利用生物信息分析筛选脂代谢相关候选基因.pdf

第 卷第 期学报 年 月 :././.利用生物信息分析筛选脂代谢相关候选基因喻世刚王 钢廖 娟沈雪梅肖 成.川南地方品种鸡产业化四川省高等学校工程研究中心(乐山师范学院)四川 乐山.吉林省农科业学院吉林 公主岭 摘 要:通过公共数据平台提供的多种转录组测序数据筛选与脂代谢相关的候选基因 网站的 数据库中筛选与小鼠 脂肪细胞相关的三个测序数据取每组数据前 个差异表达基因作为本次实验数据集根据实验目的对两两组差异表达基因进行合并寻找共有基因得到脂代谢调控相关的候选基因并通过 实验进行验证 通过 网站提供的数据库找到了三个与小鼠 脂肪细胞分化相关的公共数据分别为、生物信息学合并分析发现大量基因参与 通路调控脂肪细胞分化其中 基因参与、胚胎干细胞分化同时在内脏脂肪组织中也有所表达 基因在、成纤维细胞以及胚胎干细胞分化过程中均有表达、等基因在 脂肪细胞整个分化过程中差异表达 结果显示上述基因在脂肪细胞分化过程中呈现显著变化可能作为调控脂肪代谢的候选基因 本研究为探索脂代谢提供新的候选基因同时也为了解人类肥胖、脂肪积累以及增加动物肌肉内脂肪含量提升肉质性状提供新的研究方向关键词:脂肪细胞肥胖测序数据脂代谢候选基因中图分类号:文献标志码:文章编号:()收稿日期:基金项目:四川省科技计划资助项目“沐川乌骨鸡肌内脂肪沉积功能基因的筛选与鉴定及分子遗传标记开发”()乐山市科技局项目“沐川乌骨黑鸡肌内脂肪沉积相关候选基因的筛选与鉴定”()乐山师范学院校级项目“/激活 信号通路影响乌骨鸡体内黑色素沉积的机制研究”()乐山师范学院校级项目“沐川乌骨黑鸡肌内脂肪沉积分子遗传调控机制的研究”()作者简介:喻世刚()男重庆永川人乐山师范学院生命科学学院副教授博士研究方向:家禽遗传育种与繁殖通信作者:王钢()男重庆綦江人教授硕士研究方向:动物疫病监测与防控、养殖业废弃物处理与利用:.引言随着人民生活水平的提高食品物质极大丰富城镇居民摄入大量消化不掉的热量导致肥胖逐年增加过度肥胖显著增加患有二型糖尿病的风险 已有大量研究表明过多的脂肪积累将会引起代谢综合征以及并发症如胰岛素抵抗、高血压、高血脂、心脏病以及神经性疾病等 因此了解脂肪积累机制对于降低肥胖导致的疾病非常重要 在畜牧领域提高肌肉内脂肪含量能够显著提升肉质 在我国地方动物品种(牛、羊、猪以及家禽)的产肉性能以及肉质性状与国外优秀品种还存在一定差距 我国每年需要大量进口高品质肉类来满足国内市场消费需求因此提高本地品种肉质性状、发展高品质畜牧业具有重要的意义 年中央一号文件就明确提出“打好种业翻身仗”的任务要求这给地方动物品种资源开发利用带来了契机 了解动物脂代谢过程、探索肌肉内脂肪积累调节机制对于培育具有知识产权的优秀产肉畜禽品种至关重要 近年来测序技术不断发展与普及公共数据库存在大量有用信息 由于试验目的与分析角度不同不同测序数据能够挖掘出相应有价值的信息资源 本文利用公共数据库筛选与 脂肪细胞分化相关的测序数据利用生物信息学与实验相结合方法寻找参与脂肪细胞分化调控的候选基因以期为后续动物肌内脂肪调控机制研究提供理论基础材料与方法.试验材料 细胞购自中国细胞库 脂肪细胞分化诱导剂、油红 染液来自 公司 培养基、双抗、缓冲液、胰蛋白酶、冻存液均来自 公司胎牛血清来自 生物公司无菌细胞培养板来自 公司 来自 公司异丙醇、氯仿来自北京化工厂双蒸水来自上海生工反转录试剂盒、购自 生物有限公司 引物由苏州金唯智生物科技有限公司提供 由罗氏(中国)公司提供.试验方法.测序数据筛选 网站(.)