基于转录组学研究高原低氧对小鼠T、B淋巴细胞信号通路的影响.pdf

论 著基于转录组学研究高原低氧对小鼠T、B淋巴细胞信号通路的影响*许玉珍,王嘉阳,胡 英,龙启福,缪增强,永 胜(青海大学医学部,青海 西宁 8 1 0 0 1 6)摘 要 目的 基于转录组学测序技术探究高原低氧(H S T)胁迫下T、B淋巴细胞信号通路中枢纽基因和关键调控通路响应的分子机制。方法 分别在海拔4 0 0 m 平原常氧组(P S C组)和4 2 0 0 m(H S T组)处饲养C 5 7 B L/6小鼠3 0 d后取脾脏组织,采用R NA-S e q进行转录组测序,得到差异基因进行基因本体(GO)功能注释和京都基因和基因组数据库(K E G G)通路分析,使用实时荧光定量聚合酶链反应(R T-q P C R)验证。结果 相比于P S C组,H S T组中1 9 4 7个差异基因表达上调,2 2 6 6个差异基因表达下调,差异均有统计学意义(P0.0 5),且K E G G富集分析发现,H S T胁迫下主要通过T、B细胞受体、磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(P I 3 K-A k t)、丝裂原活化蛋白激酶(MA P K)、核因子 B(N F-B)等信号通路调控异常引起免疫炎症的发生发展。结论 H S T胁迫可能通过激活P I 3 K-A k t通路,抑制p 3 8 MA P K和N F-B通路,诱导T、B细胞受体信号通路响应H S T胁迫的转录调控分子机制,引起免疫调节和炎症反应的发生。关键词 高原低氧;脾脏;转录组学测序;T、B细胞受体信号通路D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-5 5 1 9.2 0 2 3.1 7.0 0 2中图法分类号:R 3 9 2.1文章编号:1 0 0 9-5 5 1 9(2 0 2 3)1 7-2 8 8 5-0 8文献标识码:AT r a n s c r i p t o m i c s-b a s e d s t u d y o f t h e e f f e c t s o f h i g h a l t i t u d e h y p o x i a o n T a n d B l y m p h o c y t e s i g n a l i n g p a t h w a y s i n m i c e*XU Y u z h e n,WANG J i a y a n g,HU Y i n g,L ONG Q i f u,M I A O Z e n g q i a n g,Y ONG S h e n g(C o l l e g e o f M e d i c i n e,Q i n g h a i U n i v e r s i t y,X i n i n g,Q i n g h a i 8 1 0 0 1 6,C h i n a)A b s t r a c t O b j e c t i v e T o e x p l o r e t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f t h e r e s p o n s e o f k e y g e n e s a n d k e y r e g u l a-t o r y p a t h w a y s i n T a n d B l y m p h o c y t e s i g n a l i n g p a t h w a y s u n d e r h i g h a l t i t u d e h y p o x i a(H S T)s t r e s s b a s e d o n t r a n s c r i p t o m i c s e q u e n c i n g t e c h n o l o g y.M e t h o d s C 5 7 B L/6 m i c e w e r e r a i s e d a t 4 0 0 m e t e r s t h e p l a i n n o r m o x i a g r o u p(P S C g r o u p)a n d 4 2 0 0 m e t e r s(t h e H S T g r o u p)a b o v e s e a l e v e l f o r 3 0 d a y s,r e s p e c t i v e l y.R NA e x t r a c-t e d f r o m m o u s e s p l e e n t i s s u e w a s u s e d f o r t r a n s c r i p t o m e s e q u e n c i n g,a n d d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s w e r e o b t a i n e d f o r GO f u n c t i o