基于共价固定法构筑DNA生物传感器的研究.pdf

<p>基于共价固定法构筑D N A 生物传感器的研究摘要本论文分三部分，第一、第二部分利用溶胶一凝胶自组装法和偶氮化法共价固定N H z-s s D N A，研制了两种新型的D N A 传感器；第三部分是在第二部分的基础上，在电极表面共价固定硫堇分子，制备了一种无酶无试剂型过氧化氢传感器。1、本章讨论了基于溶胶一凝胶自组装技术共价固定探针s s D N A，制备了新型D N A 电化学生物传感器。通过两种硅烷3 巯基丙基三甲氧基硅烷(M P T M S)和丫环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(G P T M S)之间的水解、缩合，形成具有S i O S i结构的溶胶一凝胶膜。利用G P T M S 的环氧基团与N H 2 D N A(S I)的反应性，可实现对探针s s D N A 的共价固定化。该新型D N A 生物传感器具有高的灵敏度和良好的再生性，对目标s s D N A 测定的线性范围为2 5 l 1 0 一5 0 2 1 0 M，相关系数为0 9 9 8 5，检测限为8 5 7 1 0 叫u M。2、本章基于偶氮化反应共价固定探针s s D N A，制备了一种新型D N A 电化学生物传感器。4 氨基苯硫酚(4 A T P)通过巯基与A u 电极之间形成A u S 键，在A u 电极表面自组装4-A T P，利用4-A T P 的-N H 2 直接进行偶氮反应，形成偶氮A T P 膜，通过偶联反应实现探针N H 2-s s D N A(S 1)的共价固定，在电极表面形成的偶氮A T P 膜具有很强的导电性。对目标s s D N A 的检测范围为1 5 7X1 0 一4 5 2X1 0 M，检测限为3 2 6 1 0。1 0M。该新型D N A 传感器制备方法简便，而且具有良好的重现性和再生性。3、本章在上述工作的基础上，基于偶氮化反应共价固定硫堇(T h)，研究了一种制备无酶无试剂型H 2 0 2 生物传感器的简便方法。利用偶氮A T P 膜具有很强的导电性，偶氮基可与T h 进行偶联反应，从而在电极表面对T h 实现共价固定，建立了新型无酶无试剂H 2 0 2 生物传感器。基于传感器对H 2 0 2 具有良好的电催化行为，测定H 2 0 2 的线性范围为1 0 1 0 一6 3 7 5X1 0 M，检测限为6 7 1 0 M。该传感器具有良好的重现性和稳定性。关键词：D N A 生物传感器，溶胶一凝胶，偶氮化，共价固定D E V E L O P M 匝N TO FN O V E LD N AB 1 0 S E N S O RB A S E DO NC O V A L E N TI M M O BI L I Z A T I O NA BS T R A C TT h e r ea r et h r e ep a r t si n t h i st h e s i s T w on e wa n ds i m p l es t r a t e g i e sw e r ee s t a b l i s h e df o rf a b r i c a t i n go fd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d(D N A)e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rb a s e do nc o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o no fp r o b eN H 2-s s D N Ab ys o l-g e lc o u p l i n g(t h ef i r s tc h a p t e(a n dd i a z o t i z a t i o n,c o u p l i n g(t h es e c o n dc h a p t e r)Ar e a g e n t l e s sH 2 0 2b i o s e n s o r sw a sa l s of a b r i c a t e db a s e do nc o v a l e n tj L m m o b i l i z a t i o no fT h i o n i n ei nt h et h i r dp a r t 1 An e wp r o c e d u r ef o rf a b r i c a t i n gD N Ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rw a sd e v e l o p e db a s e do nc o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o no ft a r g e ts s D N Ao nA ue l e c t r o d et h a th