基于数据挖掘和实验验证探究大黄素治疗脓毒症相关急性肾损伤的作用机制.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1422-1430,1401基于数据挖掘和实验验证探究大黄素治疗毒症相关急性肾损伤的作用机制欧贤，周金瑶，孙饶，王亚萍，吴祯祥，赵凯奇”，汪华学1.2*蚌埠医学院第一附属医院重症医学科；蚌埠医学院第一附属医院急危重症研究所；3蚌埠医学院，蚌埠2 330 0 0摘要：通过数据挖掘和动物实验探讨大黄素治疗脓毒症相关急性肾损伤（sepsis-associated acute kidney injury，SA-AKI)的分子机制。从GEO数据库筛选SA-AKI发病过程的关键基因,进行GO和KEGG富集分析，然后利用 STRING构建PPI网络，采用Cytoscape中的MCODE构建核心靶标、炎性信号通路互作网络。Wistar大鼠构建三组模型：假手术组（Sham）、脓毒症组（CLP）和药物组（CLP+EMO）,运用HE染色法、脲酶法、肌氨酸氧化酶法、硫代巴比妥酸法、ELISA法和Westernblot法等实验方法进行检测。结果显示,共获得2 8 0 1个SA-AKI发病过程的关键靶点。GO生物过程分析提示这些靶点的生物学功能主要涉及膜信号转导、血管调节和伤口愈合。KEGG通路富集分析显示，TNF、I L-17、PI 3K-A k t、NF-k B和MAPK信号通路是富集与炎症相关的信号通路。三组模型6 d内死亡率无差异（P0.05）。与Sham组相比,CLP组肾小球大小不一，有萎缩和分裂现象，肾小管扩张，空泡样改变多见,高倍镜下可见炎性细胞浸润;血液中Scr、BU N和MDA水平显著上升（P0.001）;细胞因子TNF-、IL-17 和IFN-水平显著升高（P 0.0 0 1）；且肾组织中TNF-、I L-17 A、T R A F6 和NF-kB信号通路蛋白表达上调（P0.05）。与CLP组比较,CLP+EMO组空泡样改变降低,高倍镜下炎性细胞浸润减少;血液中测定的上述指标与肾组织测定的蛋白含量表达均呈现不同程度的降低（P0.01、P 0.0 0 1和P0.05).Compared with the sham group,glomeruli in the CLP group varied in size,with atrophy and di-vision,tubular dilatation,vacuole-like changes were more common,and inflammatory cell infiltration was observed at highmagnification;Scr,BUN,and MDA levels in the blood were significantly increased(P0.001);cytokines TNF-,IL-17,andIFN-levels were significantly increased(P0.001);and TNF-,IL-17A,TRAF6,and NF-kB signaling pathway proteinexpression was up-regulated in the renal tissue(P0.05).Compared with the CLP group,vacuolated changes were de-creased and inflammatory cell infiltration was decreased in the CLP+EMO group at high magnification;the above indexesmeasured in blood and the protein content expression measured in renal tissue showed different degrees of decrease(P0.01,P0.001 and P1,P0.05,筛选出SA-AKI发病过程中的关键基因。最后利用 GeneToList()将差异基因的ID与名称进行比对,舍弃无法对应的基因 ID。1.1.2潜在靶点的GO和KEGG分析基因本体论（gene ontology,GO）中生物过程数据库（biological process,BP）、细胞成分数据库（cel-lular component,CC）和分子功能数据库（molecularfunction,MF）分别描述了基因产物涉及的生物过程、所处的细胞环境和可能的分子功能。