n a l a n n o t a t i o n a n d K y o t o E n c y c l o p e d i a o f G e n e s a n d G e n o m e s(K E G G)p a t h w a y a n a l-y s i s,r e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n(R T-q P C R)w a s u s e d t o v e r i f y t h e d i f f e r e n-t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s.R e s u l t s C o m p a r e d w i t h t h e P S C g r o u p,1 9 4 7 d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s w e r e u p-r e g u l a t e d a n d 2 2 6 6 d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s w e r e d o w n-r e g u l a t e d i n t h e H S T g r o u p,t h e d i f f e r e n c e s w e r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t(P0.0 5).K E G G e n r i c h m e n t a n a l y s i s s h o w e d t h a t a b n o r m a l r e g u l a t i o n o f d i f f e r e n t i a l-l y e x p r e s s e d g e n e s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s u n d e r H S P s t r e s s c a u s e d t h e o c c u r r e n c e a n d d e v e l o p m e n t o f i m-m u n e i n f l a mm a t i o n,m a i n l y t h r o u g h T c e l l r e c e p t o r,B c e l l r e c e p t o r,P I 3 K-A k t,MA P K,N F-B a n d o t h e r s i g-n a l i n g p a t h w a y s.C o n c l u s i o n H S P s t r e s s m a y i n d u c e T a n d B c e l l r e c e p t o r s i g n a l i n g p a t h w a y s t o r e s p o n d t o t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r y m o l e c u l a r m e c h a n i s m s b y a c t i v a t i n g P I 3 K-A k t p a t h w a y,i n h i b i t i n g p 3 8 MA P K a n d N F-B p a t h w a y s,a n d c a u s i n g i mm u n e r e g u l a t i o n a n d i n f l a mm a t o r y r e s p o n s e.K e y w o r d s H i g h a l t i t u d e h y p o x i a;S p l e e n;T r a n s c r i p t o m i c s e q u e n c i n g;T a n d B c e l l r e c e p t o r s i g-n a l i n g p a t h w a y 氧对哺乳动物有氧代谢至关重要1。高原地区氧含量的下降会削弱有氧代谢,引起机体循环功能下降,导致组织、器官的营养和能量减少,造成不同程度的氧化损伤,诱导高原肺水肿2和高原脑水肿3等高5882现代医药卫生2 0 2 3年9月第3 9卷第1 7期 J M o d M e d H e a l t h,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 9,N o.1 7*基金项目:国家自然科学基金项目(8 2 0 6 0 2 9 5);青海省科技计划项目(2 0 1 9-Z J-7 0 5 9);青海大学青年科研基金项目(2 0 2 1-QNY-1 0)。作者简介:许玉珍(1 9 8 6-),硕士研究生,讲师,主要从事低氧刺激对机体免疫功能改变及适应机制的研究。