a db e e nf u n c t i o n a l i z e db yd i r e c tc o u p l i n go fs o l-g e la n ds e l f-a s s e m b l e dt e c h n o l o g i e s T w os i l o x a n e s，3-m e r c a p t o p r o p y l t r i me t h o x y s i l o x a n e(M P T M S)a n d3-g l y c i d o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l o x a n e(G P T M S)w e r eu s e da sp r e c u r s o r st Op r e p a r ef u n c t i o n a l l ys e l f-a s s e m b l ys o l-g e lf i l mo nA ue l e c t r o d e T h et h i o lg r o u po fM P T M Sa l l o w e da s s e m b l yo fM P T M Ss o l g e lo ng o l de l e c t r o d es u r f a c e T h r o u g hC O c o n d e n s a t i o nb e t w e e ns i l a n o l s,，G P T M Ss o l-g e lw i t he p o x i d eg r o u p si n t e r c o n n e c t e dj n t oM P T M Ss o l-g e la n de n a b l e dc o v a l e n ti m m o b i f i z a t i o no ft a r g e tN H 2 一-s s D N At h r o u g he p o x i d e a m i n ec o u p l i n gr e a c t i o n T h ec o n c e n t r a t i o no fM P T M Sa n dG P T M Si n f l u e n c e dt h ep e r f o r m a n c eo ft h er e s u l t i n gb i o s e n s o rd u et Oc o m p e t i t iv es o l-g e lp r o c e s s。T h ef i n e a rr a n g eo ft h ed e v e l o p e db i o s e n s o rf o rd e t e r m i n a t i o no fc o m p l e m e n t a r ys s D N Aw a sf r o m2 51 10 9t o5 0 2 10 7 Mw i t had e t e c t i o nl i m i to f8 5 7x10 一l oM T h ef a b r i c a t e db i o s e n s o rp o s s e s s e dg o o ds e l e c t i v i t ya n dc o u l db er e g e n e r a t e d 2 An o v e la n ds i m p l es t r a t e g yf o rf a b r i c a t i n go fD N Ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rW a sd e v e l o p e db a s e do nc o v a l e n tc o u p li n go fp r o b eN H 2 一s s D N A(SI)o nA ue l e c t r o d et h a th a db e e nf u n c t i o n a l i z e db yd i a z o t i z a t i o no fa s s e m b l e d4-a n l i n o t h i o p h e n o l(4 一A T P)m o n o l a y e r T h et h i o lg r o u po f4-A T Pa l l o w e dt h es t a b l ea s s e m b l yo f4-A T PI Im o n o l a y e r T h ef o l l o w i n gd i a z o t i z a t i o nr e a c t i o nw a sd i r e c t l yp e r f o r m e dt op r e p a r ef u n c t i o n a ld i a z o-A T Pf i l mf o rc o v a l e n