基因和基因组（kyoto encylopaedia of genes and genomes,KEGG)路径包括大多数已知的代谢途径和一些已知的调控途径。为了更进一步了解 SA-AKI 发病过1424程所涉及的生物学过程,进行了 GO 和KEGG富集分析。1.1.3PPI分析和核心网络构建STRING网站（cn.string-db.org）是一个在线蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）分析数据库,它可以使用计算预测来补充现有的蛋白质与蛋白质相互作用的信息。将SA-AKI发病过程关键靶点生成PPI网络,以鼠为研究对象,最小相互作用得分为0.4。利用Cytoscape3.8.2软件将PPI结果导入,采用MCODE插件进行核心互作网络分析并展示,同时将KEGG富集分析的炎性信号通路涉及的核心靶点构建信号通路与核心靶蛋白的互作网络。1.2动物实验验证1.2.1药物、主要试剂和仪器大黄素（货号为：E886074，纯度96%，上海麦克林生化科技股份有限公司）；羧甲基纤维素钠和BSA封闭液（货号为：C8620、A 8 0 2 0，So l a r b i o 公司）；苏木素-伊红染液（货号为：KGA224，江苏凯基生物技术股份有限公司）；Scr、BU N和MDA（货号为：C011-2-1、C0 13-2-1、A 0 0 3-1-2,南京建成生物科技有限公司）;IFN-、IL-17 和TNF-的ELISA检测试剂盒（货号为：YX-E21193、YX-E2 10 19、YX-E21174,上海优选生物科技有限公司）；一抗TNF-、IL-17 A、T R A F6、NF-k Bp 6 5、Ik B和p-IkB（货号为：AF7014、D F6 12 7、A F537 6、A F50 0 6、A F50 0 2、AF2002，A f f i n i t y 公司）；内参GAPDH（货号为：AF2819，上海碧云天生物技术有限公司）；HRP标记的山羊抗兔IgG和BCA蛋白定量试剂盒（货号为：GB23303、G 2 0 2 6,武汉赛维尔生物科技有限公司）；ECL化学发光试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、上样缓冲液和蛋白Marker（货号为：SQ202、PG 112、WJ103、LT 10 1S,上海雅酶生物医药科技有限公司）；电热扶风干燥箱（货号为：10 1AS-3，上海圣欣科学仪器有限公司）；冰箱（货号为：BCD-258A/C，海尔）；生物荧光显微镜（货号为：BX63,Olympus）；天平（货号为：E200，赛多利斯）；酶标仪（货号为：1681130,Bio-rad);TOUCH IMAGER接触式化学发光成像仪（货号为：E-BLOTXLi,E-Blot）。1.2.2动物模型、模型构建和分组方法68 周雄性SDF级Wistar大鼠（许可证号为：SCXK（鲁）2 0 190 0 0 3，济南朋悦实验动物繁殖有限公司）,体重2 0 0 2 2 0 g。所有操作流程按照蚌埠医学天然产物研究与开发院伦理委员会指定的实验室动物使用和护理指南进行,同时符合国际实验动物护理和使用指南建议（伦理审批号为：伦动科批字2 0 2 2 第40 3号）。将40只Wistar大鼠喂食普通饲料两周后，随机选取30只后按照随机数表法分为3组：假手术组（Sham）、脓毒症组（CLP）和药物组（CLP+EMO）,每组各10只。造模前大鼠禁食12 h,自由饮水。CLP模型利用水合氯醛（40 mg/kg）麻醉大鼠,然后取腹部正中切口2 cm,暴露盲肠，用18 号针头穿刺，少量盲肠内容物通过穿刺伤口挤出，关闭剖腹术切口，并给予无菌生理盐水(2 4 mL/kg）进行液体复苏。Sham组除未用18 号针头穿刺盲肠,其余步骤与CLP组相同。CLP+EMO组在造模前5d内灌胃（35mg/（k gd)含大黄素的羧甲基纤维素钠混悬液,另两组大鼠给予相同剂量的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液进行灌胃,最后一次灌胃后2 h时制备CLP模型6 干预期间,观察大鼠的一般情况,并记录各组死亡数目。造模后2 4 h时处死大鼠，留取肾组织及血液标本。1.2.3肾组织病理学检测将大鼠肾组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中，经过梯度乙醇脱水后用石蜡包埋并切片，常规HE染色在光镜下随机选取3个视野进行病理性观察并拍照。