甲状腺穿刺物BRAF V600E突变检测联合细胞学诊断在诊断甲状腺癌中的意义.pdf

2023 年 4 月第 45 卷第 2 期农垦医学Journal of Nongken MedicineApr.2023Vol.45No.2甲状腺穿刺物 BRAF V600E 突变检测联合细胞学诊断在诊断甲状腺癌中的意义陈凤姣1周子爽2姚永坤1俞雪燕2罗成华1,2姜鑫2卢香云1,2（1.石河子大学第一附属医院，新疆石河子，832008；2.石河子大学医学院，新疆石河子，832002）【摘要】目的：探讨利用甲状腺穿刺物行 BRAF V600E 基因突变检测的可行性及联合细胞学诊断在甲状腺癌诊断中的价值。方法：回顾性收集 2022 年 1 月至 2022 年 7 月符合纳入标准的标本 114 例，具有完整的细胞学诊断、BRAF V600E 突变检测及术后组织诊断结果，分析 BRAF V600E 基因突变与一般临床特点的关系及 BRAFV600E 基因突变检测与细胞学诊断联合诊断甲状腺癌的可行性。结果：114 例甲状腺穿刺标本中有 70 例（61.4%）出现 BRAF V600E 基因突变；BRAF V600E 基因突变率在年龄60 岁患者中明显高于60 岁患者，差异有统计学意义（圆=8.863，0.05）；BRAF V600E 基因突变率在细胞学诊断不同类别标本中，差异有统计学意义（圆=52.671，0.001）；BRAF V600E 基因突变检测联合细胞学诊断，诊断甲状腺癌的敏感性由 85.33%提高至 94.67%，诊断准确度由 85.09%升高至 91.23%。结论：甲状腺穿刺物 BRAF V600E 基因突变检测联合甲状腺穿刺细胞学诊断可提高甲状腺癌诊断的灵敏度和准确度，有助于术前明确甲状腺结节的良恶性。【关键词】BRAF V600E 基因突变；甲状腺癌；细胞学诊断中图分类号：R653文献标识码：AClinical Significance of Thyroid Aspirate BRAF V600E Mutation DetectionCombined with Cytological Diagnosis in the Diagnosis ofThyroid CancerCHEN Feng-jiao1,ZHOU Zi-shuang2,YAO Yong-kun1,YU Xue-yan2,LUO Cheng-hua1,2,JIANG Xin2,LU Xiang-yun1,2（1.The First Affiliated Hospital of Shihezi University,Xinjiang Shihezi,832008;2.Shihezi Univerisity School ofMedicine,Xinjiang Shihezi,832002）【Abstract】Objective:To investigate the feasibility of detecting BRAF V600E gene mutation by thyroidpuncture and the value of combined cytological diagnosis in the diagnosis of thyroid cancer.Methods:114 specimensthat met the inclusion criteria from January 2022 to July 2022 were retrospectively collected,with completecytological diagnosis,BRAF V600E mutation detection and postoperative tissue diagnosis.Then,the relationshipbetween BRAF V600E gene mutation and general clinical characteristics,and the feasibility of BRAF V600E genemutation detection combined with cytological diagnosis in the diagnosis of thyroid cancer were analyzed.Results:Among 114 thyroid puncture specimens,Seventy patients had BRAF V600E mutation(61.4%).The mutation rate ofBRAF V600E gene in patients aged60 years was significantly higher than that in patients aged60 years,andthe difference was statistically significant(圆=8.863,0.05).Meanwhile,the mutation rate of BRAF V600E gene incytological diagnosis of different types of specimens had statistical significance(圆=52.671,0.001).Moreover,BRAFV600E mutation