健脾化湿方对右旋葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响.pdf
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1、 基金项目:海装军内科研重点项目(.)同为第一作者作者简介:徐张扬男研究方向:海洋生物医药:.蒋蓓尔女研究方向:海洋药学:.通信作者:何颖女博士研究员研究方向:航海环境健康维护与创新药物:.健脾化湿方对右旋葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响徐张扬蒋蓓尔张建刘光盛王杨凯闵天骄何颖(.海军特色医学中心海洋生物医药与极地医学研究室上海.海军军医大学基础医学院上海.海军军医大学研究生院上海)摘要:目的 研究健脾化湿方对右旋葡聚糖硫酸钠()诱导的溃疡性结肠炎()的作用及作用机制 方法 将/小鼠随机分为正常对照组、模型组、美沙拉嗪组及健脾化湿组 对照组给予正常饮用水其他组均自由饮用 水溶液连
2、续饮用 建立 小鼠动物模型造模第 天同步开始灌胃给药连续给药 每天记录小鼠体质量、大便性状及便血情况 药物干预治疗 后处死小鼠测量结肠长度取结肠进行 染色进行病理组织学检查 法检测小鼠结肠组织中的肿瘤坏死因子a(a)、白细胞介素()和白细胞介素()水平并通过 测序检测小鼠肠道菌群的变化 结果健脾化湿方给药后可有效缓解小鼠结肠炎症状降低结肠组织中炎症因子、和 的表达对 小鼠有较好的治疗效果菌群测序结果显示模型组小鼠与正常对照组相比肠道菌群多样性降低经健脾化湿方治疗后与模型组相比菌群多样性明显提高在门水平上主要表现为厚壁菌门和变形菌门显著降低拟杆菌门丰度增高属水平上主要表现为 增高和幽门螺杆菌降低
3、 结论 健脾化湿方可能通过改善和恢复菌群多样性调节 小鼠菌群组成从而发挥治疗 的作用关键词:健脾化湿方溃疡性结肠炎炎症因子肠道菌群中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):()()()./().a(a)()().药学研究 .().:溃疡性结肠炎()是一种慢性非 特 异 性 的 炎 症 性 肠 病()其临床症状主要以腹痛、腹泻和血便为主常伴有发热、肿胀、恶心、呕吐等症状 随着生活压力的增大以及饮食结构的改变该病在我国的发生率不断增高 的发病机制尚不明确涉及环境因素、遗传、免疫平衡失调及肠屏障缺陷等多个方面 近年来多项研究表明肠道微生物与机体免疫系统的平衡失调在 的发生发展中具有重要
4、作用 肠道微生物的组成差异不仅影响了肠上皮屏障的完整性且对肠道内各种代谢物的产生起重要作用 因此调控 患者紊乱的肠道微环境将成为治疗 的新型治疗手段目前 的临床治疗以西医为主主要包括糖皮质激素、氨基水杨酸类药物和免疫抑制剂等但这类药物长期使用具有明显的毒副作用且疗效不尽人意 近年来中医药治疗 效果显著不良反应较少且复发率低 本研究基于中医基础理论认为 的病机多为本虚标实以脾虚、肾虚为本湿热为标 因此参考王长洪教授提出的治疗 的学术思想即温中健脾、清热祛湿和活血化瘀自拟了由山药、焦山楂、陈皮、炒薏苡仁四味药食同源的中药组成的具有健脾止泻、缓解胃肠功能紊乱的健脾化湿方探究其对 的治疗效果并通过 测
5、序技术研究其对 小鼠肠道菌群的影响为健脾化湿方治疗 的合理使用提供参考 材料与方法.实验动物 实验动物 级/雄性小鼠 只 周龄体重 上海灵畅生物科技有限公司许可证号为(沪)饲养于海军特色医学中心实验动物中心许可证号为(沪)温度 相对湿度 试验前小鼠正常饮食、饮水适应性喂养 本研究中所有动物实验均经过海军特色医学中心动物伦理实验委员会批准实施.药品与试剂 葡聚糖硫酸钠()(美国 公司批号:)试剂盒(批号:)、试剂盒(批号:)、试剂盒(批号:)均上海百舰生物科技有限公司美沙拉嗪缓释颗粒(上海爱的发制药)健脾化湿方:山药 、焦山楂 、陈皮 和炒薏苡仁 组成由北京康仁堂药业制备成健脾化湿方免煎颗粒相当