1.2.4肾肾功能和氧化指标测定将经腹主动脉采集的血液经30 0 0 r/min离心10min取上清液于-8 0 保存备用。分别采用脲酶法和肌氨酸氧化酶法对各组血清肌酐(serum creati-nine,Scr)和血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）进行检测;硫代巴比妥酸法测定大鼠血清丙二醛(ma-londialdehyde,MDA)。1.2.5血清IFN-、IL-17、T NF-浓度测定采用双抗体夹心ELISA测定-8 0 保存的大鼠血清,严格按照试剂盒说明书进行实验操作测量干扰素-（interferon gamma，IFN-）、白细胞介素-17（in t e r le u k in 17，I L-17）和肿瘤坏死因子-（t u m o rnecrosis factor,TNF-)含量。1.2.6Western blot利用细胞裂解液和蛋白酶抑制剂混合液提取肾组织蛋白,BCA法测定其样品蛋白浓度。制备SDS-PAGE胶在12 0 V电压下电泳6 0 min，然后转移至PVDF膜后转膜12 0 min,BSA室温封闭2 h,TBST洗膜3次后加人稀释的一抗：TNF-、I L-17 A、Vol.35Vol.35TRAF6、NF-k Bp 6 5、p-Ik B、Ik B和GAPDH在冰箱中4过夜,TBST洗膜3次后加人二抗稀释液摇床孵育1h,再次洗膜后加人显影液后进行曝光。1.3统计学分析采用R4.1.1软件分析。计数资料比较采用Fisher确切概率法。计量资料以Shapiro-Wilk检验是否符合正态分布，正态计量资料以均数标准差（s)表示,采用单因素方差分析（One-Way ANO-VA)进行组间比较组内两两比较采用TukeyHSD，log2FoldChange欧贤等：基于数据挖掘和实验验证探究大黄素治疗脓毒症相关急性肾损伤的作用机制Notsig1425当P1,P0.05）（见表1）。盲肠感染Caecal infection无有，深黑色有，黑色ICAMITLR2TNFMYCJNN-kBsignalingpathwayREIBSELE死亡数(率)Number dead(Rate)2(20%)2(20%)3(30%)2.5肾组织病理学结果通过HE染色法观察到Sham组的肾小球结构清晰,大小无改变，肾小管无肿胀、水肿，未见空泡化改变,高倍镜下无炎细胞浸润;而CLP组则肾小球大小不一,有萎缩和分裂现象，肾小管扩张,空泡样改变多见,高倍镜下可见大量炎性细胞浸润;CLP+EMO组相比于CLP组肾小球大小不一,有萎缩和分裂现象，肾小管扩张，空泡样改变减少，高倍镜下见炎性细胞浸润减少（见图6）。ShamCLPCLP+EMO100400图6 大鼠肾组织病理学光镜结果(HE染色)Fig.6Histopathological light microscopy results of rat kidney(HE staining)14282.6大鼠血清肾功能和氧化应激指标与 Sham 组相比,CLP 组大鼠血清 Scr 和血浆BUN水平显著升高（P0.001）,同时反映机体脂质Table 2Comparison of renal function and oxidative stress parameters in rats(x s,n=7)组别Group假手术组Sham脓毒症组 CLP用药组 CLP+EMO注：与Sham组比较，#P0.001;与CLP组比较，*P0.01,*P0.001。Note:Compared with Sham group,p0.001;Compared with CLP group,*0.01,*P0.001.2.7大鼠血清TNF-、IL-17 和IFN-水平与 Sham 组比较,CLP组大鼠血清中 TNF-、IL-17和IFN-表达均明显增高（P0.001），与CLP组比较,CLP+EMO组的TNF-、IL-17 和IFN-水组别Group假手术组 Sham脓毒症组 CLP用药组 CLP+EMO注：与Sham组比较,#P0.001;与CLP组比较，*P0.001。Note:Compared with Sham group,t 0.001;Compared withCLP group,2.8大黄素对IL-17/NF-kB和TNF/NF-kB信号通路相关蛋白的影响对IL-17/NF-kB和TNF/NF-kB信号通路主要示意图进行绘制（见图7）。