选择与 脂肪细胞分化相关的测序数据 筛选原则:)测序数据应自带分析程序()的数据优先这样可以降低处理数据的时间成本)根据简介选择与脂肪细胞分化以及 基因相关的测序数据这样能够确保所选择数据与本试验目的相关)分析测序数据库中样本分组情况选择符合自身试验需求以及具有一定科学合理性的分组形式确保获得的数据满足后续试验要求 获得目的数据库后选择前 个差异表达基因然后根据试验分组进行数据合并寻找具有潜力的候选基因.脂肪细胞培养及分化将购买的细胞从液氮拿出室温缓慢解冻避免细胞破裂 待含有细胞的冻存液充分溶化后离心机 离心 超净台中无菌移除冻存液 预热的完全培养液(含有 胎牛血清双抗的 培养基)重悬细胞移液器充分吹散细胞后转移到 培养皿中进培养培养箱温度为 浓度每 小时换完全培养液一次 待细胞长满培养皿后采用鸡尾酒法诱导细胞分化 胰岛素地塞米松以及 混合培养液作为诱导 液诱导细胞 小时换诱导液(含胰岛素的完全培养基)小时后换完全培养基 显微镜下观察细胞内部出现圆形脂滴后进行油红 染色用来验证成熟的脂肪细胞 油红 染色试验步骤按照说明书进行.脂肪细胞分化过程不同时期 提取 细胞为前体脂肪细胞可以在体外通过诱导分化成为成熟的脂肪细胞 因此采用 法提取前体脂肪细胞以及成熟脂肪细胞用来检测候选基因的表达差异 获得的细胞总 通过紫外分光光度计检测浓度琼脂糖凝胶电泳检测完整性然后采用反转录酶体外合成 反转录体系:反应条件:保存 双蒸水将 稀释 倍用于实时荧光定量 检测.引物设计根据 数据库提供的小鼠基因组序列对候选基因进行定量引物设计 ()、()、()、()、()、/()、()()、()、()、()、()以及内参基因 利用 软件设计实时荧光定量()引物序列(见表)体系为:()、上下游引物各.反应程序:共 个循环 每组试验重复 次 软件进行数据分析.数据分析每组试验重复 次数据以平均值标准差表示采用 软件作图利用 .软件对数据进行 检验或单因素方差分析显著性水平定为.极显著水平定为.表 定量基因引物序列基因引物序列片段大小()退火温度()用途:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:结果.确定测序数据筛选候选基因根据 试 验 方 法 描 述 的 筛 选 原 则 筛 选 了、和 三组不同的测序数据三组数据均与脂肪细胞分化及脂代谢相关 取三组数据前 差异表达基因作为数据集进行候选基因筛选 第一组数据进行韦恩图()合并发现 个基因在 细胞分化过程中与 基因相关全程参与脂肪细胞分化(图)它们分别为:、三组数据共有的差异表达基因为 以及 基因 从数据分析上看 基因参与 信号通路调节 细胞以及胚胎干细胞分化为脂肪细胞同时也在内脏脂肪组织中表达 基因在 细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞分化过程中表达图 差异表达基因韦恩()图分析.脂肪细胞培养与诱导为了检测候选基因在细胞中的表达情况对 细胞进行了体外诱导并采用油红 染色鉴定脂肪细胞是否诱导成功 如图 所示当细胞分化为成熟的脂肪细胞后细胞内部出现脂滴脂滴能够在油红 染色剂的作用下颜色变红而其他物质不受染色剂影响 因此本研究将 细胞成功诱导 图 细胞油红 染色注:图中红色点均为细胞内脂滴说明细胞分化成功.候选基因定量验证候选基因筛选是基于测序数据由计算机构建的模型计算出来具有一定的指导意义 但具体的基因表达变化仍需要通过细胞试验进行验证因此本试验采用 检测了 个候选基因在脂肪细胞分化前后的基因相对表达量 试验结果表明 个候选基因在脂肪细胞分化过程中均出现显著差异表达(.)