tc o u p l i n go fp r o b eS1 R e m a r k a b l y,i tw a sn o t i n gt h a tt h ed i a z o-A T Pp r o v i d e das u r f a c ew i t hh i g hc o n d u c t i b i l i t yf o re l e c t r o nt r a n s f e r T h ec o m p l e m e n t a r ys s D N AW a sd e t e r m i n e db yu s i n gd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y T h el i n e a rr a n g eo ft h ed e v e l o p e db i o s e n s o rw a sf r o m1 5 7 10。9t o4 5 2l0。7Mw i t had e t e c t i o nl i m i to f3 2 6 10 1 0M T h ef a b r i c a t e db i o s e n s o rp o s s e s s e dg o o ds e l e c t i v i t ya n dc o u l db er e g e n e r a t e d T h ec o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o no fp r o b eSjb ys i m p l ed i a z o f i z a t o n-c o u p l i n gO i ls e l f-a s s e m b l e d4-A T Pm o n o l a y e rc o u l ds e r v ea sav e r s a t i l ep l a t f o r mf o rD N Ai m m o b i l i z a t i o na n db i o s e n s o r sf a b r i c a t i n g 3。As i m p l es t r a t e g yf o rf a b r i c a t i n go fan o n e n z y m ea n dr e a g e n t l e s sH 2 0 2e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rW a sd e v e l o p e db a s e do nc o v a l e n tc o u p l i n go fT h i o n i n e(T h)o nA ue l e c t r o d et h a th a db e e nf u n c t i o n a l i z e db yd i a z o t i z a t i o no fa s s e m b l e d4-a m i n o t h i o p h e n o l(4 一A T P)m o n o l a y e r T h et h i o lg r o u po f4-A T Pa l l o w e dt h es t a b l ea s s e m b l yo f4-A T Pm o n o l a y e r T h ef o l l o w i n gd i a z o t i z a t i o nr e a c t i o nw a sd i r e c t l yp e r f o r m e dt op r e p a r ef u n c t i o n a ld i a z o-A T Pf i l mf o rc o v a l e n tc o u p l i n go fT h T hc o v a l e n t l yi m m o b i l i z e do nt h ed i a z o A T Pf i l mp o s s e s s e dh i g he l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yt oH 2 0 2a n dp r o v i d e daf a s ta m p e r o m e t r i cr e s p o n s e T h el i n e a rr e s p o n s eo ft h ea s p r e p a r e db i o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fH 2 0 2r a n g e df r o m1 0 10。