在大黄素对上述信号通路的作用中发现,与 Sham组相比,CLP组肾组织中天然产物研究与开发过氧化的程度的MDA含量也显著升高（P0.001），与CLP组比较,CLP+EMO组中的Scr、BUN和MDA水平降低(P0.01）（见表2）。表2 大鼠肾功能和氧化应激指标比较(xs,n=7)血清肌酐Scr(umol/L)50.81 3.7694.49 12.42#66.85 7.30*表3血清 TNF-、IL-17 和 IFN-水平比较(xs,n=7)Table 3Comparison of serum TNF-,IL-17 and IFN-levels(x s,n=7)肿瘤坏死因子-TNF-(ng/mL)178.36 7.97369.72 92.67#208.87 11.56*IL-17AACTUHSP90TRAF6Vol.35血尿素氮丙二醛BUN(mmol/L)MDA(mol/mL)7.44 0.864.69 1.0819.09 3.64#10.47 2.05#14.27 1.79*7.33 0.98*平显著降低（P0.001）（见表3）。结果提示大黄素可能参与调节Th17/Treg信号轴减弱脓毒症大鼠的炎症反应。白细胞介素-17IL-17(ng/mL)27.31 1.5446.23 3.87#35.96 3.84*P0.001.TNF-、IL-17 A、T R A F6、NF-k Bp 6 5 蛋白表达及 IkB磷酸化水平升高（P0.05）,与CLP组比较,CLP+EMO组中上述蛋白均呈现不同水平的降低(P0.05)（见图8）。提示大黄素可能通过减少大鼠肾组织中IL-17A和TNF-的表达减弱NF-kB信号通路的激活。TNF-aINFRITRADDTRAFSTRAF2RIPITAB3TAB2干扰素-IFN-(ug/mL)1.61 0.092.30 0.16#1.76 0.05*AB1TAKINIKKIBa图7 IL-17/NF-kB和TNF/NF-kB主要信号通路Fig.7Main signaling pathways of IL-17/NF-kB and TNF/NF-kBNF-xBVol.35欧贤等：基于数据挖掘和实验验证探究大黄素治疗脓毒症相关急性肾损伤的作用机制1429CLPTNF-IL-17ATRAF6NF-KBp65p-IxBaIxBaGAPDH13-1.5-ShamCLP+EMO17kDa18kDa58kDa65kDa39kDa39kDa36kDa1.5-15-1.5-1.0-KIdVD/D-AN0.51.0HIIVD/VLI-T0.5.00.51.00.5.0.0.0Fig.8 Effect of emodin on TNF-,IL-17A,TRAF6,and NF-kB signaling pathway proteins(x$,n=6)注：与Sham 组比较,P0.05,P0.01,#P0.0001;与 CLP组比较,*P0.05,*P0.01,*P0.001。No t e:Co mp a r e d w i t hSham group,#P0.05,#P0.01,#P0.0001;Compared with CLP group,*P0.05,*P0.01,*P0.001.3讨论与结论研究显示,导致 SA-AKI 的发病因素多且复杂，涉及炎症、微循环功能障碍和代谢重编程之间的相互作用,其病理生理学涉及多种细胞类型的损伤和功能障碍。在脓毒症发病过程中,细菌释放内毒素或内毒素样物质,致使机体中性粒细胞、单核巨噬细胞、血管内皮细胞等炎性细胞激活,释放出大量的内源性炎症介质进人血液循环中，一方面造成包括肾脏在内的多器官损害,另一方面又激活更多的炎性细胞参与发病,形成恶性的免疫网络反应7 。在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的 SA-AKI的 SD大鼠模型中,橙花叔醇通过抑制NF-kB和Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）信号通路减轻 SA-AKI8。T LR 4/NF-k B通路被证实参与肾脏炎症应答的过程,抑制TLR4/NF-kB介导的炎性反应对LPS诱导的AKI具有保护作用。可见,炎性反应是SA-AKI 发病的重要机制,抑制炎性反应通路是治疗脓毒症的一种重要的治疗方案,为临床上治疗 SA-AKI患者提供了新思路。本研究借助于生物数据库分析出包含了2 8 0 1个SA-AKI发病过程的关键靶点，对靶点KEGG分析结果表明共5条关键的炎症反应信号通路,其中TNF信号通路与IL-17信号通路排名靠前,并且NF-kB信号通路作为两者的枢纽共同参与SA-AKI发病进程。