detection combined with cytology diagnosis increased the sensitivity of thyroid cancer diagnosis from85.33%to 94.67%,and the diagnostic accuracy from 85.09%to 91.23%.Conclusion:The detection of BRAFV600E gene mutation in thyroid aspirates combined with cytological diagnosis of thyroid aspirates can improve the基金项目：石河子大学自主资助支持校级科研立项项目（ZZZC202133）。通讯作者：卢香云，女，讲师/住院医师，从事临床病理学研究。97 第 2 期农垦医学第 45 卷近几年甲状腺癌的发病率逐年升高，最新的流行病学调查显示，2020 年全球有 56.7 万例甲状腺癌，发病率排第九位1。甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，其预后较好，尤其早诊断、早治疗对甲状腺癌患者的预后有重要意义2，3。BRAF 基因是人类恶性肿瘤中最常突变的蛋白激酶基因之一，位于 15 号外显子中的 T1779A 点突变导致V600E 氨基酸替换是最常见的突变，占 BRAF 基因中所有突变的 90%以上4。研究发现，BRAF V600E基因是甲状腺癌（Thyroid Cancer，TC）最常见的分子标志物，与 TC 的发生、发展密切相关5。甲状腺细针穿刺细胞学检查（Fine Needle Aspiration Cytology，FNAC）是一种微创性的检查诊断技术，取少许细胞进行涂片，即可明确甲状腺结节性质。近几年 FNAC在甲状腺肿瘤患者诊断中的运用较为广泛，其为甲状腺疾病的精准化、个性化治疗提供依据，本研究探讨 BRAF V600E 基因突变联合 FNAC 在甲状腺癌诊断中的意义。1对象与方法1.1 研究对象根据纳入排除标准选取 2022 年 1 月-2022 年7 月于我院因甲状腺结节行细针穿刺细胞学检查、细针穿刺物行 BRAF V600E 基因突变检测，同时后期进行甲状腺治疗手术的患者 114 例，收集患者有关临床病理资料。1.2 纳入及排除标准纳入标准：2022 年 1 月-2022 年 7 月于我院因甲状腺结节行细针穿刺细胞学检查、细针穿刺物行BRAF V600E 基因突变检测同时行择期甲状腺治疗根治手术的患者；年龄 1880 岁；未接受过手术、放化疗、激素治疗或合并其他恶性肿瘤；手术标本诊断明确。排除标准：曾因甲状腺疾病行手术治疗、放射治疗史、化疗史或合并其他恶性肿瘤史；年龄小于18 岁；妊娠或哺乳期；临床或病理学资料缺项；手术标本诊断不明确。1.3 研究方法1.3.1 标本制备超声定位穿刺结节，临床医师在超声引导下，用细针穿刺定位结节，穿刺的新鲜细胞穿刺液制作涂片，部分穿刺液置于 1.5mL 备有200滋L DTL 裂解液的离心管中，标记患者信息；与申请单一起送病理科，涂片置于 95%酒精中固定，H 染色，离心管中标本放 4保存，不超过 72h。甲状腺手术治疗标本均进行中性福尔马林固定，脱蜡至脱水固定，HE 染色。1.3.2 甲状腺穿刺细胞学诊断及手术标本诊断甲状腺穿刺细胞学诊断由高年级病理诊断医师按照Bethesda 分类系统进行诊断，诊断结果：标本无法诊断或不满意 I、良性病变 II、非典型病变或滤泡性病变 III、滤泡性肿瘤 IV、可疑恶性 V、恶性肿瘤 VI 6个分级。甲状腺手术治疗标本由两名病理诊断医师诊断，至少一名为高年级病理诊断医师，均进行免疫组化辅助诊断，诊断结果明确。1.3.3 BRAF V600E 基因突变检测及判断BRAFV600E 点突变检测采用北京雅康博人 BRAF 基因突变检测试剂盒，严格按照试剂盒操作说明书进行操作，行荧光定量 PCR 检测。严格按照试剂盒说明书进行 PCR 扩增。检测仪器为 7500 Fast Re-al-Time PCR system，采用荧光定量 PCR 检测方法检测样品。当检测样品中，突变位点检测显示（FAM 通道）有扩增且 Ct 值36，为突变型；若突变点检测显示无扩增或 Ct 值38，则为野生型；若突变点检测 36Ct 值38，为疑似突变型，需重复实验，若 Ct 值仍在此范围内，则为疑似突变型。1.4 统计学方法采用 SPSS25.0 软件进行统计学分析。计数资料以 n（%）表示，年龄、性别 BRAF V600E 基因突变率比较采用2检验；不同细胞学诊断间 BRAFV600E 基因突变率比较采用横列表2检验；0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1 BRAF V600E 突变检测结果与患者一般临床特征比较根据 BRAF V600E 基因扩增曲线，114 例患者甲状腺穿刺标本中，44 例为 BRAF V600E 野生型（38.60%），70 例 BRAF V600E 突变（61.40%），见图sensitivity and accuracy of thyroid cancer diagnosis and help to determine the benign and malignant thyroid nodulesbefore surgery.