0t O6 37 5 l0 _ 3Mw i t had e t e c t i o nl i m i to f6 7 1x1 0 M T h ef a b r i c a t e db i o s e n s o rp o s s e s s e dh i 吐s t a b i l i t y K E YW o R D S：D N Ab i o s e n s o r，s o l-g e l，d i a z o t i z a t i o n，c o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o n1 l l青岛科技人学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。本人签名：签字同期：汐譬年乡月6H关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本入离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)本学位论文属于：保密口，在年解密后适用于本声明。不保密口。本人签名：导师繇李峙5 9，6，f、月月艿广9年年御砷期期字字签签青岛科技火学研究生学位论文第一章引言核酸是生物体内一类含有磷酸基团的重要的生物大分子，担负着生命信息的储存和传递，是生命化学研究中一个重要领域。脱氧核糖核酸(D e o x y r i b o n u c l e i cA c i d，D N A)是核酸的一种，遗传信息的承载者，具有储存和传递信息的功能，D N A 的复制构成了遗传分子基础，也是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。D N A 是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与R N A 所需。带有遗传讯息的D N A 片段称为基因，其他的D N A 序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现它是主要的遗传物质，是遗传信息的载体，具有贮存和传递信息的功能，对它的研究在生命科学中具有重要的意义。1 9 5 3 年W a t s o n 和C l a r k 发现生物遗传分子D N A 的双螺旋结构，建立生物遗传基因的分子机理，有关D N A 分子的识别、测序一直为人们所关注研究D N A 的结构和功能，从分子水平上了解生命现象的本质，解释药物的作用机理。人类的许多遗传疾病与其D N A 序列不同程度的变异有关。基因突变、癌变以及老化过程都可能涉及到D N A 的碱基损伤，因此对D N A 的研究是现代生物学、医学和生命科学的重要课题之一【2】。对D N A 常见的分析方法有电化学法、荧光光度法、光散射技术及色谱法等，其中D N A 电化学传感器是目前D N A 传感器中最成熟的一种，文献报道最多l I 由J。D N A 生物传感器是分子生物学与微电子学、电化学、光学等相结合的产物，它在生命科学与信息科学之间架起了道桥梁，成为D N A 信息分析检测最重要的技术之一，也是近几年迅速发展起来的一种全新的生物传感器，用于检测基因及一些与D N A 发生特殊相互作用的物质。D N A 检测技术不断提高，日臻完善，为D N A 传感器的建立提供了可能，由于它与传统的标记基因技术方法相比具有具有快速、灵敏、操作简便、选择性好、灵敏度高、测试费用低及抗干扰等优点，并具有分子识别、分离纯化基因等功能，已被广泛应用于研究D N A 的结构形态J、碱基序列【8 1、D N A 的损伤9，1 们、基因诊断【1 1,1 2】、病毒检测【1 3 1 及蛋白质链的分析【1 4】等诸多领域。1 1D N A 性质1 1 1D N A 组成基于共价目定法构筑D N A 生物传感器的研究D N A 是棱酸的一种，是大量脱氧桉昔瞍的聚台体。构成D N A 的基4、r 寸 是脱铽核精、核苷酸和磷酸，如崮1 1 核背酸碱基1：要囱四种：腺嘿吟fa d e n i n e AJ、胸腺嘧啶(t h y m i n eT)、鸟嵘呤Q,m a n i n eG)、胞嘧啶(c y t o s i n e C)，D N A 在碱塾组成上遵从C l m i r g a f f 规则，A1-T 的量相等，G 与C 的量相等，即碱基互补并日嘌岭的总数等于嘧啶的总数。D N A 是大分子聚物，D N A 溶液为高分子溶液具有很高的粘度。D N A对紫外线有吸收作削，与核酸娈性 J，吸光值丁卜高：当变性核麟叮复睢叫，吸光f|!又会恢复到原米水，卜湍度宵H l溶刺、酸碱度、尿素，酰脏等试剂*舯J Uq I 一陡D N A 分r。譬悱，f _ _】他甜D N|、般键I 刊的氢键断裂，烈螺旋 f，棚解川1 i2 D N A 结构D N A 是以4 种脱氧饭圩艘为基奉n 7 L 组成肿多聚臃f￥艘，脱能按球战川J 蛆址磷酸酯键相连接。脱瓴性苷酸山脱氧核枯、磷酸撤和碱J 3 仲J j 旦分f _|J 垃眦氧核耕是在2。位没有羟基的L 碳糖。碱基连接于脱氧坎帮的l 位磷酸牡圳生接于脱氧核糖的3 啦羟基或5。位羟基。构成D N A 分子的坫术单元的脱瓴核竹酸通过3。5。-磷酸二酯键相连形成D N A 分予。