的450 nm光密度)/(0 h时的450 nm光密度).细胞迁移:细胞首先铺于2 4孔板中,每孔2 10个细胞,待细胞贴壁后,使用白枪尖水平做一划痕,并于0、12 h时拍照。1.7细胞与动物药物实验在药物处理的体外实验中,MKN-45分为CON、阿帕替尼组、SB431542组,并铺于2 4孔板中,血清饥饿12 h后,分别加人同等体积的DMSO、409汪海锋,等:基于文库筛选的方法确定SPINT3与胃腺癌转移之间的关联25mol/L阿帕替尼与1mol/L的SB431542,37+体积分数5%CO,环境下培养7 2 h,并收取蛋白.
23、15只裸鼠在尾静脉注射110 个MKN-45SPINT3shRNA细胞后,随机分为CON、阿帕替尼与SB431542组,并在细胞注射7 d后分别腹腔注射同等体积PBS、50 m g/k g 阿帕替尼、10 0 L1mol/L的SB431542.每7 d注射2 次,共14d,21d后解剖小鼠,使用荧光显微镜检测小鼠肺部转移肿瘤的变化。1.8统计学分析使用公共数据库R(4.0.5版本)软件完成,其余统计学分析使用SPSS20.0完成,其中小鼠肺部GFP信号强度、增殖指数差异分析的数据使用独立样本t检验分析,P0.05即认为差异具有统计学意义.2结果为明确TGF1分泌相关通路中与胃腺癌转移相关的基因
24、,建立动物模型,将MKN-45标记绿色荧光蛋白,同时感染包含6 6 个sgRNA的慢病毒(靶向2 2 个TGF1结合相关基因),在感染病毒48h后,细胞使用嘌呤霉素筛选48 h,并注射人裸鼠皮下,待14d后,裸鼠形成原位肿瘤,收取原位肿瘤组织,植入SCID小鼠胃部皮下,待12 周后,处死各组小鼠,检测小鼠胃部、肺部肿瘤组织中sgRNA的表达(图2、3).用该模型证实了文库组中小鼠肺部癌细胞转移显著增加,表明在TGF1结合相关基因中,存在着与胃腺癌转移相关的基因.用聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)检测小鼠肺部转移组织中sgRNA的表达结果表明SPINT3
25、sgRNA在文库组小鼠肺部转移肿瘤中普遍表达,VASN(Vasorin)、扭曲原肠胚形成同源物1(TWSGI)在肺部肿瘤组织中也有表达(图4),其他sgRNA在肺部转移肿瘤中缺失.因此,可初步判定SPINT3的表达可能与胃腺癌的转移相关.在TCGA数据库中,将胃腺癌组织分为SPINT3低表达与高表达组,通过GO分析检测在低表达组的组织中通路富集的改变.在SPINT3低表达组中,TGF1分泌相关通路高度富集(图5),表明SPINT3的功能与TGF1的分泌相关.在样本中选取6 例胃腺癌组织及其对应的癌旁组织,发现SPINT3在胃腺癌组织中的表达显著降低,进一步说明SPINT3可能为抑癌基因(图6)
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