在TNF信号通路中,TNF-不仅是上游激活NF-kB信号的关键，同时又作为NF-kB信号通路0.0ShamCLPCL.P+EMO图8 大黄素对TNF-、I L-17 A、T R A F6 和NF-kB信号通路蛋白的影响（s,n=6)0.0ShamCLP.CLP+EMO0.0ShamCLPCLP+EMO的下游响应分子，提示其通过正反馈促进NF-kB信号通路,且二者相辅相成。在IL-17信号通路中,IL-17家族中IL-17A是主要的启动因子,Th17细胞是其主要分泌细胞。在 CLP诱导的模型中发现IL-17A在腹腔中的高表达,且在严重脓毒症后的炎症反应中起关键作用,并且通过中和腹腔中的IL-17A则能够减少促炎性细胞因子的产生9。同时有研究表明树突状细胞（dendritic cell,DC）中 Toll 样受体9(toll likereceptor9,TLR9）介导8 T细胞产生的IL-17A可能在SA-AKI 的发展中起关键作用10 ；另有研究表明敲除IL-17A可预防SA-AKI。上述表明 TNF-与IL-17A 是脓毒症的促炎因子,且 TNF信号通路与IL-17信号通路广泛参与脓毒症的发生发展过程中,与数据分析结果相吻合。而大黄素对脓毒症的治疗也已有较多研究,主要集中于脑、血液、心肌、肠道和肺组织。在脓毒症相关性脑病（sepsis-associated encephalopathy,SAE）,大黄素可以改善认知功能障碍和病理损伤,并且通过上调BDNF/TrkB信号抑制CLP诱导的小鼠炎症反应12 。在血液系统中,大黄素下调 P-选择素,改善脓毒症后期的血小板数量和聚集能力，同时改善内源性凝血因子活性和纤维蛋白原功能,发挥抗炎作用13。在脓毒症心肌病中,发现大黄素可以逆转脓毒症大鼠心功能不全并改善心肌状况，这可能与其抑制炎症小体的激活有关14。在脓毒症诱导肠损伤中,大黄素可以改善肠道黏膜损伤,表现为炎症0.0ShamCLPCLP+EMOShamCL.PCL.P+EMO1430因子和氧化应激标志物水平的降低，而其作用机制可能与VDR/Nrf2/HO-1通路有关 15;并通过提高紧密连接（tight junction,TJ)蛋白表达水平保护肠屏障完整性,抑制肠屏障通透性 6 。除改善肠道的炎症反应和屏障功能外,大黄素还能阻止大肠埃希菌的位移,防止细菌的扩散转移,减少细菌所引起的二次危害 16 。在脓毒症相关急性肺损伤中,大黄素可抑制NF-kB和高迁移率族蛋白B1（h i g h mo b i l i t ygroup box1,HMGB1)通路 17 ,从而减轻肺部氧化应激和炎症反应。另一项关于肺部的研究是基于自噬通路所探讨的,在大黄素的干预下可以有效的阻止急性肺损伤发病进程 18 。不仅如此,另有研究表明大黄素可通过调节水通道蛋白（aquaporin，A Q P）、TJ、炎症因子和肺细胞凋亡等途径有效减轻脓毒症急性肺损伤中的肺组织水肿【19 。大黄素对于SA-AKI的研究尚未报道,通过本研究发现CLP模型大鼠经过大黄素的治疗后,ELISA结果显示 TNF-、I L-17 和IFN-表达降低,这与大黄素抑制脓毒症炎症反应结果相一致。同样的对大黄素影响 Th17/Treg 炎症轴也已被阐述。在对急性胰腺炎的研究中发现,大黄素通过调节IFN/IL-17比例抑制严重急性胰腺炎免疫反应进而缓解肠屏障功能障碍 2 0 。而本研究发现在SA-AKI中,大黄素同样可以减少IL-17A 的表达,并且改善其炎症反应。综上所述,本研究通过数据挖掘,确立了大黄素发病过程的2 8 0 1个关键基因,GO生物过程分析提示这些靶点的生物学功能主要涉及膜信号转导、血管调节和伤口愈合。KEGG通路富集分析显示，TNF、I L-17、PI 3K-A k t、NF-k B和MAPK信号通路是富集与炎症相关的信号通路。实验验证大黄素治疗SA-AKI肾功能好转,且氧化应激水平（MDA）与炎性细胞因子（TNF-、IL-17 和 IFN-）水平降低,IL-17A、T NF-、T RA F6、NF-k Bp 6 5蛋白表达和IkB磷酸化水平与CLP组相比明显下降,这与数据分析结果相符。提示大黄素可改善大鼠SA-AKI,可能与IL-17/NF-kB和TNF/NF-kB信号通路有关。参考文献1 Gotts JE,Matthay MA.Sepsis:pathophysiology and clinicalmanagementJ.BMJ,2016,353:i1585.2de 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