【Key words】BRAF V600E gene mutation;Thyroid carcinoma;Cytological diagnosis 98 2023 年 4 月第 45 卷第 2 期农垦医学Journal of Nongken MedicineApr.2023Vol.45No.21。患者年龄60 岁 BRAF V600E 基因突变率明显高于患者年龄60 岁，差异有统计学意义（圆=8.863，0.05）；BRAF V600E 基因突变率在细胞学诊断的不同类别标本中不同，差异有统计学意义（圆=52.671，0.001），其中细胞学诊断恶性病变VI 标本中 BRAF V600E 基因突变率最高 91.43%，良性病变 II 标本中 BRAF V600E 基因突变率最低21.21%。见表 1。图 1BRAF V600E 结果判读2.2 BRAF V600E 基因突变检测与细胞学诊断和术后病理诊断结果术后病理诊断为恶性肿瘤的 75 例，64 例有BRAF V600E 基因突变，其中细胞学诊断 Bethesda分类中，良性病变 II 中，5 例确诊恶性肿瘤，均有BRAF V600E 基因突变；非典型病变 III 中，12 例诊断为恶性肿瘤，8 例 BRAF V600E 基因突变；滤泡性肿瘤 IV 中有 2 例诊断为恶性肿瘤，2 例均有BRAF V600E 基因突变；可疑恶性 V 中有 22 例诊断为恶性，18 例有 BRAF V600E 基因突变；恶性病变 VI 中 34 例诊断恶性，31 例 BRAF V600E 基因突变。见表 2。表 1BRAF V600E 突变检测结果与患者一般临床特征比较BRAF V600E 临床特征 n 野生型(%)突变型(%)2/Z P 性别 2.573 0.109 男 35 10(28.57)25(71.43)女 79 34(43.04)45(59.96)年龄（岁）8.863 0.003 60 87 27(31.03)60(68.97)60 27 17(62.96)10(37.04)细胞学诊断 52.671 0.001 良性病变II 33 26(78.79)7(21.21)非典型病变III 20 10(50.00)10(50.00)滤泡性肿瘤IV 3 1(33.33)2(66.67)可疑恶性V 23 4(17.40)19(82.61)恶性病变VI 35 3(8.57)32(91.43)表 2BRAF V600E 基因检测与细胞学诊断和术后病理诊断术后诊断良性 术后诊断恶性 Bethesda分类 n BRAF V600E野生型 BRAF V600E突变型 BRAF V600E野生型 BRAF V600E突变型 良性病变II 33 26 2 0 5 非典型病变III 20 6 2 4 8 滤泡性肿瘤IV 3 1 0 0 2 可疑恶性V 23 0 1 4 18 恶性病变VI 35 0 1 3 31 合计 114 33 6 11 64 99 第 2 期农垦医学第 45 卷2.3BRAF V600E 基因突变检测诊断、细胞学诊断及两者联合诊断BRAF V600E 基因突变检测和细胞学诊断 TC的敏感性分别为 85.33%和 74.67%，特异性分别为84.62%和 94.87%，诊断准确度分别为 85.09%和81.58%。两检测方法联合诊断，诊断 TC 的敏感性提高为 94.67%，特异性为 84.62，诊断的准确度明显提高为 91.23%，见表 3。方法灵敏度特异性阳性预测值阴性预测值准确度BRAF V600E突变检测85.33(64/75）84.62(33/39)91.43(64/70)75.00(33/44)85.09(97/114)细胞学诊断74.67(56/75)94.87(37/39)96.55(56/58)66.07(37/56)81.58(93/114)两者联合诊断94.67(71/75)84.62(33/39)92.21(71/77)89.19(33/37)91.23(104/114)表 3BRAF V600E 基因突变检测诊断、细胞学诊断及两者联合诊断%(n/n)3讨论近年来，随着彩色超声多普勒检查的普及和其在甲状腺结节诊断中的应用，TC 检出率明显增高，使其发病率呈逐年上升趋势6,7。虽 TC 预后较好，但术后复发率和死亡率也呈上升趋势。甲状腺 FNAC细胞学诊断具有微创、经济、准确度高等优势，使其成为术前诊断甲状腺结节良恶性最常用的检测方法。本研究中甲状腺穿刺细胞学诊断的准确度为81.58%，与卢振启等8、夏苇等9报道一致。由于新鲜穿刺液进行细胞制片不当、细胞量少、细胞形态不典型或病理诊断医师诊断经验差异等因素，单独采用FNAC 细胞学诊断 TC 的假阳性率为 5.41%，假阴性率为 25.33%。尤其对于细胞学诊断中非典型病变III、滤泡性肿瘤 IV 患者的诊断是临床诊治的难点。研究发现，在我国 TC 患者中，尤其是甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Carcinoma，PTC）BRAF V600E基因突变的检测率逐年升高10,11。BRAF V600E 基因突变，即第 1779 的胸腺嘧啶突变为腺嘌呤，引起第600 位编码的缬氨酸变成谷氨酸，使 BRAF 蛋白激活，进一步激活下游 MAPK 信号通路，导致 TC 的发生、发展，且与 TC 转移和复发密切相关12-14。