通信作者,E-m a i l:y o n g s h e n g q h u.e d u.c n。原病的发生。因此,研究高原病的发病机制成为近年来高原医学备受关注的课题。有研究表明,低氧会影响免疫细胞的新陈代谢和功能,且与高原病的发生发展有密切关系,且高原低氧(H S T)环境可以调节免疫基因的表达、影响机体免疫功能、诱导炎症反应发生等4。此外,K I AN I等5研究发现,在低氧环境下,磷脂酰 肌 醇-3激 酶/蛋 白 激 酶B/雷 帕 霉 素 靶 蛋 白(P I 3 K/A k t/mTO R)和核因子 B(N F-B)共同调控T、B细胞受体活化信号,在固有和适应性免疫系统中发挥重要作用。然而,H S T刺激如何调控机体免疫功能的研究仍然有限,因此深入了解低压低氧刺激如何调控机体的免疫应答过程,进而适应低氧胁迫是亟待解决的重要科学问题。众所周知,脾脏是机体最大的免疫器官,含有大量的淋巴细胞,在细胞免疫和体液免疫应答过程中都发挥着不可或缺的作用。据报道,H S T胁迫下,低氧诱导因子-1(H I F-1)通过抑制雷帕霉素复合物1(mTO R C 1)介导的骨髓 细胞瘤病毒 癌基因同 源物(M y c)相关通路调节T f h与T h 1细胞的发育,促进生发中心B细胞的增殖6。此外,L I等7研究发现,H I F-1 是前B细胞中m i R-5 8 2的靶点,敲除m i R-5 8 2后,激活mTO R C 2,增强H I F-1 的表达和A k t磷酸化,促进前B细胞增殖,调节早期B细胞的分化发育。进一步研究发现,新型冠状病毒感染患者B细胞中出现低氧有关的转录变化,引起B细胞发育异常,包括B细胞减少、抗体类别的转换和亲和力成熟等,诱导炎症反应加剧和自身免疫反应的发生,提示在新型冠状病毒感染中,适当的早期氧疗会改善免疫反应,利于疾病的恢复8。上述研究提示低氧与T、B细胞分化发育密切相关,探究T、B细胞响应低氧应激的分子机制为临床免疫疗法提供新思路。随着测序技术的发展,高通量测序技术成为了解低氧胁迫影响免疫反应及其通路和基因表达的有力工具。R NA测序(R NA-s e q)的转录组分析技术可以从大量转录信息中识别差异表达基因(D E G s),分析核心调控通路,成为探究低氧胁迫机体各个组织系统响应免疫应答机制不可或缺的工具9。有研究发现,低压低氧环境下大鼠肠道模型中P P A R信号通路、矿物质吸收、甘油三酯代谢、脂肪消化和吸收等消化相关代谢途径在京都基因和基因组数据库(K E G G)通路分析中显著富集,为大鼠在低氧环境下胃肠道调节的潜在分子机制提供新的理论依据1 0。Z HOU等1 1研究发现,低压低氧暴露的幼年鳙鱼心脏模型中丝裂原活化蛋白激酶(MA P K)信号、细胞凋亡和肾上腺素信号等相关代谢途径在K E G G通路分析中得到了高度富集,为幼年鳙鱼在低氧环境下的应激分子机制提供线索。这些研究提示,转录组测序技术在探究低氧胁迫适应的分子机制中发挥着重要作用。因此,本实验采用转录组测序技术研究H S T胁迫对小鼠脾脏T、B细胞的影响,挖掘与T、B细胞受体相关通路和关键基因,明确其在H S T条件下T、B细胞的调控机制,为揭示低氧胁迫下免疫细胞调控机制的相关研究提供新思路。1 材料与方法1.1 实验动物 68周龄的S P F级C 5 7 B L/6小鼠,购自西安交通大学医学部实验动物中心,动物许可证号:S Y X K 2 0 2 0-0 0 5,饲养于温度为1 82 2、湿度为4 5%5 5%的实验动物房中,自由饮水、进食,保持环境卫生。待小鼠适应周围环境后,将小鼠随机分成2组,每组5只。对 照组即平原 常氧组(P S C组),在 西 安 交 通 大 学 医 学 部 实 验 动 物 中 心(海 拔4 0 0 m)饲养3 0 d;实验组即H S T组,在青海省果洛藏族自 治 州 玛 多 县 人 民 医 院 实 验 动 物 房(海 拔4 2 0 0 m)。3 0 d后无菌采集小鼠脾脏组织置于液氮冻存备用。1.2 主要试剂 逆转录聚合酶链反应(q P C R)试剂盒(T B G r e e n P r e m i x E x T a qTM(T l i R N a s e H P l u s,R R 8 2 0 A,T a k a r a,日本);逆转录试剂盒(P r i m e-S c r i p tTM R T r e a g e n t k i t w i t h g D NA E r a s e r,R R 0 4 7 A,T a k a r a,日本);T r i z o l裂解液(美国I n v i t r o-g e n公司)。1.3 方法1.3.1 总R NA提取和I l l u m i n a测序 从各组小鼠脾脏中提取总R NA(常规T r i z o l法),将总R NA中纯化的mR NA打断并逆转录成c D NA,经末端修复、P C R扩增等过程制备mR NA-S e q文库进行I l l u m i n a测序。