表明筛选的候选基因与小鼠的脂肪细胞形成和分化密切相关(图)图 候选基因在细胞分化前后的定量检测讨论利用公共数据库筛选自己需要的数据集是进入一个相关研究领域较为快速的方法 探索脂代谢机制对于研究人类肥胖、提高家畜肉质性状等科学问题尤为重要 目前 细胞测序数据最多能够最大限度满足研究人员的需求 研究选择 细胞测序结果作为数据集筛选相关候选基因可以在其他物种上进行验证 虽然物种间存在差异但仍是一种快速、节省成本的方法 作者在本研究发现了多个可作为脂代谢相关的候选基因可为相关领域进一步研究提供一定参考补体因子()是一种脂肪酶目前相关研究表明 基 因 与 视 网 膜 疾 病 哮 喘 疾 病 相关 一些研究表明该基因与肥胖有关其中高脂肪饮食会触发 基因表达 基因能够促进羊脂肪的分解但其具体调控机制以及表达规律仍然不清楚 甘油 磷酸脱氢酶()是连接碳水化合物和脂质代谢的关键酶 有研究发现 缺失能够增强脂肪氧化有助于减少体重增加 与高甘油三酯血症相关是影响脂肪积累的重要基因 细胞死亡诱导 断裂因子 样效应因子()是一种脂滴相关蛋白促进细胞内三酰甘油的积累与胰岛素抵抗、酒精肝形成相关 蛋白在白色脂肪组织中表达并促进脂肪滴的形成 酰基辅酶 合成酶长链家族成员()是将长链脂肪酸转化为酰基辅酶 的主要酶 它可以通过 途径减少脂肪酸 氧化 从 而 增 加 甘 油 三 酯 水 平 脂 联 素()是脂肪细胞分泌的最重要的脂肪细胞因子之一较低的脂联素水平与代谢综合征、型糖尿病、胰岛素抵抗、心血管疾病和高血压有关脂联素及其受体与肥胖程度呈负相关已被确定为治疗肥胖的潜在治疗靶点/开关基因()最初是在诱导细胞周期的血单个核细胞中发现的 最广为人知的功能是其对限速脂解酶脂肪甘油三酯脂肪酶()的直接抑制能力 目前对该基因分子功能的相关研究较少具有较大研究潜力 蛋白磷酸酶 抑制剂蛋白 ()是一种有效的蛋白磷酸酶()抑制剂与肿瘤有关 该基因在 细胞中表达与脂肪生成有关 研究指出型糖尿病患者胰岛中 水平降低 乳糖神经酰胺唾液酸转移酶()与癌症发生有关 有研究发现 在脂肪血管细胞中表达肥胖、胰岛素抵抗患者的大网膜脂肪组织中 酶的增加 羟类固醇 脱氢酶()与高脂饮食和衰老相关高脂饮食通过增加 的肝脏 水平增加胰岛素分泌和促进肝脏脂质积聚加速小鼠肝脏的衰老 另外研究表明该基因在腹部脂肪组织中高表达与机体糖代谢异常和体脂分布相关过量基因()与内质网运输相关 羰基还原酶()是一种短链脱氢酶/还原酶家族的酶在酮和醛的药物代谢中起着关键作用上述 和 基因未有研究表明与脂肪代谢相关但在本研究细胞试验中发现其表达与脂肪细胞分化有关相关功能需要进一步验证 本文提供了与脂代谢相关的候选基因包括 、其中一些基因在脂代谢领域已有研究报道 例如 基因参与 信号通路调节 细胞以及胚胎干细胞分化为脂肪细胞同时也在内脏脂肪组织中表达 基因在 细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞分化过程中具有表达差异 然而这些基因具体的分子调控机制仍不清楚另外一些基因(和)在脂代谢领域未见报道这些候选基因仍有潜力继续挖掘其分子生物功能 本研究挖掘的脂代谢候选基因为探究脂代谢调控的分子机制提供了新的研究方向参考文献:.():.():.()():.():.():.():.():.():.():.():.():.().():.():.:/.():./.():.():.():.:.():./():.():.:.():.():.():.:.()():.():.:.:.():.():.():.(下转第 页).().:.(.)(.)(.).(./).(/)(./)(./).:【责任编辑:王兴全】(上接第 页)(.):.:【责任编辑:王兴全】