研究表明，BRAF V600E 基因突变在甲状腺良性病变较少，因此为 TC 诊断提供了新的思路15,16。本研究中患者甲状腺穿刺标本中有 61.40%出现 BRAF V600E突变，BRAF V600E 突变在年龄60 岁和60 岁间差异有统计学意义。同时在细胞学诊断不同类别标本的 BRAF V600E 基因突变率不同，差异有统计学意义，该研究结果与国内外文献报道相符9,17,18。同时，进一步分析 TC 患者中 BRAF V600E 基因的突变率，结果为 85.33，与张哲等19、张亚丽等20研究结果相符，因此，BRAF V600E 突变检测成为术前细胞学诊断外，诊断甲状腺结节良恶性的有效方法。BRAF V600E 基因突变检测联合细胞学诊断，诊断 TC 的敏感性由 85.33%提高至 94.67%，诊断准确度由 85.09%升高至 91.23%，阴性预测值由75.00%提高至 89.19%，与 Zhao C K 等21研究结果一致。临床普遍认为 BRAF V600E 基因突变患者患甲状腺癌的风险更高，常建议患者行甲状腺结节切除术，本研究结果显示，对于 BRAF V600E 基因野生型患者仍不可排除甲状腺癌的可能。两者联合诊断后，诊断灵敏度有较大提高，但诊断特异性降低，也意味着有一定的患者可能会出现误诊。但两者联合诊断的准确度明显高于单一诊断方法，因此，两者联合诊断优于单一方法诊断。此外，对细胞学诊断为非典型病变和滤泡性肿瘤患者，临床是否需要对其进行手术治疗，常存在一定争议。本研究结果显示，对于细胞形态病变不典型，细胞学诊断为非典型病变和滤泡性肿瘤的 TC 患者，常伴有 BRAFV600E 基因突变。因此，BRAF V600E 基因突变联合细胞学诊断有助于术前明确甲状腺结节的良恶性，指导临床制定治疗计划，减少不必要的检查和治疗。综上所述，甲状腺穿刺液进行 BRAF V600E 突变检测可最大限度地利用细针穿刺液提供更多的诊断 TC 的信息，联合甲状腺穿刺细胞学检查为临床医师制定具体的诊疗方案提供更多的依据。但本研究也存在一些不足，样本量不够大，可能会引起一定的偏移，条件允许可扩大样本量进一步研究。参考文献：1Sung H,Ferlay J,Siegel R L,et al.Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwidefor 36 Cancers in 185 CountriesJ.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-2492Baek H S,Jeong C H,Ha J,et al.Cost-Effectiveness Analysis ofActive Surveillance Compared to Early（下转第 132 页）100 第 2 期农垦医学第 45 卷（上接第 100页）Surgery in Small Papillary Thyroid Cancer:ASystemic ReviewJ.Cancer Manag Res,2021,13:6721-67303姜涛,张琴.二维超声评分法联合超声造影在甲状腺结节良恶性鉴别诊断中的应用效果J.农垦医学,2019,41(04):339-3414Li P,Zhao H,Liu X,et al.Clinical Significance of PEAK1 Expr-ession and BRAF V600E Mutation in Papillary Thyroid CancerJ.Br J Biomed Sci,2022,79:10268-102745Han Y,Hou L,Zhao B,et al.Risk Factors for Neck Nodal Meta-stasis in Papillary Thyroid Cancer With BRAF V600E Mutati-onJ.Front Endocrinol(Lausanne),2022,13:884428-8842406田猛,吴秀艳,蔡雪珍,等.甲状腺结节超声恶性危险分层中国指南(C-TIRADS)对甲状腺乳头状癌的诊断价值J.解放军医学院学报,2022,(43):1-77代豹,牛建华,杨婕,等.甲状腺钙化及临床病理特征与甲状腺结节关系J.农垦医学,2022,44(2):102-1078卢振启,龚文博,黑虎,等.BRAF V600E 基因检测联合细针穿刺活检对甲状腺结节良恶性诊断中的价值J.中国肿瘤临床,2019,46(20):1036-10399夏苇,苏新良,张阳丽,等.甲状腺细针穿刺残留物标本 BRAFV600E 突变检测联合细胞学诊断在甲状腺乳头状癌中的诊断价值J.检验医学与临床,2021,18(17):2497-250010倪烨钦,荀延萍,赵盼,等.BRAF-V600E 突变比值在预测甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移中的临床价值J.