1.3.2 R NA-S e q质量评估和序列比对 为了保证数据分析的质量及可靠性,对高通量测序得到的原始数据(r a w r e a d s)进行过滤,主要包括去除原始数据中有测序接头(a d a p t e r)的r e a d s或测序质量较低的r e a d s,对c l e a n d a t a 进行后续高质量分析。使用 H I S AT 2软件构建索引,将配对末端 c l e a n r e a d s 与参照基因组比对,采用皮尔逊相关性检测对样本的基因表达水平进行精确分析。1.3.3 D E G s分 析 对P S C组 和H S T组 通 过D E S e q 2统计软件,基于负二项式分布模型进行差异基因表达数据分析。用F P KM(F r a g m e n t s P e r K i l o-b a s e p e r M i l l i o n)对基因长度和深度校正其表达水平。以|l o g 2 F C|0作为显著差异表达的阈值。1.3.4 基因本体(GO)注释、K E G G分析和基因富集分析 采用c l u s t e r P r o f i l e r(3.4.4)富集分析,找出D E G s显著富集的GO条目并计算P值。GO(h t-t p:/www.g e n e o n t o l o g y.o r g/)即基因本体数据库,6882现代医药卫生2 0 2 3年9月第3 9卷第1 7期 J M o d M e d H e a l t h,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 9,N o.1 7包括生物过程(B P)、细胞组成(C C)和分子功能(MF)3个部分。K E G G(h t t p:/www.k e g g.j p/)是分子水平的数据库资源,通过高通量数据库,了解细胞、生物体和生态系 统 的 高 级 功 能 和 效 用。采 用 c l u s t e r P r o f i l e r(3.4.4)软件分析计算K E G G通路中D E G s即P0.0 5视 为 显 著 富 集。基 因 集 富 集 分 析G S E A(h t-t p:/www.b r o a d i n s t i t u t e.o r g/g s e a/i n d e x.j s p):从基因集富集分析的角度出发,针对有重要生物学意义但差 异 表 达 较 小 的 基 因 进 行 功 能 富 集 分 析,作 为K E G G数据集的补充工具。1.3.5 实时荧光定量聚合酶链反应(R T-q P C R)验证 将R NA逆转录为D NA,c D NA合成是按照制造商的说明使用P r i m e S c r i p tTM R T试剂盒进行。以-a c-t i n作为内参,检测P D-1、C T L A 4、C D 4 5、C D 4、C D 8 a、C D 8 b 1、C D 3 e、I C O S、C D 2 8、C D 4 0 L、P I R-B、C D 2 2、C D 7 2、I g、I g、F c g R I I B、L E U 1 3、C D 8 1、C D 1 9、C D 2 1、S H P 1、G R B 2、S O S、R a s、R a f、ME K 1/2、p 3 8、N F AT、P I 3 K、A k t、G S K-3、N I K、I KK、N F-B、I B、T N F-、I F N-的mR NA表达量,引物序列详见表1。表1 R T-q P C R引物信息基因引物序列长度(b p)-a c t i nF:C A T C C G T AAA GA C C T C T A T G C C AA C2 5R:A T G GA G C C A C C GA T C C A C A1 9P D-1F:G G T A T C C C T G T A T T G C T G C T G C T G2 4R:C T T C A GA G T G T C G T C C T T G C T T C C2 4C T L A 4F:G C G G C A GA C AAA T GA C C AAA T GA C2 4R:C AA C A G C T C T C A G T C C T T G GA T G G2 4C D 4 5F:G T T A T C C A C G C T G C T G C C T C A C2 2R:T T G G C T G C T GAA T G T C T GA G T G T C2 4C D 4F:C T C C T T C G G C T T T C T G G G T T T C C2 3R:G C A C T G G C A G G T C T T C T T C T C A C2 3C D 8 aF:G G C A C C C GAA C T C C GAA T C T T T C2 3R:C C AA C A C T T C A C A T A C C A G G T C C A C2 5C D 8 b 1F:G C T GA C T G T G G T T GA T G T C C T T C C2 4R:GAA C G G G C A T T G C T T