6、于含生药.主要仪器与设备 高速冷冻离心机(美国 公司)生物显微镜(德国 公司)全自动酶标仪(美国 公司)实时荧光定量(美国 公司)超微量分光光度计(美国 公司).方法.动物分组及给药 将 只/小鼠随机分为 组每组 只分别为正常对照组、模型组、美沙拉嗪组()和健脾化湿组()各组小鼠适应性喂养 后正常对照组给予正常饮用水其余 组替换成含 的饮用水自由饮用 诱导小鼠 模型第 天均给予正常饮用水 自造模第 天起同步进行灌胃给药正常对照组和模型组每天给予.生理盐水其他各组每天给予.相应药物溶液每天给药 次连续给药 每日观察并记录实验小鼠的一般情况、体质量、摄食量和饮水量以及大便性状和便血情况(见表).样
7、本采集与处理 于实验第 天采用颈椎脱臼法处死所有小鼠分离整段结肠测量各组小鼠结肠长度并进行统计学分析 纵行剖开整段结肠取结肠内粪便颗粒(粒)于冻存管中迅速放入液氮内并于 冰箱保存 用预冷 多次冲洗结肠组织 取各组小鼠相同位置的结肠组织(药学研究 .)放入 倍体积的 多聚甲醛溶液中室温静置 进行固定 另取 结肠组织于 管加入 倍体积生理盐水匀浆静置离心后取上清液于 冰箱保存表 粪便状态和便血情况评分评分粪便状态便血情况正常阴性介于两者之间介于两者之间半稀便隐血介于两者之间介于两者之间稀便肉眼便血.结肠组织病理形态学分析 取 多聚甲醛溶液固定后的结肠组织进行常规的石蜡包埋、切片、染色在光学显微镜下
8、观察各组小鼠结肠组织的形态学变化(见表)表 病理学组织评分评分溃疡形成上皮细胞变化炎性浸润淋巴结形成无溃疡正常无无 个溃疡杯状细胞缺失隐窝周围炎性浸润 个淋巴结形成 个溃疡杯状细胞大面积缺失黏膜肌层出现浸润 个淋巴结形成 个溃疡隐窝缺失黏膜肌层普遍浸润 个淋巴结形成 个溃疡隐窝大面积缺失或息肉状再生黏膜下层浸润 个淋巴结形成.结肠组织中炎症因子检测取低温保存的结肠组织匀浆上清液快速复苏并按 试剂盒方法检测各组小鼠炎症因子、和 水平.粪便中细菌 的提取及检测 用.试剂盒提取粪便中的总 用紫外分光光度计检测 的浓度并通过 的琼脂糖凝胶电泳检测 提取质量.扩增和产物回收 以细菌 的 可变区序列为靶标
9、使用带 序列的特异引物()进行 扩增获得 产物并用 琼脂糖凝胶回收 产物.文库构建和高通量测序通过 生物分析仪(美国)和(美国)的文库定量试剂盒分别评估扩增子文库的大小和数量 在 平台上对库进行排序.统计学分析 使用 和 软件进行统计分析并制图 其中体重下降率采用两因素重复测量资料的方差分析粪便黏稠度和便血程度采用非参数检验克鲁斯卡尔沃利斯检验()多组间均数比较采用单因素方差分析并使用图基检验()进行事后检验 肠道菌群样本结构差异分析采用主坐标分析()、相似性分析()和置换多元方差分析()进行组间差异检验 以.为差异具有统计学意义 结果.小鼠一般体征情况如图 所示正常对照组小鼠状态良好摄食和饮
10、水正常体重没有明显变化模型组自造模开始后摄食饮水逐日减少活动能力下降毛色黯淡无光泽从造模第 天起体重下降较正常对照组有统计学意义(.)美沙拉嗪组和健脾化湿组小鼠体重也有一定的降低但下降幅度小于模型组于第 天起同模型组比较呈显著性差异(.)造模第 天开始模型组小鼠排便次数增加出现软便、稀水样便等情况第 天出现粪便隐血、脓血便等情况两个给药小鼠组同样也出现水便、血便等症状但症状均轻于模型组 因此健脾化湿方能有效改善实验小鼠结肠炎症状.体重变化量.平均粪便黏稠度评分.平均便血程度评分图 健脾化湿方对 诱导的 小鼠的影响()注:与模型组相比.与正常对照组相比.药学研究 .小鼠结肠长度变化 如图 所示与
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