国际耳鼻咽喉头颈外科杂志,2020,44(1):6-1011Tao Y,Wang F,Shen X,et al.BRAF V600E Status Sharply Diff-erentiates Lymph Node Metastasis-associated Mortality Risk inPapillary Thyroid CancerJ.J Clin Endocrinol Metab,2021,106(11):3228-323812Yarchoan M,Livolsi V A,Brose M S.BRAF mutation and thyro-id cancer recurrenceJ.J Clin Oncol,2015,33(1):7-813Enumah S,Fingeret A,Parangi S,et al.BRAF(V600E)Mutation isAssociated with an Increased Risk of Papillary Thyroid CancerRecurrenceJ.World J Surg,2020,44(8):2685-269114Pappa T,Ahmadi S,Marqusee E,et al.Oncogenic Mutations inPI3K/AKT/mTORPathwayEffectorsAssociatewithWorsePrognosis in BRAF(V600E)-Driven Papillary Thyroid CancerPatientsJ.Clin Cancer Res,2021,27(15):4256-426415Huang Y,Qu S,Zhu G,et al.BRAF V600E Mutation-AssistedRisk Stratification of Solitary Intrathyroidal Papillary ThyroidCancer for Precision TreatmentJ.J Natl Cancer Inst,2018,110(4):362-37016Krishnamurthy A,Ramshankar V,Murherkar K,et al.Role and r-elevance of BRAFmutations inriskstratifying patientsofpapillary thyroid cancers along with a review of literatureJ.Indian J Cancer,2017,54(1):372-37817Niederer-Wust S M,Jochum W,Forbs D,et al.Impact of clinicalrisk scores and BRAF V600E mutation status on outcome inpapillary thyroid cancerJ.Surgery,2015,157(1):119-12518Fernandez I J,Piccin O,Sciascia S,et al.Clinical significance ofBRAF mutation in thyroid papillary cancerJ.Otolaryngol HeadNeck Surg,2013,148(6):919-92519张哲佟,凌霞,李朝军,等.甲状腺乳头状癌病理特征与 BRAFV600E 基因突变的相关性J.实用癌症杂志,2020,35(8):1246-124820张亚丽,王冬青,张贺,等.大样本评价 BRAF V600E 基因检测在甲状腺细胞学诊断中的价值J.中华病理学杂志,2020,49(2):186-18821Zhao C K,Zheng J Y,Sun L P,et al.BRAF(V600E)mutationanalysisinfine-needleaspirationcytologyspecimensfordiagnosis of thyroid nodules:The influence of false-positive andfalse-negativeresultsJ.Cancer Med,2019,8(12):5577-5589收稿日期：2023-03-05id and ascorbic acid in protection against EAEJ.Free RadicalBiology and Medicine,2002,33(10):1363-137133HUANG S,WANG J,FAN D,et al.The association of serum uricacid with cognitive impairment and ATN biomarkers J.FrontAging Neurosci,2022,14:e94338034OWENS D,DAVIDSON K,KRIST A,et al.Screening for Cognit-ive Impairment in Older Adults:US Preventive Services TaskForce Recommendation StatementJ.JAMA,2020,323(8):757-76335S k俟c俟 SN,zdemr C,Aydin,et al.Uric acid as a marker ofseverity of obstructive sleep apnoea syndrome in older patientsJ.Arq Neuropsiquiatr,2020,78(12):783-788收稿日期：2023-03-10 132