C T T C T T C T T C2 5C D 3 eF:C C A G GA C GA T G C C GA GAA C A T T G2 3R:C C AG G T G C T T A T C A T G C T T C T GA G G2 5I C O SF:GAA G T C C T C T G C GAA C T C A C C AA G2 4R:C T G G GA G C T G T C T G G G T T G T T T A G2 4C D 2 8F:C A G G C T G C T G T T C T T G G C T C T C2 2R:A G G C T GA C C T C G T T G C T A T C T A C C2 4C D 4 0 LF:AA G G C G G C AAA T A C C C A C A G T T C2 3R:T G GA T C A C T T G G C T T G C T T C A G T C2 4P I R-BF:C T G C T T T T T C T C A T C C T C AT C G2 2R:C A T A G G T T A C A T C C T G G G T C T C2 2C D 2 2F:T GA G C T G T A C C T T T C TAA G C AA2 2R:GAT G T AA G G T T G GAA C G G T T T C2 2C D 7 2F:C T C A G G GA GAA GA T AAG T C A G C2 2R:T C T G C T T C T C C T G TAA T G T G T C2 2I g F:T A C C AA GAA C C G C A T C A T C A C A G C2 4R:G G C A T G T C C A C C C C AAA C T T C T C2 3I gF:AA G C G G C G GAA C A C A C T GAAA G2 2R:AA G TA G C A G GAA GA T G G G C A C AA T G2 5F c g R I I BF:T G C T AAA T C T T G C T G C T G G GA C T C2 47882现代医药卫生2 0 2 3年9月第3 9卷第1 7期 J M o d M e d H e a l t h,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 9,N o.1 7续表1 R T-q P C R引物信息基因引物序列长度(b p)R:G T C A G T G T C A C C G T G T C T T C C T T G2 4L E U 1 3F:T A G C C T A T G C C T A C T C C G T GAA G T C2 5R:G C C G T GA G GA T G G T GAA GAA C A G2 3C D 8 1F:G GAT GA T GA T G C C AA C AA T G C C AA G2 5R:T G G T G G T A G T C A G T G T G G T C A G T G2 4C D 1 9F:C T C C C T G T C T C C T T C C T C C T C T T T C2 5R:C A C AA C AT T G C C T C C C T C T T C TA C C2 5C D 2 1F:GA C T C A T T G G T GA C T C G T C T G C T A C2 5R:G C T G T C T C T G C T G C T G C T G T A G2 2S H P 1F:G G G C T A GA C T G T GA C A T T GA T A2 2R:T T T C T T C T T G G T C G T T T C GA T G2 2G R B 2F:C G G GA C AT A GAA C A GA T G C C A C A G2 4R:T GAA T GAAG T C T C C T C T G C GAAA G C2 5S O SF:C G T G T A T C A C T G T T G G C A T T A C2 2R:G C A G T T A T A G C C T GA T T C AA G C2 2R a sF:AA G C G T G T GAAA GA T T C T GA T G2 2R:G G T C T C AA T GAA T G GAA T T C C G2 2R a fF:G C T T C C C T A C G C C C A C A T C AA C2 2R:C A C A G T C A G C C A C C AA C C T C T T C2 3ME K 1/2F:C A T C A G T G TA G G T C A T G G GA T G2 2R:G T G G