D N A 的结构分为一绒结构和空M 结构D N A 山多条脱瓴侈糟核t 件酸链 j _ j f 血，每条链均以磷酸基(磷酸酯键)为桥从个核什的3。琏拙到_ 1 邻枝拈的5。批斡：，这就足D N A 的一级结构。空阿结构义分为一绒结倚和二绒站构，苒巾级结恂就是由J a m e s W a t s o n 和F r a n c i s C r i c k 在1 9 5 3 年确定的D N A 的“皑性，m，它越现代生物学诞生的标志。D N A 舣蝶旋刍!i 构1 分稳定 要自：二种力餐来维结构的稳定：(1)互补碱基对之间的氢键；(2)碱基堆积力，它主要是由于芳香族碱基的电子之间相互作用而引起D N A 分子中的碱基层堆积，结果在D N A 分于内部形成一个疏水的核一I：O l y d r o p h o b i cc o r e)；(3)磷酸残基上的负电荷1o 介质中的刚离F之H J 形成的离子键。其中第一二种力是t 要结合力。在级结构的基础h，D N A 碰可扭曲或卷曲形成三级结构1 4 l。青岛科技大学研究生学位论文1 1 3D N A 变性与复性1 1 3 1D N A 变性D N A 受到某些理化因素的影响，使分子中的氢键、碱基堆积力等被破坏，双螺旋结构解体，分子由双链(d s D N A)变为单链(s s D N A)的过程称为变性。变性的实质是维持二级结构的作用力受到了破坏，即双螺旋破坏。但是D N A 的一级结构未变，即变性不引起共价键的断裂。引起变性的外部因素：加热、极端的p H、有机溶剂、尿素、甲酰胺等。它们都能破坏氢键、疏水键、碱基堆积力，从而破坏双螺旋。1 1 3 2D N A 复性D N A 的变性是可逆的，满足一定条件后，解丌的两条D N A 互补链又可以重新杂交后恢复双螺旋结构，并恢复相关的性质和生物功能。这个过程称为D N A复性。例如，对热变性的D N A 溶液，缓慢冷却，双螺旋又重新形成，之所以变性D N A 能够复性，是由于互补链的存在，且满足了复性条件，如复性温度、D N A浓度、溶液离子强度等。1 1 3 3D N A 复制1 9 5 3 年W a t s o n 和C r i c k 提出D N A 双螺旋结构模型指出，D N A 是由二条互补的脱氧核苷酸链组成，所以一条D N A 链上的核苷酸排列顺序是由双螺旋D N A的复制另一条决定的。这就说明D N A 的复制是由原来存在的分子为模板来合成新的链。曾经有过多种关于D N A 复制方式的学说，包括半保留复制，全保留复制以及分散复制。D N A 必须以自身分子为模板准确的复制成两个拷贝，并分配到两个子细胞中去，完成其遗传信息载体的使命。而D N A 的双链结构对于维持这类遗传物质的稳定性和复制的准确性都是极为重要的。D N A 复制过程：1 D N A 双螺旋的解旋(1)单链D N A 结合蛋白(s i n g l e m s t r a n d e dD N Ab i n d i n gp r o t e i n，s s b D N A 蛋白)(2)D N A 解链酶(D N Ah e l i c a s e)(3)D N A 解链2 冈崎片段与半不连续复制3 复制的引发和终止1 2 小分子化合物与D N A 的作用方式基丁共价固定法构筑D N A 生物传感器的研究小分子化合物与核酸结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖坏。D N A 分子中平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架和两条核苷酸链螺旋形成的大沟和小沟构成了有机小分子与D N A 相互结合的位点，作用的方式主要有共价结合、非共价结合、剪切作用三种类型。1 2 1 共价结合小分子与D N A 特定碱基作用形成加合物，使D N A 的双链解旋且发生弯曲。如苯并二吡咯类抗生素(d u o c a r m y c i n)及其衍生物只能在D N A 小沟中对A T 富集区识别，分子中活泼的环丙烷与小沟区内特定碱基序列中A 的N 3 共价结合后导致在该位点脱去嘌呤【I5 1。与非共价结合相比，小分子化合物与D N A 共价结合的序列特异性识别能力要强许多。1 2 2 非共价结合非共价结合包括静电结合、沟内结合和嵌插结合。另外还有氢键、离子键、范德华力、疏水键这些弱的相互作用。小分子通过沟内或嵌插结合在核酸的螺旋沟或碱基中，加上静电力的作用，常会诱发许多生物效应，阻碍核酸信息的币常表达。同时，这三种力还凭借氢键、范德华力、疏水作用等使相互作用加强。1，静电结合(e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g)，即小分子与D N A 分子的带负电荷的核糖磷酸基骨架之间通过静电作用而结合。该作用是非特异性的，通常认为单纯的静电结合模式在作为药物的应用上价值不大，但有些分子与D N A 的静电作用对其与D N A 间的嵌插作用起着重要的稳定作用。