C T C G T T C A C T A T G T A G T C2 2p 3 8F:G C AA GAG C T GAA C AAAA C A G TA2 2R:T C C AAAA G T C C T A T GA C G T T C T2 2N F A TF:C A T C C T T G C C T G C C C T T GA C T G2 2R:T GA G C C C T G T G G T GA GA C T T G G2 2P I 3 KF:AAA C AAA G C G GA GAA C C T A T T G2 2R:T AA T GA C G C AA T G C T T GA C T T C2 2A k tF:T C GA T T A T C T C AAA C T C C T C G G2 2R:C GA C T T C A T C C T T T G C AA T GA T2 2G S K-3F:T G G T A G C A T GAAA G T T A G C A GA2 2R:C T C T C G G T T C T T AAA T C G C T T G2 2N I KF:G C C A C C A GA C C C T A C C T A C T C C2 2R:T G C C A GA C T C C T C C T T G C T C AG2 2I KK F:A C A T T A G C A GA C C G T GAA C A T C C T C2 5R:T G G T C C T C A T T T G C T T C A C GAA T A2 4N F-BF:C AAA GA C AAA GA G GAA G T G C AA2 2R:GA T G GAA T G TAA T C C C A C C G T A2 2I BF:C A GA G C C A G G C A GA C A G C T T2 0R:T G C AA T G T G G C AA T G T G GAG2 0T N F-F:A T G T C T C A G C C T C T T C T C A T T C2 2R:G C T T G T C A C T C GAA T T T T GA GA2 2I N F-F:C T T GAAA GA C AA T C A G G C C A T C2 2R:C T T G G C AA T A C T C A T GAA T G C A2 28882现代医药卫生2 0 2 3年9月第3 9卷第1 7期 J M o d M e d H e a l t h,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 9,N o.1 71.4 统计学处理 应用S P S S 1 8.0统计软件进行数据分析,符合正态分布的计量资料以xs表示,采用两独立样本t检验,P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 P S C组和H S T组脾脏D E G s 3 0 d的H S T处理后,以|l o g 2 F C|0和P-校正0.9 5,提示生物学重复样本间基因表达情况较为一致,实验数据可靠,且小鼠脾脏组织在不同海拔高度下对低氧诱导反应有差异。图1 D E G s柱图2 P e a r s o n相关性系数分析2.2 D E G s的GO富集分析 通过GO富集分析对D E G s进行B P、C C、MF富集(图3)。主要参与B细胞激活、适应性免疫应答、淋巴细胞激活的正向调节信号通路等GO生物过程;并在免疫球蛋白复合体和免疫球蛋白复合体循环等细胞组分的构成方面起作用;参与抗原结合和免疫球蛋白受体结合等分子功能。提示免疫系统在H S T胁迫下发生了重要变化。图3 D E G s的G O注释图2.3 D E G s的K E G G富集分析 在H S T胁迫下得到D E G s进行K E G G富集分析发现,主要参与T、B细胞受体,P I 3 K-A k t,MA P K,N F-B等多个免疫炎症相关信号通路调控,见图4。图4 D E G s的K E G G通路富集2.4 R T-q P C R验证结果 对T、B细胞受体信号通路中的D E G s及相关炎症因子进行了mR NA表达量的检测,结 果发现,T细胞表面膜 分子:P D-1、C T-L A 4、C D 4 5、C D 4、C D 8 a、C D 8 b 1、C D 3 e、I C O S、C D 2 8、C D 4 0 L在P S C组与H S T组之间均表现出显著上调差异表达;B细胞表面膜分子:P I R-B、C D 2 2、C D 7 2、I g、I g、F c g R I I B、L E U 1 3、C D 8 1、C D 1 9、C D 2 1均表现9882现代医药卫生2 0 2 3年9月第3 9卷第1 7期 J M o d M e d H e a l t h,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 9,N o.1 7出显著差异变化;T、B细胞受体信号通路共有基因:P I 3 K-A k t途径中P I 3 K、A k t、G S K-3、N I K、I KK 基因,p 3 8 MA P K和N F-B途径中S H P 1、G R B 2、S O S、R a s、R a f、ME K 1/2、p 3 8、N F-B、I B基因均出现差异表达。