2，沟内结合(g r o o v eb i n d i n g)，即小分子与双链D N A 的大沟或小沟的碱基边缘直接发生相互作用。大沟区、小沟区在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上都有很大不同。小沟区般结合简单的芳香坏结构，如呋喃、毗咯、苯坏等，小分子与D N A 的小沟壁紧密作用，这是由于小沟区为A T 富集区，小分子通过与胸腺嘧啶基C 2 上的羰基氧(C=O)或腺嘌呤碱基N 3 上的氮形成氢键与A T碱基结合而且存在水合结构，具有芳香环结构的小分子易于自由扭转来适合小沟区，同时取代沟内的水分子进入小沟区，作用形式主要是氢键作用和范德华力。大分子蛋白质与D N A 在大沟结合。3，嵌插结合(i n t e r c a l a t i o nb i n d i n g)，即平面或几乎平面的芳香环嵌入D N A分子双螺旋的碱基对之间。结合的作用力来自芳环的离域7【体系与碱基的7 c 体系间形成的7 c 一兀相互作用及疏水相互作用。这种作用是药物分子与D N A 发生作用的重要形式之一。通常稠环芳香体系都倾向于结合在G C 富集区，而对于一些含有庞大取代基的分子，则使取代基尽量旋转，以保持与母环的共平面，从而形成4青岛科技大学研究生学位论文良好的堆积形状与D N A 碱基嵌合。当小分子嵌入D N A 碱基对后，有的可能抑制D N A 复制与转录的功能，有的则在经过进一步活化后使D N A 断裂受损而影响其功能。1 2 3 剪切作用具有剪切作用的分子特异选择结合位点，并最终使D N A 链断裂。博莱霉素f 6 1(B l e o m y c i n)是一种典型的D N A 切割化合物，分子结构的特殊性使其能够识别并结合在D N A 中5 -G C 37 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最终导致D N A断链，这种双功能性对于设计人工核酸酶及发展有效的抗肿瘤药物具有非常重要的指导意义。现在已有大量的研究根据这一原理把对D N A 具有剪切功能的分子与能对D N A 序列进行特异性识别的分子连接起来，以合成序列特异性更高的人工核酸酶或抗肿瘤药物。1 3D N A 与小分子作用的研究方法许多小分子与D N A 相互作用后不同程度地导致D N A 分子结构与功能的变化，进丽对D N A 的基因调控和表达功能产生影响由于一些小分子可以用作抗癌约物、核酸剪切剂、核酸结构探针以及作为杂交指示剂用于特定碱基序列基因的检测(1，2】，因此，研究生物小分子与D N A 之间的相互作用，在医学、药学及生物学等领域都具有十分重要的意义【1 7 J。在研究小分子和D N A 相互作用的过程中，表征手段和研究方法是获得可靠信息的关键。常用的分析方法主要有光谱法、电化学法、序列凝胶电泳及足印迹分析技术、X 射线晶体衍射分析法及粘度法等。l-3 1 电化学法电化学方法具有快速、灵敏、样品消耗量少和仪器简单等优点，其在D N A结构分析、药理分析、D N A 传感方面的应用越来越受到重视。由于生物体系是一个充满电解质溶液的体系，绝大多数反应都发生在膜系统的界面上，因而尽管存在许多物理和化学上的差异，电化学体系仍然是个非常好的生物体系模拟，是了解D N A 的理化性质的有效手段之一。D N A 电化学生物传感器是近几年发展的一种新生物传感器，它是进行核酸结构分析和检测的重要手段之一，其特点是测定快速、简便、灵敏、价廉。常用的电化学技术包括：循环伏安法和线性扫描伏安法f 1 8,1 9】；方波伏安法【2 0】；微分脉冲伏安法【2 I】；电位溶出伏安法【2 2 l；交流阻抗【2 3 l 等。B a r d 2 4 之7 1 等人系统研究了O s(b p y)3 2+、C o(b p y)3”、F e(b p y)3”、C o(p h e n)3”、F e(p h e n)s 3+等金属配合物和D N A 的相互作用后发现，若E o 向负方向移动，则小基于共价同定法构筑D N A 生物传感器的研究分子与D N A 发生静电作用；若E 0 向正方向移动，则小分子与D N A 发生嵌插作用，这也成为电化学法研究小分子和D N A 相互作用时的重要依据。彭图治【2 8-2 9 等人采用循环伏安法和计时库仑法等电化学手段研究了更生霉素、H o e s t3 3 2 5 8、米托蒽醌等小分子和D N A 的相互作用并推导出不可逆电活性分子与D N A 相互作用的电化学公式，可以便捷准确的计算D N A 与配体结合常数和结合位点信息。1 3 2 光谱法几乎所有的光谱学技术都可以用来研究小分子与D N A 的相互作用，其中紫外可见光谱、分子荧光光谱、圆二色谱、线二色谱是较为常用的方法。张，f：i 1 3(J l等人通过可见光谱法研究了亚甲基绿(M G)、亚甲基蓝(M B)与C T 2 D N A 的相互作用，并且研究了纳米材料胶体金对该识别作用的影响。1 3 3 序列凝胶电泳及足印迹分析技术序列凝胶电泳及足印迹分析技术是生物学中用来研究小分子与D N A 相互作用最基本的两种手段【3 1 1。