此 外,相 比 于P S C组,H S T组 的I N F-和T N F-等炎性细胞因子出现显著上调差异表达。因此,上述结果提示,在H S T胁迫下通过影响T、B细胞受体信号通路介导炎症反应发生。见图5。注:A.T细胞表面膜分子;B.B细胞表面膜分子;C.T、B细胞受体信号通路共有基因。与P S C组相比,aP0.0 0 0 1,bP0.0 5,cP0.0 0 1,dP0.0 1。图5 T、B细胞受体信号通路差异基因的R T-q P C R结果3 讨 论经过3 0 d H S T暴露后,发现H S T组相较于P S C组小鼠脾脏组织多个基因发生了显著差异表达。有研究发现,缺氧抑制白细胞介素-2诱导的T细胞增殖过程,同时抑制抗原诱导的细胞毒性T细胞中促炎性细胞因子的产生1 2。据报道,低氧暴露会引起机体对伤害性刺激做出防御性反应,在免疫应答过程中,免疫细胞被激活、分裂和分化,通过诱导炎症消除危险信号以保护机体免受伤害1 3。本研究通过比较暴露于不同海拔的小鼠脾脏组织转录组谱,探讨低氧对小鼠T、B细胞信号通路的影响机制。为了解H S T胁迫对小鼠脾脏T细胞膜受体激活机制,本实验对T细胞膜受体的1 0个基因进行R T-q P C R实验验证,结果发现基因均出现了显著性上调变化(图5),提示T C R识别活化信号后,经C D 3和共受体C D 4或C D 8传递T细胞活化的第一信号,启动T细胞激活,其次C D 2 8、I C O S、C D 4 0 L共刺激分子相互作用下提供第二信号诱导T细胞完全活化,共抑制分子P D-1和C T L A 4基因表达也显著上调,提示机体同时启动免疫抑制信号,下调或中止了免疫应答。此外,H S T胁迫对小鼠脾脏B细胞膜受体的激活与T细胞相似,也需要双信号活化。B UR R OWS等1 4研究发现小鼠B细胞中H I F-1 激活后,B C R编辑减少和未成熟B细胞的发育停止,导致外周B细胞0982现代医药卫生2 0 2 3年9月第3 9卷第1 7期 J M o d M e d H e a l t h,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 9,N o.1 7数量减少,H I F-1 的动态调节对正常的B细胞发育至关重要。本研究结果发现,B细胞膜受体中的I g、I g、C D 1 9、C D 2 1、C D 8 1基因显著下调,提示激活B C R后,与I g/胞内区相关联的酪氨酸激酶L YN活化,使I g/、C D 1 9/C D 2 1/C D 8 1胞内段的I T AM酪氨酸残基被磷酸化后发生负调节,随后募集并活化S YK,进而启动B细胞内信号转导的级联反应。T、B细胞受体信号通路参与免疫应答、炎症反应及细胞生长、凋亡等生物事件的发生。为了进一步明确H S T胁迫对小鼠脾脏T、B细胞内信号通路影响的机制,对T、B细胞受体信号通路中的D E G s进行了分析,提示低氧激活T、B细胞,启动信号级联反应将活化信号转入T、B细胞内,一方面活化信号激 活P I 3 K后,催化P I P 2的3位羟基磷酸化生成P I P 3为第二信使,招募P D K 1和A k t到质膜上,磷酸化A k t蛋白的第3 0 8号苏氨酸,导致A k t活化,进一步激活下游G S K-3和I KK。A k t磷酸化G S K 3后,导致-c a t e n i n在胞浆内大量聚集,进入细胞核激活T、B细胞分 裂、生 长 调 控 及 炎 症 相 关 基 因(如I F N-、T N F-等);I KK 被A k t磷酸化激活后,I KK 进一步磷酸化能够抑制N F-B途径的转录因子I B。以上结果提示,H S T胁迫引起P I 3 K-A k t信号轴激活,导致免疫调节和炎症因子的产生(如I F N-、T N F-等)。有研究表明,P I 3 K-A k t是各种细胞表面受体激活的脂质激酶家族,P I 3 K-A k t可以控制T、B细胞从淋巴结的进出,以及炎症组织中T、B细胞的招募和扩增1 5。据报道,H S T暴露的大鼠脑组织中H I F、血管内皮生长因子(V E G F)、P I 3 K和A k t的磷酸化显著增强,激活大鼠脑组织中P I 3 K-A k t信号通路,参与脑组织炎症损伤和凋亡1 6。有研究发现,P I 3 K-A k t和H I F-1 通路是介导小鼠卵巢癌的关键致癌通路,其中,盐诱导激酶2(S I K 2)可以激活P I 3 K-A k t、H I F-1 和线粒体动力相关蛋白1(D r p 1)磷酸化引起线粒体裂变,导致免疫平衡失调,进而诱发癌症1 7。此外,有研究报道,I F N-刺激促炎巨噬细胞的活化,抑制肿瘤组织中的血管生成,诱