凝胶电泳可以考察D N A 剪切或其它分子与D N A 螺旋共价结合留下的永久性痕迹，研究其它分子与D N A 作用的序列特异性；对于多数与D N A 发生非共价结合的分子来说，足印迹法及转录足印迹法是确定其结合位点的比较好的方法，其中转录阻断的方法更易判断序列特异性较高的药物结合位点。1 3 4X 射线晶体衍射分析法对于D N A 与小分子结合后所引起的结构变化，用X 射线晶体衍射分析(X R D)可提供直接的结合位点及结构变化的信息p 2 1，但需要提供小分子与D N A加和物的晶体。由于目前在培养小分子与D N A 加和物的晶体方面存在一定的困难，这方面的研究现在开展不多。另外，还存在晶体状态下的分子构型与其生理环境下的液相构型是否一致的问题1 3 3 1。1 3 5 其它方法原子力显微镜(A F M)和扫描隧道显微镜(S T M)可以直观的观察N d,分子与D N A 结合的方式，是人们研究小分子和D N A 相互作用的重要方法1 3 4】。微量热法、能量转移法等也是近几年来发展起来的无损分析法。总之，对于小分子化合物与D N A 相互作用的研究，仅用单一的方法是远远不能令人满意的，而应采取多种分析方法进行全方位、多层次的研究，以获得作6青岛科技大学研究生学位论文用结合方式、结合位点数、反应热力学、动力学数据等较为完备和可靠的结论。1 4D N A 电化学生物传感器的研究1 4。1D N A 电化学生物传感器的发展D N A 电化学生物传感器是9 0 年代的一个新的研究热点。是由一个支持D N A片段(I 郊D N A 探针)的电极和检测用的电活性杂交指示剂构成。它是将有反应活性的一单股寡核苷酸固定在某种支持物(感受器)上作为探针，它可以在含有复杂成分的环境下特异地识别出某一靶子底物，并通过换能装置把非电量生物信号转换为电信号。D N A 电化学传感器是一种全新的基因检测技术，它不仅具有分子识别及传感功能，而且还具有良好的分离纯化基因功能，因此在分子生物学和生物医学工程领域有很大的实际意义。D N A 电化学传感器受环境干扰小，电信号测量比较简单，不需要激光诱导或精密的分光器件等装置和仪器成本低等优点，但是D N A 电化学传感器的构筑也存在很多难点，其中D N A 探针的固定、杂交条件的选择和杂交指示剂是此类传感器的三大关键问题。1 4 2D N A 电化学生物传感器的原理D N A 传感器是当今生物传感器中的前沿性研究课题，力u 强对D N A 传感器的研究和应用开发具有重要的科学意义和应用价值【35 1。D N A 电化学生物传感器的出现使对目标D N A 的测量时间大大缩短，既可定性又可定量，且灵敏度高、选择性好，而且不会产生放射性标记的危险性，因此，近几年来受到了人们的广泛重视【j 引。D N A 电化学传感器是将长度为十几到几千个碱基不等的单链D N A(s s D N A)片段固定在电极表面形成D N A 探针，这种s s D N A 与目标D N A 呈碱基序列互补，在适当的温度、离子强度、p H、缓冲溶液等杂交条件下，探针s s D N A 与溶液中的靶基因发生特异性选择杂交，形成双链杂交D N A，从而导致电极表面结构的变化，变化的情况可通过电极表面电活性指示剂所引起电信号(O n 电压、电流或电导)的变化体现出来，进而可用于靶基因的定性定量分析【3 6 1。因此，应用D N A 电化学传感器进行检测，主要包括以下四个步骤I j 6 J：1，单链D N A 的固定，制成s s D N A 探针。2，分子杂交反应的完成，在最佳条件下形成d s D N A 杂交分子。3，选择合适的电化学指示剂完成d s D N A 的表达。4，杂交信号的电化学测量方法优化，根据所选择电化学指示剂的不同产生相应的电化学信号可将电流、电压或电导做为测定信号。基于共价固定法构筑D N A 生物传感器的研究D N A 电化学传感器根据信号转换方式的不同可以分为两类：一类是有标记的方法，另一类是无标记的方法。有标记的方法是与D N A 通过嵌插作用结合的氧化还原活性小分子的电信号的变化来区分s s D N A 和d s D N A。它是以电极为换能器，将一定长度(通常为十到几十个碱基)的单链D N A(s s D N A)片段固定到电极表面，形成D N A 探针，在一定条件下，这种D N A 探针上的s s D N A 与溶液中与之互补的靶D N A 发生特异的选择性杂交，杂交结果形成双链D N A(d s D N A)，这种转变是通过杂交指示剂所引起的电压、电流等电信号的变化体现出来，从而可对特定序列的靶基因进行定性定量检测。D N A 探针的筛选、固定以及杂交的指示是这类传感器的关键技术，研究小分子和D N A 的相互作用对于筛选合适的杂交指示剂具有重要的意义。1 4 3s s D N A 的固定化技术D N A 传感器涉及两个关键技术：一是有效地将D N A 探针在固体基质表面的固定技术；二是在传感器液相界面对于靶基因或靶标物质的测定技术。D N A 的固定技术是指将D N A 探针固定在特种载体物上并保持其与待测分子的特异性结合活性。常</p>